Electroporation של effectors בקטריאלי פונקציונלי לתאי יונקים

Summary

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Abstract

המחקר של אינטראקציות חלבון בהקשר של תאי חיים יכול ליצור מידע קריטי על לוקליזציה, דינמיקה, ושותפים באינטראקציה. מידע זה הוא בעל ערך במיוחד בהקשר של אינטראקציות מארח הפתוגן. חלבוני הפתוגן רבים לתפקד בתוך תאי מארח במגוון רחב של דרך כגון, מה שמאפשר התחמקות ממערכת החיסון המארחת וההישרדות בסביבה תאית. ללמוד אינטראקציות מארח תאי הפתוגן-חלבון אלה, מספר גישות נמצאות בשימוש נפוץ, ובם: בזיהום vivo עם זן לבטא חלבון מתויג או מוטציה, או הקדמה של גני הפתוגן באמצעות transfection או התמרה. לכל אחת מהגישות הללו יש יתרונות וחסרונות. חפשנו אמצעי להציג ישירות חלבונים אקסוגניים לתאים. Electroporation משמשת בדרך כלל כדי להציג חומצות גרעין לתאים, אך הוחל חלבונים לעתים רחוקות יותר אם כי בסיס biophysical הוא בדיוק אותו הדבר.Electroporator סטנדרטי שימש להציג effectors חיידקי זיקה מתויגת לתאי יונקים. תאי אפיתל מקרופאג ועכבר אנושיים היו בתרבית בשיטות מסורתיות, מנותקים, והניחו בcuvettes electroporation פער 0.4 סנטימטר עם חלבון אקסוגני חיידקים פתוגנים של עניין (למשל סלמונלה Typhimurium GtgE). לאחר electroporation (0.3 קילו וולט) ותקופת החלמה (4 שעות) קצרה, חלבון תאיים אומת על ידי fluorescently תיוג החלבון באמצעות תג זיקתה ובחינת חלוקת מרחב ובזמן על ידי מיקרוסקופ confocal. חלבון electroporated הוצג גם להיות פונקציונלי בתוך התא ומסוגל סחר subcellular נכון ואינטראקציה בין חלבונים. בעוד החלבונים אקסוגניים נטו לצבור על פני השטח של התאים, היו לי דגימות electroporated עליות גדולות ביחסי ריכוז מפעיל תאיים לדגירה לבד. הפרוטוקול הוא פשוט ומהיר מספיק כדי להיעשות בapאופנת arallel, המאפשרת לאפיון תפוקה גבוה של חלבונים בתאי מארח הפתוגן כוללים מיקוד ותפקוד של חלבוני ארסיות subcellular.

Introduction

חיידקים גראם-שלילי רבים להעסיק מערכות הפרשה מיוחדות להזריק חלבונים הקשורים לאלימות (המכונים מפעילים) ישירות לתוך תאי מארח ^1-5. יש לי effectors אלה מגוון רחב של תפקודים ביולוגיים כוללים: דיכוי חסינות מארח, שינויי cytoskeletal, שינוי של סחר תאיים ואיתות, שינויי תעתיק, ושינויי פרוטאזום מארח ^6-9. הפונקציות של כמה effectors ידועות, עם זאת מטרות המארח ופעולה הביוכימית (ים) של רבים אחרים עדיין לא נקבעו. תוך השוואת wild-type וזיהומים חיידקיים רקומביננטי היא גישה תקפה ללמוד מנגנוני אלימות מפעיל תאיים, הוא לעתים קרובות יתרון להציג מפעיל בודד לתוך התא המארח. לפיכך, שיטות פשוטות להצגה ואפיון חלבוני מפעיל חיידקים בהקשר של תאי מארח רצויה מאוד.

