Elettroporazione di effettori batterici funzionali in cellule di mammifero

Riepilogo

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Abstract

Lo studio delle interazioni proteiche nel contesto di cellule viventi in grado di generare informazioni critiche sulla localizzazione, la dinamica, ei partner che interagiscono. Questa informazione è particolarmente importante nel contesto delle interazioni ospite-patogeno. Molte proteine ​​patogeni funzionano all'interno delle cellule ospiti in una varietà di modo come, consentendo l'evasione del sistema immunitario ospite e la sopravvivenza all'interno dell'ambiente intracellulare. Per studiare queste interazioni ospite-patogeno cellula di proteine, diversi approcci sono comunemente usati, tra cui: in infezione vivo con un ceppo che esprime una proteina tag o mutante, o l'introduzione di geni patogeni tramite trasfezione o trasduzione. Ciascuno di questi approcci ha vantaggi e svantaggi. Abbiamo cercato un mezzo per introdurre direttamente proteine ​​esogene in cellule. L'elettroporazione è comunemente utilizzato per introdurre acidi nucleici nelle cellule, ma è più raramente applicata alle proteine ​​anche se la base biofisico è esattamente la stessa.Un elettroporatore standard è stato utilizzato per introdurre effettori batterici affinità con tag nelle cellule di mammifero. Macrofagi epiteliali e mouse umani sono stati coltivati ​​con metodi tradizionali, indipendente, e collocati in 0,4 centimetri cuvette gap elettroporazione con esogeno proteine ​​patogeno batterico di interesse (ad esempio Salmonella Typhimurium GtgE). Dopo l'elettroporazione (0,3 kV) e una breve (4 ore) periodo di recupero, la proteina intracellulare è stata verificata mediante l'etichettatura fluorescente proteina tramite il suo tag affinità e di esaminare la distribuzione spaziale e temporale mediante microscopia confocale. La proteina elettroporate stato anche dimostrato di essere funzionale all'interno della cellula e capace di corretta traffico subcellulare e l'interazione proteina-proteina. Mentre le proteine ​​esogene tendevano ad accumularsi sulla superficie delle cellule, i campioni avevano elettroporate elevato aumento intracellulare concentrazione effettore rispetto alla sola incubazione. Il protocollo è semplice e abbastanza veloce da fare in apmoda arallel, permettendo la caratterizzazione high-throughput di proteine ​​patogeni in cellule ospiti tra cui il targeting e la funzione delle proteine ​​di virulenza subcellulare.

Introduzione

Molti batteri Gram-negativi impiegano sistemi di secrezione specializzati per iniettare proteine ​​di virulenza correlate (denominate effettori) direttamente nelle cellule ospiti ^1-5. Questi effettori hanno una vasta gamma di funzioni biologiche, tra cui: la soppressione di immunità dell'ospite, cambiamenti del citoscheletro, la modifica del traffico intracellulare e segnalazione, i cambiamenti trascrizionali, e le alterazioni del proteasoma ospite ^6-9. Le funzioni di alcuni effettori sono noti, tuttavia gli obiettivi host e azione biochimica (s) di molti altri rimane da determinare. Confrontando wild-type e infezioni batteriche ricombinanti è un valido approccio per studiare i meccanismi effettori di virulenza intracellulari, è spesso vantaggioso introdurre un individuo effettore nella cellula ospite. Così, metodi semplici per introdurre e caratterizzare proteine ​​batteriche effettrici nel contesto delle cellule ospiti è altamente desiderabile.

