A electroporação de efectores bacterianos funcionais em células de mamíferos

Resumo

Electroporation was used to insert purified bacterial virulence effector proteins directly into living eukaryotic cells. Protein localization was monitored by confocal immunofluorescence microscopy. This method allows for studies on trafficking, function, and protein-protein interactions using active exogenous proteins, avoiding the need for heterologous expression in eukaryotic cells.

Resumo

O estudo das interações proteína no contexto de células vivas podem gerar informações importantes sobre a localização, dinâmica e parceiros interagem. Esta informação é particularmente valiosa no contexto das interacções hospedeiro-agente patogénico. Muitas proteínas de agentes patogénicos funcionar dentro das células hospedeiras na forma de uma variedade tais como, permitindo a evasão do sistema imunitário do hospedeiro e a sobrevivência no ambiente intracelular. Para estudar essas interações célula-hospedeiro de patógenos em proteínas, diversas abordagens são comumente usados, incluindo: infecção in vivo com uma estirpe que expressa uma proteína marcada ou mutante, ou a introdução de genes de patógenos via transfecção ou transdução. Cada uma destas abordagens tem vantagens e desvantagens. Buscamos um meio para introduzir directamente proteínas exógenas nas células. A electroporação é geralmente utilizado para introduzir ácidos nucleicos em células, mas foi mais raramente aplicado a proteínas, embora a base biofísica é exactamente o mesmo.Um electroporador padrão foi utilizada para introduzir efectores bacterianas de afinidade marcado com em células de mamífero. Macrófagos epiteliais e mouse Humanos foram cultivados pelos métodos tradicionais, individual, e colocados em 0,4 centímetros cuvetes gap eletroporação com uma proteína exógena bacteriana patógeno de interesse (por exemplo, Salmonella Typhimurium GTGE). Após a eletroporação (0,3 kV) e um curto período de recuperação (4 horas), proteína intracelular foi verificada por fluorescently rotulando a proteína através da sua marca de afinidade e examinar a distribuição espacial e temporal por microscopia confocal. A proteína também electroporação mostrou ser funcional no interior da célula e capaz de tráfico subcelular correcta e interacção proteína-proteína. Enquanto as proteínas exógenas tendia a acumular-se sobre a superfície das células, as amostras electroporadas teve grandes aumentos na concentração intracelular de efector em relação à incubação sozinho. O protocolo é simples e rápido o suficiente para ser feito em apmoda arallel, permitindo a caracterização de alta taxa de transferência de proteínas de patógenos em células hospedeiras incluindo segmentação e função das proteínas de virulência subcelular.

Introdução

Muitas bactérias Gram-negativas empregam sistemas de secreção especializados para injetar proteínas relacionadas à virulência (referidas como efetores) diretamente nas células hospedeiras ^1-5. Estes efectores têm uma ampla gama de funções biológicas, incluindo: supressão da imunidade do hospedeiro, alterações do citoesqueleto, a modificação do tráfico intracelular e de sinalização, alterações da transcrição, e as alterações de proteassoma hospedeiro ^6-9. As funções de alguns efectores são conhecidos, no entanto, os alvos do hospedeiro e de acção bioquímica (s) de muitos outros permanece a ser determinada. Ao se comparar o tipo selvagem e infecções bacterianas recombinantes é uma aproximação válida para estudar os mecanismos de virulência efector intracelular, é muitas vezes vantajoso para introduzir um indivíduo efectora na célula hospedeira. Assim, os métodos simples para a introdução e caracterização de proteínas efectoras bacterianas no contexto de células hospedeiras é altamente desejável.

