نموذج الجلد ماوس الجنين من إصلاح الجرح Scarless

Summary

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Abstract

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Introduction

جروح الجلد الجنين تلتئم بسرعة وscarlessly حتى وقت متأخر من الحمل ^1. يتميز الجنين إصلاح الجرح scarless التي كتبها تجديد العمارة الأنسجة الطبيعية وظيفة. الانتقال من scarless الى ظهور ندوب النمط الظاهري يحدث في الثلث الثالث من الحمل في البشر وحول يوم الجنينية 18 (E18) في الفئران ^2،3. وبالمقارنة مع الكبار، وتتميز إصلاح الجرح الجنين قبل الاندمال بتشكل النسيج الظهاري السريع، وترسب النسيج الضام، والهجرة الخلايا الليفية.

وعرضت العديد من الدراسات التفسيرات المحتملة لظاهرة scarless التئام الجروح أثناء التطور الجنيني المبكر. التهاب هو عنصر أساسي للإصلاح الجرح البالغين. ومع ذلك، وتتميز الجروح الجنين بسبب عدم وجود التهاب حاد ^4. إذا كان هذا هو نتيجة لعدم النضج الوظيفي لجهاز المناعة خلال مراحل الجنين لا يزال غير واضح. اقترحت دراسة حديثة أن الخلافات في وفرة، وحصيرةurity، ووظيفة الخلايا البدينة في E15 E18 مقابل الجلد الجنين قد تكون مسؤولة عن الانتقال من النمط الظاهري scarless، على الأقل في الماوس ^3. دراسات أخرى يفترض أن الاختلافات في خصائص وفرة من الضامة الجرح الجنين وتعليم الكبار هي المسؤولة عن إعادة تشكيل المصفوفة خارج الخلية العادية (ECM) خلال إصلاح الجرح الجنين ^5.

قد تؤثر الاختلافات في العوامل البيئية أثناء التطور الجنيني والكبار أيضا إصلاح الجرح. أظهر Longaker وزملاؤه أن السائل الجرح من الجنين يمتلك مستويات عالية من النشاط تحفيز حمض الهيالورونيك مقارنة مع لا شيء في الكبار الجرح السائل ^6. ونتيجة لذلك، مستويات أعلى من حمض الهيالورونيك، وهو جلايكان أن يعزز المكروية مواتية لحركية الخلية والانتشار، في بيئة الجرح الجنين قد تكون مسؤولة عن النمط الظاهري scarless ينظر أثناء التطور الجنيني المبكر. خطوط أخرى من نقطة دليل على حقيقة أن الفيتاالبيئة ل الجرح هي hypoxemic نسبيا وغارقة في السائل الذي يحيط بالجنين معقم غنية عوامل النمو ^7. ومع ذلك، فقد تم تقديم أي إجابة شافية لحدث بالغ الأهمية أو عامل خلال مرحلة التطور الجنيني الذي يقوم بتشغيل الانتقال من تجديد scarless لإصلاح متليفة.

فهم الآليات المسؤولة عن الشفاء scarless في الجنين يتطلب نموذجا دقيقا وقابلة للتكرار. نحن هنا التفاصيل نموذجا استنساخه من الجنين scarless التئام الجروح في ظهر E16.5 (scarless) والأجنة E18.5 (تندب) الماوس. بالإضافة إلى ذلك، اختلافات طفيفة من هذا النموذج يمكن استخدامها لتنفيذ عدد من إجراء المزيد من الدراسات، مثل تحليل التعبير الجيني للجروح الجنين ^و8،9 الجلد. وبالنظر إلى أن الحمل توقيتها بدقة بالغة الأهمية بالنسبة لخلاصة الناجح لهذا الجنين scarless الجرح نموذج الشفاء، ونحن أيضا بالتفصيل بروتوكول لدينا لفرط الإباضة توقيت الحمل.

Protocol

ملاحظة: يتم تنفيذ كافة الإجراءات الموضحة في هذه الورقة وفقا للمبادئ التوجيهية التي وضعتها لوحة الإدارية ستانفورد على رعاية الحيوان المعملية (APLAC).

1. موقوت الحمل - تقنية فرط الإباضة (الشكل 1)

ملاحظة: بالضبط توقيت عمر الحمل من أجنة الفئران لجراحة الجنين في E16.5 وE18.5 هي ذات أهمية حاسمة. في هذا القسم ونحن بالتفصيل بروتوكول لدينا لتوقيت الحمل الماوس باستخدام الأفراس الحوامل المصل (PMS) وموجهة الغدد التناسلية المشيمية البشرية (HCG) الحقن للحث على فرط الإباضة.

1. حقن الفئران الإناث (<5 في قفص) داخل الصفاق (IP) مع 3،0-5،0 وحدة دولية (IU) من PMS في حجم 100 ميكرولتر PBS 1:00 حتي 03:00 ليوم 1.
2. بين 12:00 و 14:00 من يوم 3 (خمسة وأربعين إلى 47 ساعة بعد الحقن PMS)، حقن الفئران الإناث IP مع 3،0-5،0 وحدة دولية من HCG في حجم 100 ميكرولتر PBS.
   ملاحظة: الحث حقن HCG التبويض ما يقرب من 12 ساعة بعد الحقن.
3. بعد الحقن HCG على الفور، تتزاوج الإناث مع الذكور الذين تتراوح أعمارهم بين 8-16 أسابيع.
   ملاحظة: نحن عادة وضع أنثيين في قفص من الذكور الفردية.
4. الإناث منفصلة عن الذكور في صباح يوم 4 (6:00 حتي 10:00) وسجل على الجنين E0.5 العمر.
   ملاحظة: يمكن التحقق من المقابس المهبلية في هذا الوقت. ومع ذلك، فإن المراقبة من المكونات المهبلي لا يضمن الحمل، ويمكن أن الإناث تصبح حاملا عندما لوحظ عدم وجود المكونات. وبالنظر إلى أن الحمل يمكن ملاحظته عادة عن طريق التفتيش البصري و / أو الجس في سن الحمل وE16.5 E18.5، التحقق من وجود المقابس المهبلية في صباح يوم 4 ليس من الضروري بدقة. في تجربتنا، واعتمادا على سلالة، ما يقرب من 30-50٪ من الإناث-مبيض فائقة تصبح الحوامل باستخدام تقنية الموضحة هنا.