Semplificare l'analisi sperimentale wi° un singolo effettore è critica come altri effettori possono avere funzioni opposte o ridondanti. Per realizzare questa semplificazione, i ricercatori hanno già introdotto macromolecole nelle cellule da molti metodi diversi, tra cui trasduzione virale ^10, microiniezione ^11, raschiare il caricamento ^12,13, fusione cellulare con microiniezione indotta chimicamente ^14, proteine ​​proprietarie "transfezione" reagenti ^15, precipitazioni fosfato di calcio ^{16, 17-20} e elettroporazione. Le molecole introdotte vanno da acidi nucleici, tra cui specie DNA, RNA, e RNAi alle proteine, coloranti cellule impermeabili, e anticorpi per bersagli intracellulari ^21,22. Alcuni metodi hanno dei limiti, tra cui il tipo di macromolecola che può essere introdotta, e particolari analisi a valle possono essere limitate a causa dell'alta tossicità cellulare, meccanismi dannosi di azione, bassa efficacia, efficienza o l'introduzione. Transfection, un ofteMetodo n-utilizzata per esprimere geni batterici in cellule di mammifero, soffre anche la limitazione che alcuni tipi di cellule ospite rilevanti, come macrofagi e cellule primarie, sono particolarmente resistenti verso trasfezione. Oltre a ciò, è difficile controllare i livelli della proteina batterica realizzano su introduzione di DNA estraneo.

Molto lavoro ha stabilito l'elettroporazione di acidi nucleici nelle cellule sia batteriche e di mammifero come tecnica di laboratorio comune; tuttavia, non vi è la continua ricerca di metodi migliori per la consegna di proteine ​​in cellule in condizioni fisiologiche. Rapporti su proteine ​​trasfezione sono promettenti, ma richiedono reagenti costosi e l'ottimizzazione. Il desiderio di introdurre effettori batterici potenzialmente tossiche in un'ampia varietà di bersagli cellulari con un costo minimo ci ha portato a considerare elettroporazione come metodo per studiare queste proteine ​​in vivo.

Protein elettroporazione ^23-25 ​​è un conosciutoHOD introdurre proteine ​​in cellule viventi attraverso electropermeabilization, noto anche come elettro-trasfezione o elettro-iniezione ^26. Questa tecnica utilizza impulsi elettrici ad alta intensità per creare pori nelle membrane cellulari. Questi pori reversibili consentono macromolecole che sono normalmente esclusi dallo spazio intracellulare di entrare nella cellula. Alla rimozione del campo elettrico esterno, la membrana può sigillare, permettendo alla cellula di mantenere molecole che passano attraverso i pori ^27,28.

Un elettroporatore standard è stato utilizzato in questo studio per introdurre costantemente effettori batterici in entrambi i macrofagi di topo e cellule epiteliali umane. Il metodo è veloce, efficace e poco costoso, senza diminuzione apprezzabile vitalità cellulare. Le proteine ​​introdotte possono essere visualizzati tramite immunofluorescenza o utilizzati per test funzionali. Questo è stato dimostrato utilizzando proteina fluorescente verde (GFP) come standard non tossico, nonchédue proteine ​​effettrici Salmonella, SspH1 e GtgE. Proponiamo proteina elettroporazione come strumento aggiuntivo nel repertorio per lo studio delle proteine ​​di virulenza batterica e le loro funzioni in cellule ospiti eucariotiche.

Protocollo

1. Preparare in anticipo

1. Warm fosfato sterile salina tamponata (PBS) a 37 ° C.
2. Modifica del Warm Dulbecco di Eagle Medium (DMEM) e Minimal Essential Medium (MEM) addizionato con siero fetale bovino 10% (FBS), 100 IU / ml di penicillina, e 100 mg / ml di streptomicina a 37 ° C. Nota: Questi rappresentano la normale crescita media (NGM) per le cellule RAW e HeLa rispettivamente.