פישוט wi הניתוח הניסיוניה מפעיל יחיד הוא קריטי כפי שאולי יש effectors אחרת פונקציות יריבה או מיותרות. כדי להשיג פישוט זה, חוקרים הציגו בעבר מקרו-מולקולות לתוך תאים על ידי שיטות רבות ושונות, כוללים התמרה ויראלית ^10, microinjection ^11, לגרד טעינת ^12,13, איחוי תאים עם microinjection המושרה כימי ^14, ריאגנטים חלבון קניינית "transfection" ^15, משקעי סידן זרחה ^16, וelectroporation ^17-20. המולקולות הציגו נעות בין חומצות גרעין כוללים מיני DNA, RNA, וRNAi לחלבונים, צבעי תא-חדיר, ונוגדנים למטרות תאיות ^21,22. יש כמה שיטות מגבלות כוללים הסוג של פולימר שיכול להיות מוצג, וניתוחים במורד הזרם מסוימים עשויים להיות מוגבלים בשל רעילות גבוהה סלולרית, מנגנונים מזיקים של פעולה, יעילות נמוכה, או יעילות מבוא. Transfection, often שימוש בשיטה לביטוי גנים של חיידקים בתאי יונקים, סובל גם המגבלה שכמה סוגי תאי מארח רלוונטיים, כגון מקרופאגים ותאים ראשוניים, הם עמידים במיוחד לקראת transfection. מעבר לכך, קשה לשלוט ברמות של חלבון חיידקים המיוצר על כניסתה של דנ"א זר.

יש הרבה עבודה שהוקמה electroporation של חומצות גרעין לשני תאי החיידקים ויונקים כטכניקת מעבדה משותפת; עם זאת, יש מחקר מתמשך לשיטות הטובות ביותר לאספקת חלבונים לתאים בתנאים פיסיולוגיים. דיווחים על transfection חלבון מבטיחים, אך דורשים חומרים כימיים ואופטימיזציה יקרים. הרצון להציג effectors חיידקים שעלולים להיות רעיל למגוון רחב של יעדי תא עם עלות מינימאלית הוביל אותנו לשקול electroporation כשיטה ללימוד חלבונים אלה in vivo.

electroporation החלבון ^23-25 ​​הוא נפגשהוד להציג חלבונים לתאים חיים באמצעות electropermeabilization, הידוע גם באלקטרו-transfection או אלקטרו-הזרקת ^26. טכניקה זו משתמשת פולסים חשמליים בעוצמה גבוהה כדי ליצור נקבוביות בקרום תא. נקבוביות הפיכים אלה מאפשרים מקרומולקולות כי הם בדרך כלל לא נכללו מהחלל תאית להיכנס לתא. לאחר ההסרה של השדה החשמלי החיצוני, הקרום יכול לחתום מחדש, המאפשר לתא כדי לשמור על מולקולות שעברו דרך הנקבוביות ^27,28.

Electroporator סטנדרטי שימש במחקר זה כדי להציג באופן עקבי effectors חיידקים לשני תאים כמו מקרופאג-עכבר ותאי האפיתל אנושיים. השיטה היא מהירה, יעילה, ולא יקר, ללא ירידה משמעותית בכדאיות סלולרית. ניתן דמיינו חלבונים הציגו באמצעות מיקרוסקופיה immunofluorescence או משמשים למבחנים פונקציונליים. זה הודגם באמצעות חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) כסטנדרט שאינו רעיל, כמו גםשני חלבוני סלמונלה מפעיל, SspH1 וGtgE. אנו מציעים electroporation חלבון ככלי נוסף ברפרטואר לחקר חלבוני ארסיות חיידקים ואת תפקידיהם בתאי מארח אוקריוטים.

Protocol

1. להכין מראש

1. מי מלח חם פוספט סטרילי שנאגרו (PBS) עד 37 מעלות צלזיוס.
2. השינוי של Dulbecco החם של נשרים בינוניים (DMEM) והמינימאלי חיוני בינוני (MEM) בתוספת סרום 10% שור עוברי (FBS), 100 IU / פניצילין מיליליטר, ו -100 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין ל -37 מעלות צלזיוס. הערה: אלה מייצגים רגיל צמיחת מדיה (NGM) לתאי RAW והלה בהתאמה.