Simplificar o wi análise experimentalth um único efetor é crítica como outros efetores podem ter funções opostas ou redundantes. Para realizar esta simplificação, os pesquisadores já introduziu macromoléculas em células por muitos métodos diferentes, incluindo a transdução viral ^10, microinjeção ^11, raspar o carregamento ^12,13, fusão celular com microinjeção induzido quimicamente ^14, proteína proprietária "transfecção" reagentes ^15, precipitações de fosfato de cálcio ^{16, 17-20} e electroporação. As moléculas introduzidas variam de ácidos nucleicos, incluindo as espécies de ADN, ARN, e proteínas de ARNi a, corantes de células-impermeável, e anticorpos para alvos intracelulares ^21,22. Alguns métodos têm limitações, incluindo o tipo de macromoléculas que podem ser introduzidas, e em particular análises a jusante pode ser limitada devido à elevada toxicidade celular, prejudiciais mecanismos de acção, a baixa eficácia, ou eficiência de introdução. A transfecção, uma oftemétodo de n-utilizado para a expressão de genes bacterianos em células de mamífero, também sofre da limitação de que alguns tipos de células hospedeiras relevantes, tais como macrófagos e células primárias, são particularmente resistentes às transfecção. Além disso, é difícil controlar os níveis de proteína bacteriana produzida após a introdução de ADN estranho.

Muito trabalho estabeleceu eletroporação de ácidos nucleicos em ambas as células bacterianas e de mamíferos como uma técnica de laboratório comum; no entanto, há investigação em curso sobre os melhores métodos para a entrega de proteínas nas células sob condições fisiológicas. Relatórios sobre a transfecção de proteína são promissores, mas requerem reagentes e otimização caros. O desejo de introduzir efectores bacterianas potencialmente tóxicos em uma grande variedade de alvos celulares com um custo mínimo nos levou a considerar electroporação como um método para o estudo destas proteínas in vivo.

Electroporação é uma proteína de ^23-25 ​​method para introduzir as proteínas em células vivas através electropermeabilization, também conhecidos como electro-transfecção ou electro-injeção ^26. Esta técnica utiliza-alta intensidade impulsos eléctricos para criar poros em membranas celulares. Estes poros reversíveis permitir macromoléculas que são normalmente excluídos do espaço intracelular para entrar na célula. Após a remoção do campo eléctrico externo, a membrana pode selar novamente, permitindo que a célula de reter moléculas que passaram pelos poros ^27,28.

Um electroporador padrão foi utilizada neste estudo para introduzir consistentemente efectores bacterianas em ambas as células tipo macrófagos do rato e as células epiteliais humanas. O método é rápido, eficiente e barato, sem redução apreciável na viabilidade celular. As proteínas podem ser introduzidos visualizado por microscopia de imunofluorescência ou utilizadas para ensaios funcionais. Isto foi demonstrado utilizando a proteína fluorescente verde (GFP) como um padrão não-tóxicos, bem comoduas proteínas efectoras Salmonella, SspH1 e GTGE. Propomos electroporação proteína como uma ferramenta adicional para o repertório para o estudo de proteínas de virulência da bactéria e das suas funções em células hospedeiras eucarióticas.

Protocolo

1. Prepare-se com antecedência

1. Quente fosfato estéril salina tamponada (PBS) a 37 ° C.
2. Modificação de Dulbecco quente de Meio de Eagle (DMEM) e Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino (FBS), 100 UI / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina a 37 ° C. Nota: Estes representam crescimento normal de mídia (NGM) para as células RAW e HeLa, respectivamente.