2. Preparazione di cellule

1. Crescere RAW 264.7 cellule al 70-90% di confluenza in NGM.
   1. Mantenere cellule a 37 ° C in un umidificata 95% aria / 5% di CO ₂ nell'atmosfera.
2. Crescere cellule HeLa al 70-90% di confluenza in NGM.
   1. Mantenere cellule a 37 ° C in un umidificata 95% aria / 5% di CO ₂ nell'atmosfera.
3. Prima raccolta, lavare le cellule una volta con PBS sterile.
4. Raccogliere cellule pre-confluenti in una provetta conica sterile.
   1. Raschiare delicatamente le cellule RAWcon un poliziotto di gomma in PBS, con pipettaggio ripetuto per disperdere aggregazioni cellulari.
   2. Staccare cellule HeLa con soluzione di tripsina 0,25% fino esame visivo mostra dissociazione dalla superficie cultura. Ad esempio, utilizzare 2 a 3 ml per un pallone T-75. Regolare il volume di conseguenza per garantire la soluzione tripsina copre tutta la superficie della crescita.
      1. Placare reazione di dissociazione con NGM contenente il 10% FBS.
      2. Utilizzare almeno il doppio del volume di NGM di tripsina, con pipettaggio ripetuto per disperdere aggregazioni cellulari.
5. Leggermente pellet cellule per centrifugazione a 900 g per 4 min.
6. Risospendere in stesso volume soluzione tripsina / raffreddamento con PBS sterile.
7. Contare le cellule utilizzando emocitometro o contatore di particelle.
8. Leggermente pellet cellule per centrifugazione a 900 g per 4 min.
9. Risospendere in adeguato volume di PBS per 5,5 x 10 ^6-6,0 x 10 ⁶ cellule / ml. Nota: Per esempio, un T-75 pallone produrrà approximdiatamente 7,5 x 10 ⁶ cellule ^29.
10. Tenere sospensione cellulare in ghiaccio fino elettroporazione.

3. Preparazione per elettroporazione

1. Cuvette pre-raffreddamento elettroporazione (0,4 centimetri gap) su ghiaccio.
2. Accendere apparecchi elettroporazione e impostare la tensione di 0,3 kV.
   NOTA: Capacità e resistenza non sono impostazioni regolabili sulla nostra elettroporatore (fissato al 10 uF e 600 Ω dal costruttore).
3. Riempire le piastre di recupero con NGM ed equilibrare in umidificata 95% di aria / 5% di CO ₂ nell'atmosfera a 37 ° C.

4. elettroporazione

1. Mettere 400 ml di sospensione cellulare in cuvetta pre-raffreddata e aggiungere 20 mg di proteina selezionato cuvetta (50 mcg / ml).
2. Flick cuvetta delicatamente ~ 10 volte per mescolare senza danneggiare le cellule. Nota: La cuvetta può anche essere invertita più volte per mescolare completamente, ma non pipettare su e giù o vortex per evitare di danneggiare le cellule.
3. Dry al di fuori della provetta con un tovagliolo di carta o altro tergicristallo per evitare formazione di archi elettrici in elettroporatore.
4. Campione elettroporazione a 0,3 kV per 1,5-1,7 msec. Nota: Questo era tipica per questo studio.
5. Subito dopo l'elettroporazione flick cuvetta delicatamente ~ 10 volte per mescolare accuratamente.

5. placcatura di Celle

1. Conservare provetta con cellule elettroporate in ghiaccio fino al momento di mettere in lastre di recupero.
2. Per la maggior parte delle analisi a valle, lavare le cellule 1x con NGM pre-riscaldato per rimuovere proteine ​​effettrici estranea.
   1. Rimuovere le cellule per l'analisi e sospendere in 3-5 ml di NGM.
   2. Agglomerare cellule per centrifugazione a 900 g per 4 min.
   3. Risospendere in un adeguato volume di NGM per dimensioni piatto desiderato (ad esempio 2 ml per piastra da 35 mm).
3. Rimuovere adeguata quantità di cellule per l'analisi a valle.
   1. Esempio 1: piastra in piatti di fondo in vetro per l'analisi al microscopio.
   2. Esempio 2: piastra into plastica coltura cellulare per l'analisi di proteine ​​come purificazioni affinità.
4. Consentono alle cellule di recuperare in lastre equilibrata in umidificata 95% di aria / 5% di CO ₂ nell'atmosfera a 37 ° C per almeno 4 ore.