2. הכנת תאים

1. לגדול 264.7 תאי RAW לconfluency 70-90% בNGM.
   1. שמור על תאים על 37 מעלות צלזיוס באוויר / 5% CO אווירת humidified 95% _2.
2. לגדל תאי הלה לconfluency 70-90% בNGM.
   1. שמור על תאים על 37 מעלות צלזיוס באוויר / 5% CO אווירת humidified 95% _2.
3. לפני האיסוף, לשטוף monolayer תא פעם אחת עם PBS סטרילי.
4. איסוף תאים טרום-ומחוברות בצינור חרוטי סטרילי.
   1. בעדינות לגרד תאי RAWעם שוטר גומי בPBS, עם pipetting חזר לפיזור מצבורי תא.
   2. ניתוק תאי הלה עם 0.25% פתרון טריפסין עד בדיקה חזותית מציגה ניתוק ממשטח התרבות. לדוגמא, השתמש 2-3 מיליליטר לבקבוק T-75. להתאים את עוצמת קול בהתאם כדי להבטיח פתרון טריפסין מכסה שטח גידול כולו.
      1. להרוות את תגובת ניתוק עם NGM המכיל 10% FBS.
      2. השתמש לפחות פעמיים הנפח של NGM לטריפסין, עם pipetting חזר לפיזור מצבורי תא.
5. קל גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 900 XG למשך 4 דקות.
6. Resuspend באותו נפח כפתרון טריפסין / להרוות באמצעות PBS סטרילי.
7. ספירת תאים באמצעות hemocytometer או מונה חלקיקים.
8. קל גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 900 XG למשך 4 דקות.
9. Resuspend בנפח מספק של PBS ל5.5 x 10 x ⁶ 6.0 10 ⁶ תאים / מיליליטר. הערה: לדוגמא, T-75 בקבוק אחד יניב approximately 7.5 x 10 ⁶ תאים ^29.
10. שמור השעיה תא על קרח עד electroporation.

3. הכנה לElectroporation

1. cuvettes טרום צמרמורת electroporation (פער של 0.4 סנטימטרים) על קרח.
2. הפעל מנגנון electroporation ולהגדיר את המתח 0.3 וולט.
   הערה: קיבוליות והתנגדות לא היו הגדרות להתאמה על electroporator שלנו (על 10 μF ו -600 Ω על ידי היצרן).
3. מלא צלחות התאוששות עם NGM ולאזן באווירת CO אוויר / 5% humidified 95% ₂ ב 37 ° C.

4. Electroporation

1. הנח 400 μl של השעיה תא קובט טרום צונן ולהוסיף 20 מיקרוגרם של חלבון שנבחר לקובט (50 מיקרוגרם / מיליליטר).
2. קובט פליק בעדינות ~ 10 פעמים כדי לערבב ללא פגיעה בתאים. הערה: קובט גם יכול להיות הפוך מספר פעמים ולמערבב היטב, אבל לא pipet למעלה ולמטה או מערבולת כדי למנוע נזק לתאים.
3. מחוץ יבש של קובט עם מגבת נייר או מגב אחר כדי למנוע קשתית חשמלי בelectroporator.
4. מדגם electroporate על 0.3 קילו וולט עבור 1.5-1.7 msec. הערה: זה היה אופייני למחקר זה.
5. מייד לאחר קובט הקפיצי electroporation בעדינות ~ 10 פעמים כדי לערבב ביסודיות.

5. ציפוי של תאים

1. קובט חנות עם תאי electroporated על קרח עד מוכן למקום בצלחות התאוששות.
2. עבור רוב הניתוחים במורד הזרם, לשטוף תאי 1X עם NGM מראש חימם כדי להסיר חלבון מפעיל זר.
   1. הסרת תאים לניתוח ולהשעות ב3-5 מיליליטר של NGM.
   2. גלולה תאים על ידי צנטריפוגה ב 900 XG למשך 4 דקות.
   3. Resuspend בנפח מספק של NGM לגודל רצוי צלחת (למשל 2 מיליליטר למנה 35 מ"מ).
3. הסר כמות מתאימה של תאים לניתוח במורד הזרם.
   1. דוגמא 1: צלחת לתוך מנות תחתית כוס לניתוח מיקרוסקופי.
   2. דוגמא 2: int צלחתo פלסטיק תרבית תאים לניתוח חלבונים כגון purifications זיקה.
4. לאפשר לתאים להתאושש בצלחות equilibrated באווירת CO אוויר / 5% -95% humidified ₂ ב 37 מעלות צלזיוס במשך לפחות 4 שעות.