2. Preparação de Células

1. Crescer 264.7 RAW para 70-90% de confluência em NGM.
   1. Manter as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 95% de ar / 5% de _CO2.
2. Cultivar células HeLa a 70-90% de confluência em NGM.
   1. Manter as células a 37 ° C numa atmosfera humidificada com 95% de ar / 5% de _CO2.
3. Antes da coleta, lave monocamada de células uma vez com PBS estéril.
4. Recolher as células pré-confluentes num tubo cónico estéril.
   1. Raspe suavemente as células RAWcom um policia de borracha em PBS, com pipetagem repetida para dispersar agregados de células.
   2. Separar as células HeLa com solução de tripsina a 0,25% até que o exame visual mostra a dissociação a partir da superfície de cultura. Por exemplo, uso de 2 a 3 ml de um frasco T-75. Ajustar o volume da solução em conformidade para assegurar tripsina cobre toda a superfície de crescimento.
      1. Extingue-se reacção com dissociação NGM contendo 10% de FBS.
      2. Use pelo menos duas vezes o volume de NGM a tripsina, com pipetagem repetida para dispersar agregações celulares.
5. Levemente peletizar as células por centrifugação a 900 xg durante 4 min.
6. Ressuspender em volume igual solução de tripsina / têmpera usando PBS estéril.
7. Contagem de células usando hemocitômetro ou contador de partículas.
8. Levemente peletizar as células por centrifugação a 900 xg durante 4 min.
9. Ressuspender em volume adequado de PBS para 5,5 x 10 ^6-6,0 x 10 ⁶ células / ml. Nota: Por exemplo, um frasco de T-75 irá produzir aproximdamente 7,5 x 10 ⁶ células ^29.
10. Mantenha suspensão de células em gelo até eletroporação.

3. Preparação para electroporação

1. Cuvetes Pré-chill eletroporação (0,4 centímetros de folga) em gelo.
2. Ligue aparelho de eletroporação e definir a tensão de 0,3 kV.
   NOTA: capacitância e resistência não eram configurações ajustáveis ​​em nosso electroporator (fixado em 10 iF e 600 Ω pelo fabricante).
3. Encha com placas de recuperação NGM e equilibrar em humidificada de 95% ar / 5% de _CO2 a 37 ° C.

4. Eletroporação

1. Colocar 400 mL da suspensão de células em cuvetes de pré-gelada e adiciona-se 20 ug de proteína seleccionada a cuvete (50 ug / ml).
2. Flick tina suavemente ~ 10 vezes para misturar sem danificar as células. Nota: A cuvete pode também ser invertida diversas vezes para misturar bem, mas não pipetar para cima e para baixo ou de vórtice, para evitar danificar as células.
3. fora seco de tina com toalha de papel ou outro limpador de para evitar a formação de arco elétrico no electroporator.
4. Amostra electroporate a 0,3 kV para 1,5-1,7 ms. Nota: Isso era típico para este estudo.
5. Imediatamente após a eletroporação filme tina suavemente ~ 10 vezes para misturar bem.

5. chapeamento de Células

1. Tina loja com células eletroporados no gelo até que esteja pronto para colocar em placas de recuperação.
2. Para a maioria das análises a jusante, lave as células 1x com NGM pré-aquecido para remover a proteína estranha efectora.
   1. Remover as células para análise e suspender em 3-5 ml de NGM.
   2. Peletizar as células por centrifugação a 900 xg durante 4 min.
   3. Ressuspender em volume adequado de NGM para o tamanho da placa desejada (por exemplo 2 ml para 35 milímetros prato).
3. Remover quantidade adequada de células para análise de downstream.
   1. Exemplo 1: placa em pratos com fundo de vidro para análise de microscopia.
   2. Exemplo 2: placa into plástico de cultura de células para análise de proteínas, tais como purificação por afinidade.
4. Permitir que as células em placas de recuperar humidificada equilibrada em 95% de ar / 5% de _CO2 a 37 ° C durante pelo menos 4 horas.