6. Microscopia Analisi

6.1) Fissaggio / immunofluorescenza colorazione

1. Lavare le cellule 1x con PBS sterile dopo un periodo di recupero di 4 ore.
2. Fissare cellule in metanolo 100% per 2 minuti a temperatura ambiente. Utilizzare sufficiente metanolo per coprire completamente le cellule (ad esempio 2 ml per piastra da 35 mm).
3. Lavare 3x con PBS sterile.
4. Permeabilize cellule con 0,4% Triton X-100 in PBS per 15 min. Ad esempio, utilizzare 1 ml per una piastra di diametro 35 mm.
   1. Regolare la lunghezza di permeabilizzazione e la forza di Triton X-100 secondo epitopo e la posizione di proteina bersaglio. Nota: I migliori risultati dovranno essere determinati empiricamente per ogni target, ma le condizioni di cui sopra dovrebbero essere sufficienti per la maggior parte cobiettivi ytosolic.
5. Blocco con 5% Bovine Serum Albumin (BSA) in PBS per 1 ora a RT. Ad esempio, utilizzare 1 ml per una piastra di diametro 35 mm.
6. Lavare 3x con PBS.
7. Incubare anticorpo primario in soluzione legame anticorpale (0,1% Triton X-100 e 1% BSA in PBS) overnight a 4   ° C con dolce dondolio. Ad esempio, utilizzare 0,5 ml per una piastra diametro 35 mm.
   1. Seguire le raccomandazioni del produttore per la diluizione degli anticorpi. Nota: Ad esempio, l'anticorpo tag peptide streptavidina-binding (SBP-tag) è stato usato a 1: 1.000 diluizione, mentre l'anticorpo PKN1 stato usato in diluizione 1: 200.
8. Lavare 4x con PBS.
9. Incubare con adeguate anticorpo fluorescente coniugato secondario in soluzione vincolante anticorpi per 1 ora a temperatura ambiente, al riparo dalla luce.
   1. Ad esempio, utilizzare Alexa 488 o Alexa 647 per 1 ora a temperatura ambiente.
      1. Seguire le raccomandazioni del produttore per antdiluizione iBody. (Es circa 1: 1,000 per questo studio).
   2. Aggiungi altre macchie, se necessario, ad esempio, 5 micron di germe di grano agglutinnin (WGA) coniugato con Alexa 647 o DAPI accordo alle raccomandazioni del produttore, per 1 ora a temperatura ambiente.
10. Lavare 5x con PBS e conservare a 4 ° C, al riparo dalla luce fino al momento di immagine.

6.2) Microscopia Confocale e Image Analysis

1. Campioni di immagine su un microscopio confocale invertito con un obiettivo ad immersione 63x olio.
   1. Immagine canale verde utilizzando la linea 488 nm di un laser ad argon, con emissione di banda tra i 492-542 nm.
   2. Immagine canale rosso con un diodo laser 633 nm, con emissione di banda tra i 640-718 nm.
   3. Immagine canale blu utilizzando un diodo laser 405 nm, con emissione di banda tra i 407-453 nm.
   4. Garantire il canale più z-stacks coprono la totalità del volume cellulare.
2. Immagini di processo con un'adeguata software di elaborazione delle immagini.