6. מיקרוסקופית ניתוח

6.1) קיבוע / Immunofluorescence מכתים

1. לשטוף את תאי 1X עם PBS סטרילי לאחר תקופת החלמה 4 שעות.
2. תקן תאים במתנול 100% עבור 2 דקות בטמפרטורת חדר. השתמש מספיק כדי לכסות את תאי מתנול (למשל 2 מיליליטר במשך 35 צלחת מ"מ) לחלוטין.
3. 3x לשטוף עם PBS סטרילי.
4. Permeabilize תאים עם 0.4% Triton X-100 ב PBS במשך 15 דקות. לדוגמא, השתמש 1 מיליליטר לצלחת בקוטר 35 מ"מ.
   1. התאם אורך של permeabilization וכוחו של טריטון X-100 על פי epitope ומיקום חלבון המטרה של. הערה: התוצאות הטובות ביותר צריכה להיקבע באופן אמפירי לכל יעד, אולם התנאים הנ"ל צריכים להיות מספיק עבור רוב גמטרות ytosolic.
5. לחסום עם 5% הסרום אלבומין שור (BSA) בPBS עבור שעה 1 ב RT. לדוגמא, השתמש 1 מיליליטר לצלחת בקוטר 35 מ"מ.
6. 3x לשטוף עם PBS.
7. דגירה נוגדן ראשוני בפתרון מחייב נוגדנים (0.1% Triton X-100 ו 1% BSA PBS) הלילה ב 4   ° C עם נדנדה עדינה. לדוגמא, השתמש 0.5 מיליליטר לצלחת בקוטר 35 מ"מ.
   1. עקוב אחר המלצות יצרן לדילול נוגדן. הערה: לדוגמא, נוגדן תג פפטיד מחייב streptavidin (SBP-תג) שימש בשעה 1: 1,000 דילול, ואילו נוגדני PKN1 שימשו בשעה 1: 200 דילול.
8. לשטוף 4x עם PBS.
9. דגירה עם נוגדנים מתאימים fluorescently מצומדות משניים בפתרון מחייב נוגדן עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר, מוגן מפני אור.
   1. לדוגמא, השתמש Alexa 488 או 647 Alexa עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
      1. עקוב אחר המלצות יצרן לנמלהדילול ibody. (למשל על 1: 1,000 למחקר זה).
   2. להוסיף כתמים אחרים לפי צורך, למשל, agglutinnin נבט חיטה 5 מיקרומטר (WGA) מוצמד לAlexa 647 או DAPI בהתאם להמלצת יצרן, עבור שעה 1 בטמפרטורת חדר.
10. לשטוף 5x עם PBS ולאחסן ב 4 ° C, מוגן מפני אור עד מוכן לתמונה.

6.2) ניתוח תמונת Confocal מיקרוסקופית ו

1. דגימות תמונה במיקרוסקופ confocal הפוכה באמצעות מטרת 63x טבילת שמן.
   1. ערוץ תמונה ירוק באמצעות השורה של 488nm לייזר ארגון, עם פליטת רוחב פס בין 492-542 ננומטר.
   2. ערוץ תמונה אדום באמצעות לייזר דיודה 633 ננומטר, עם פליטת רוחב פס בין 640-718 ננומטר.
   3. ערוץ תמונה כחול באמצעות לייזר דיודה 405 ננומטר, עם פליטת רוחב פס בין 407-453 ננומטר.
   4. ודא ערוץ מרובה Z- ערימות לכסות את מכלול הנפח הסלולרי.
2. תמונות תהליך עם תוכנת עיבוד תמונה מתאימה.