6. Análise de Microscopia

6.1) Fixação / técnica de imunofluorescência

1. Lave as células 1x com PBS estéril após o período de recuperação de 4 horas.
2. Fix células em 100% de metanol durante 2 minutos à temperatura ambiente. Use metanol suficiente para cobrir completamente as células (por exemplo, 2 ml para 35 milímetros prato).
3. Lavar 3x com PBS estéril.
4. Permeabilizar as células com 0,4% de Triton X-100 em PBS durante 15 min. Por exemplo, utilizar 1 ml para uma placa de diâmetro de 35 mm.
   1. Ajustar o comprimento de permeabilização e força de Triton X-100 de acordo com epitopo e localização da proteína alvo. Nota: Os melhores resultados terá de ser determinado empiricamente para cada alvo, no entanto, as condições acima mencionadas, deve ser adequada para a maioria cmetas ytosolic.
5. Bloco com 5% Albumina de Soro Bovino (BSA) em PBS durante 1 h à TA. Por exemplo, utilizar 1 ml para uma placa de diâmetro de 35 mm.
6. Lavar 3x com PBS.
7. Incubar anticorpo primário em solução de ligação do anticorpo (0,1% de Triton X-100 e 1% de BSA em PBS) durante a noite a 4   ° C com agitação suave. Por exemplo, usar 0,5 ml para uma placa de diâmetro de 35 mm.
   1. Siga as recomendações do fabricante para a diluição do anticorpo. Nota: Por exemplo, o anticorpo marcador peptídico de ligação a estreptavidina (SBP-tag) foi utilizado a 1: 1000 de diluição, enquanto que o anticorpo PKN1 foi utilizado a 1: 200 de diluição.
8. Lavar 4x com PBS.
9. Incubar com anticorpo secundário conjugado com fluorescência apropriado em solução de ligação do anticorpo durante 1 hora à temperatura ambiente, protegida da luz.
   1. Por exemplo, usar Alexa 488 ou Alexa 647, durante 1 h à temperatura ambiente.
      1. Siga as recomendações do fabricante para a formigadiluição ibody. (Por exemplo, cerca de 1: 1000 para este estudo).
   2. Adicionar outras manchas, conforme necessário, por exemplo, 5 uM de gérmen de trigo agglutinnin (WGA) conjugada com Alexa 647 ou DAPI de acordo com a recomendação do fabricante, durante 1 hora à temperatura ambiente.
10. Wash 5x com PBS e armazenar a 4 ° C, protegido da luz até que esteja pronto para a imagem.

6.2) microscopia confocal e Análise de Imagem

1. Amostras de imagem em um microscópio confocal invertido utilizando uma objectiva de imersão em óleo de 63x.
   1. Imagem canal verde usando a linha de 488 nm de um laser de argônio, com emissão de largura de banda entre 492-542 nm.
   2. Imagem canal vermelho usando um laser de diodo 633 nm, com emissão de largura de banda entre 640-718 nm.
   3. Imagem do canal de azul usando um laser de diodo 405 nm, com emissão de largura de banda entre 407-453 nm.
   4. Assegurar o canal múltiplo z pilhas cobrir a totalidade do volume celular.
2. Processar imagens com o software de processamento de imagem apropriado.

7. Affinity Purificação

1. Lave as células eletroporados duas vezes com 4 ° C PBS após o período de recuperação de 4 horas.
2. Lise com ~ 1,0 ml de tampão de lise (1% Triton X-100 com um cocktail inibidor de protease e inibidores de fosfatase em PBS) em gelo. Use inibidores de acordo com as instruções do fabricante. Nota: Por exemplo, ambos os inibidores da protease e da fosfatase utilizados neste estudo foram fornecidas a 100x, mas outras formulações deve funcionar igualmente bem.
3. Prontamente raspar células com polícia de borracha e recolher em tubos cônicos.
4. Lise por vórtice vigoroso e sonicação. Nota: Outros métodos de lise pode funcionar igualmente bem, mas a eficiência será necessário ser empiricamente determinada como a adequação dos requisitos do ensaio.
   1. Sonicar 3 x 30 segundos com agitação em vórtex intermitente.
5. Centrifugar a 10.000 xg durante 10 min a 4 ° C para recolheros detritos celulares e agregados insolúveis; salvar o sobrenadante.
6. Combinar volumes iguais (~ 1,0 ml) de lisado de células electroporadas com 50 ul de suspensão de estreptavidina resina de agarose a 4 ° C durante a noite com uma rotação de extremidade sobre extremidade. Nota: Esta resina captura a proteína electroporadas (e complexos associados), através do seu péptido marcador de afinidade de ligação a estreptavidina.
7. Centrifugar a 2.500 xg por 2 min e elimine o sobrenadante.
8. Lavar duas vezes com 40 volumes de leito (~ 1 ml de PBS).
9. Adicionar 30 ul de tampão de carga 4x LDS (141 mM de base Tris, 2% de LDS, 10% glicerol, 0,51 mM de EDTA, 0,22 mM de L SERVA azul, vermelho de fenol 0,175 mM, pH 8,5), 20 ul dih ₂ O, e 1 ul de 0,5 M de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP), permitindo um certo volume para permanecer em grânulos.
10. Aquece-se a 95 ° C durante 10 min e arrefecer em gelo.
11. Rotação> 10.000 xg, a 4 ° C durante 5 min.
12. Recolher o sobrenadante.
13. Realizar um western blot utilizando anticorpos apropriados Nota: Elere, anti-PKN1 anticorpo primário é usado.