7. Affinity Purification

1. Lavare le cellule elettroporate due volte con 4 ° C PBS dopo un periodo di recupero di 4 ore.
2. Lyse con ~ 1,0 ml di tampone di lisi (1% Triton X-100 con cocktail inibitore di proteasi e fosfatasi inibitore in PBS) su ghiaccio. Utilizzare inibitori secondo le istruzioni del produttore. Nota: Per esempio, sia gli inibitori delle proteasi e fosfatasi utilizzati in questo studio sono stati forniti a 100x, ma altre formulazioni dovrebbe funzionare altrettanto bene.
3. Prontamente raschiare le cellule con poliziotto in gomma e raccogliere in provette coniche.
4. Lyse con vortex vigorosa e ultrasuoni. Nota: Altri metodi di lisi può funzionare altrettanto bene, ma l'efficienza dovranno essere empiricamente determinato come l'idoneità dei requisiti di analisi.
   1. Sonicare 3 x 30 sec con vortex intermittente.
5. Centrifugare a 10.000 xg per 10 min a 4 ° C per raccoglieredetriti cellulari e aggregati insolubili; salvare il surnatante.
6. Combinare volumi uguali (~ 1,0 ml) di lisato cellulare elettroporate con 50 ml di sospensione di resina agarosio Streptavidin a 4 ° C per una notte con rotazione end-over-end. Nota: Questa resina cattura la proteina elettroporate (e complessi associati) attraverso il suo tag affinità peptide-streptavidina vincolante.
7. Centrifugare a 2.500 xg per 2 minuti e scartare il surnatante.
8. Lavare due volte con 40 volumi di letto (~ 1 ml) PBS.
9. Aggiungere 30 ml 4x LDS tampone di caricamento (141 mM Tris base, 2% LDS, 10% glicerolo, 0.51 mM EDTA, 0.22 mM SERVA Blu G, fenolo 0,175 mm Rosso, pH 8.5), 20 ml diH ₂ O, e 1 ml di 0,5 M tris (2-carbossietil) fosfina (TCEP), consentendo un certo volume per rimanere in perline.
10. Riscaldare a 95 ° C per 10 minuti e raffreddare su ghiaccio.
11. Spin> 10.000 xga 4 ° C per 5 min.
12. Raccogliere il surnatante.
13. Eseguire un Western Blot utilizzando anticorpi adeguati Nota: Sire, viene utilizzato l'anticorpo primario anti-PKN1.

Risultati

Come una prova iniziale di concept, la proteina fluorescente verde purificata è stato introdotto con successo in cellule di mammifero utilizzando elettroporazione. GFP, un approssimativo 27 kD proteina peso molecolare è comunemente introdotti in cellule di mammifero (normalmente espressi dal plasmide DNA) come strumento di biologia molecolare senza significative tossicità cellulare. Cellule HeLa sono state incubate (Figura 1A) o elettroporate (Figura 1B) con 25 mg / ml GFP, seguita d...

Discussione

Effettori secreti dai batteri patogeni si sono evoluti per funzionare nell'ambiente cellula ospite e quindi è utile per loro studiare in situ all'interno dell'ospite. Introduzione di effettori specifici di interesse nelle cellule ospiti permette pertinenti interazioni patogeno-ospite da studiare in isolamento senza interferenze da altre proteine ​​batteriche. L'obiettivo era di esplorare elettroporazione come un mezzo per introdurre le proteine ​​effettrici batteriche nelle cellule ospi...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Cellgro	25-050-Cl
0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes	Bio-Rad	165-2088
100% Methanol	Any	N/A	Flammable, Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter	Beckman Coulter	Model Z1
Cell Culture Incubator	Any	N/A	Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C
Cell Culture Plastic	Any	N/A	Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman
Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM)	Cellgro	10-013	Warm to 37 °C
Electroporator	Bio-Rad	E. coli Pulser
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-016-CV
Fluorescent confocal microscope	Ziess	Model  LSM 710
Glass Bottom Dishes for Microscopy	Wilco Wells	HBSt-3522
HALT Protease Inhibitor Cocktail	Pierce	78430	Corrosive, Toxic
HeLa Cell Line	ATCC	ATCC CCL-2
LDS 4X Loading Buffer	Invitrogen	NP0007
Minimal Essential Medium (MEM)	Cellgro	10-010	Warm to 37 °C
Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent	Any	N/A
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-Cl
RAW 264.7 Cell line	ATCC	TIB-71
Primary Antibody Against Target of Interest	Any	N/A
Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore	Any	N/A
Phosphate Buffered Saline	Any	N/A	Chill to 4 °C
Sterile Phosphate Buffered Saline	Any	N/A	Warm to 37 °C
[header]
Streptavidin Agarose Resin Suspension	Pierce	20353
Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred)	Any	N/A
TCEP	Sigma-Aldrich	646547	Corrosive, Toxic
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8585	Irritant, Toxic