טיהור 7. זיקה

1. שטוף תאי electroporated פעמיים עם 4 ° C PBS לאחר תקופת החלמה 4 שעות.
2. Lyse עם ~ 1.0 מיליליטר של חיץ תמוגה (1% Triton X-100 עם מעכבי פרוטאז קוקטייל ומעכב phosphatase בPBS) על קרח. השתמש במעכבים בהתאם להוראות יצרן. הערה: לדוגמא, שני מעכבי פרוטאז phosphatase ושמשו במחקר זה סופקו ב100x, אבל ניסוחים אחרים צריכים לעבוד באותה מידה.
3. מייד לגרד תאים עם שוטר גומי ולאסוף לתוך צינורות חרוטי.
4. Lyse ידי vortexing וsonication הנמרצים. הערה: שיטות תמוגה אחרות יכולות לעבוד באותה המידה גם, אבל יעילות תצטרך להיקבע באופן אמפירי לגבי ההתאמה של דרישות assay.
   1. Sonicate 3 x 30 שניות עם vortexing לסירוגין.
5. צנטריפוגה ב10,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C כדי לאסוףפסולת סלולרית ואגרגטים מסיסים; להציל את supernatant.
6. לשלב כמויות שווה (~ 1.0 מיליליטר) של lysate תא electroporated עם 50 μl של השעיה שרף agarose streptavidin על 4 מעלות צלזיוס לילה עם רוטציה הסוף-על-קצה. הערה: שרף זה לוכד את חלבון electroporated (ומתחמים כלולים) באמצעות תג זיקתה מחייב streptavidin פפטיד.
7. צנטריפוגה ב 2500 XG למשך 2 דקות וזורקי supernatant.
8. לשטוף פעמיים עם 40 כרכי מיטה (~ 1 מיליליטר) PBS.
9. הוסף 30 μl חיץ טעינת 4x LDS (141 מ"מ טריס בסיס, 2% LDS, גליצרול 10%, 0.51 mM EDTA, 0.22 מ"מ Serva Blue G, פנול 0.175 מ"מ אדום, pH 8.5), 20 μl diH ₂ O, ו1 μl של phosphine 0.5 M טריס (2-carboxyethyl) (TCEP), המאפשר לכמה נפח להישאר בחרוזים.
10. חום על 95 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ומגניבים על קרח.
11. ספין> 10,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 5 דקות.
12. איסוף supernatant.
13. לבצע כתם מערבי באמצעות נוגדנים מתאימים שימו לב: הואמחדש, משמש נוגדן ראשוני אנטי-PKN1.

תוצאות

כהוכחה ראשונית של מושג, חלבון פלואורסצנטי ירוק מטוהר הוצג בהצלחה בתאים יונקים באמצעות electroporation. GFP, 27 KD משוער חלבון משקל מולקולרי הוא הציג בדרך כלל לתאי יונקים (בדרך כלל באו לידי ביטוי מפלסמיד דנ"א) ככלי ביולוגיה מולקולרי ללא רעילות תאית משמעותית. תאי הלה הודגרו

Discussion

effectors מופרש מחיידקים פתוגניים התפתחה כדי לתפקד בסביבת התא המארח, ולכן כדאי ללמוד אותם באתרו בתוך הפונדקאי. מבוא של effectors הספציפי של עניין לתאי מארח מאפשר אינטראקציות הפתוגן-המארח הרלוונטי כדי להיחקר בבידוד ללא הפרעות מחלבונים חיידק אחרים. המטרה הייתה לחקור electrop...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Cellgro	25-050-Cl
0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes	Bio-Rad	165-2088
100% Methanol	Any	N/A	Flammable, Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter	Beckman Coulter	Model Z1
Cell Culture Incubator	Any	N/A	Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C
Cell Culture Plastic	Any	N/A	Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman
Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM)	Cellgro	10-013	Warm to 37 °C
Electroporator	Bio-Rad	E. coli Pulser
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-016-CV
Fluorescent confocal microscope	Ziess	Model  LSM 710
Glass Bottom Dishes for Microscopy	Wilco Wells	HBSt-3522
HALT Protease Inhibitor Cocktail	Pierce	78430	Corrosive, Toxic
HeLa Cell Line	ATCC	ATCC CCL-2
LDS 4X Loading Buffer	Invitrogen	NP0007
Minimal Essential Medium (MEM)	Cellgro	10-010	Warm to 37 °C
Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent	Any	N/A
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-Cl
RAW 264.7 Cell line	ATCC	TIB-71
Primary Antibody Against Target of Interest	Any	N/A
Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore	Any	N/A
Phosphate Buffered Saline	Any	N/A	Chill to 4 °C
Sterile Phosphate Buffered Saline	Any	N/A	Warm to 37 °C
[header]
Streptavidin Agarose Resin Suspension	Pierce	20353
Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred)	Any	N/A
TCEP	Sigma-Aldrich	646547	Corrosive, Toxic
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8585	Irritant, Toxic