Resultados

Como um teste de conceito, a proteína fluorescente verde purificada foi introduzida com sucesso em células de mamíferos utilizando eletroporação. GFP, um valor aproximado de 27 kD, uma proteína de peso molecular é geralmente introduzido nas células de mamífero (normalmente expressos a partir de ADN de plasmídeo), como uma ferramenta de biologia molecular, sem toxicidade celular significativa. As células HeLa foram incubadas (Figura 1A) ou electroporação (Figura 1B) com 25 u...

Discussão

Efectores secretadas a partir de bactérias patogénicas evoluíram a funcionar dentro do ambiente da célula hospedeira e, assim, é útil para estudá-los in situ dentro do hospedeiro. Introdução de efetores específicos de interesse em células hospedeiras permite a interação patógeno-hospedeiro relevantes a serem estudados de forma isolada, sem a interferência de outras proteínas bacterianas. O objectivo foi o de explorar a electroporação como um meio para introduzir proteínas efectoras bacteriana...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25% Trypsin-EDTA Solution	Cellgro	25-050-Cl
0.4 cm Gap-disposable electroporation cuvettes	Bio-Rad	165-2088
100% Methanol	Any	N/A	Flammable, Toxic
Bovine Serum Albumin (BSA)	Sigma-Aldrich	A4919
Cell Counting Apparatus - Hemocytometer or Coulter Counter	Beckman Coulter	Model Z1
Cell Culture Incubator	Any	N/A	Humidified 95% air/5% CO2 atmosphere at 37 °C
Cell Culture Plastic	Any	N/A	Cell culture flasks/plates, pipets, tubes, rubber policeman
Dulbecco's Modification of Eagle’s Medium (DMEM)	Cellgro	10-013	Warm to 37 °C
Electroporator	Bio-Rad	E. coli Pulser
Fetal Bovine Serum (FBS)	Cellgro	35-016-CV
Fluorescent confocal microscope	Ziess	Model  LSM 710
Glass Bottom Dishes for Microscopy	Wilco Wells	HBSt-3522
HALT Protease Inhibitor Cocktail	Pierce	78430	Corrosive, Toxic
HeLa Cell Line	ATCC	ATCC CCL-2
LDS 4X Loading Buffer	Invitrogen	NP0007
Minimal Essential Medium (MEM)	Cellgro	10-010	Warm to 37 °C
Other fluorescent stains (WGA, DAPI) in conjunction with anti-fade reagent	Any	N/A
Penicillin/Streptomycin	Cellgro	30-002-Cl
RAW 264.7 Cell line	ATCC	TIB-71
Primary Antibody Against Target of Interest	Any	N/A
Secondary Antibody Conjugated to Fluorophore	Any	N/A
Phosphate Buffered Saline	Any	N/A	Chill to 4 °C
Sterile Phosphate Buffered Saline	Any	N/A	Warm to 37 °C
[header]
Streptavidin Agarose Resin Suspension	Pierce	20353
Table Top Centrifuge Capable of Accepting Conical Tubes (swinging bucket preferred)	Any	N/A
TCEP	Sigma-Aldrich	646547	Corrosive, Toxic
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8585	Irritant, Toxic