خريج "/>
الشكل 1. تخطيطي لفرط الإباضة تقنية. الإجراء عرض تخطيطي لفرط الإباضة توقيت الحمل في الفئران. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

2. الفئران الجنين الجراحة (الظهرية إصابة) على E16.5 وE18.5 الأجنة (الشكل 2)

1. قبل الإجراء، وتنظيف جميع الأسطح من غرفة العمليات والمعدات مع 70٪ ايزوبروبيل. وبالإضافة إلى ذلك، وتعقيم جميع اللوازم والأدوات الجراحية التي سيتم استخدامها في إجراء التعقيم لهم. بعض المؤسسات قد تسمح استخدامه لاحقا من حبة تعقيم الساخن. لكل عملية، استخدم حزم العقيمة التي تشمل الشاش والأدوات الجراحية.
2. لحث التخدير في الأمهات الحوامل (الجنين E16.5 العمر أو E18.5) أقل من 2.5٪ خليط الأيزوفلورين / الأكسجين في 2 L لكل دقيقة تليها التخدير الصيانة في 1 L لكل دقيقة.
3. ليخدعالتخدير السليم ثابت، وضمان يتم منع ردود الفعل دواسة عميقة من الفأرة ووضع الماوس في وضعية الانبطاح.
4. تطبيق مرهم للعين طبيب بيطري مثل Puralube لمنع تهيج العين أو جفاف أثناء العملية.
5. إعداد البطن بالإدارة تطبيق خفيفة من كريم مزيل الشعر لمدة لا تزيد عن 30 ثانية (الشكل 2A).
6. إعداد البطن لجراحة العقيم مع بوفيدون اليود والكحول (الشكل 2B و2C).
7. أداء خط الوسط البطن تحت المجهر باستخدام مقص المجهرية (الشكل 2D و 2E).
8. فضح بلطف الرحم والجنين اختيار لعملية جراحية (الشكل 2F).
9. ري الجراحي الميداني مع دافئ (38 درجة مئوية) الفوسفات مخزنة المالحة (PBS) باستخدام إبرة حادة طرف
   ملاحظة: واحد يمكن أن يتم عن طريق الانحناء بعناية غيض من إبرة كبيرة الجوف. (الشكل 2G و 2H).
10. وضع الجنين بطريقة تسمحليالي الوصول الكامل إلى ظهر.
11. تمرير غرزة سلسلة محفظة باستخدام النايلون 7-0 خياطة من خلال الرحم التي تغمر موقع المقصود الظهرية جرح (الشكل 2I). سلسلة موقف مال أكثر من منطقة ظهر إلى اليسار أو اليمين من الحبل الشوكي، وفي منطقة جدار الرحم خال من الأوعية الدموية الكبيرة.
12. جعل 3 مم شق من خلال جدار الرحم والكيس الذي يحيط بالجنين في وسط سلسلة محفظة (الشكل 2J).
13. ري موقع شق مع دافئ (38 درجة مئوية) في برنامج تلفزيوني.
14. باستخدام مقص المجهرية، وقطع الجرح استئصالية كامل سمك واحد، ما يقرب من 1 ملم في الطول، في ظهر الجنين.
15. بلطف موقع شق لطخة تجف مع القطن طرف قضيب.
16. ضخ 3 ميكرولتر حجم الهند تحت الجلد الحبر في موقع الجرح للاحتفال موقع الجرح (الشكل 2K).
17. ري مع دافئ (38 درجة مئوية) في برنامج تلفزيوني لضمان تم الاحتفاظ الحبر داخل الجرح.
18. هل لديك الجراحي مساعد طnject دافئ (38 درجة مئوية) PBS من خلال صريحا طرف G 10 حقنة في الكيس السلوي كسلسلة محفظة مغلق (الشكل 2L). التراجع عن حقنة للإقفال سلسلة محفظة تقترب من الانتهاء (الشكل 2M).
19. العودة بلطف الرحم في تجويف البطن (الشكل 2N).
20. إيفرت الجلد أو الغشاء البريتوني.
21. وقد مساعد الجراحية لري تجويف البطن مع دافئ (38 درجة مئوية) في برنامج تلفزيوني.
22. وثيق البطن بسرعة عن طريق تدبيس الجلد أو الغشاء البريتوني مغلق (الشكل 2O). يتم تنفيذ إغلاق قياسي في طبقتين. البريتوني وعضلات البطن في طبقة واحدة، الأنسجة تحت الجلد والجلد في الطبقة الثانية. للتضحية وحصاد الجنين فورا، وتبين مظاهرة لدينا الإغلاق في طبقة واحدة.
23. وضع الحيوان تحت الملاحظة في حاضنة دافئة وضعت في 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة أو حتى الحيوان يستعيد وعيه كافية للحفاظ على الاستلقاء القصية.
24. لا متقاعدجرة الحيوان للشركة من الحيوانات الأخرى حتى أنه قد تعافى تماما من الإجراء.
25. على الاستيقاظ من التخدير وخلال ال 48 ساعة اللاحقة، إدارة حقن تحت الجلد البوبرينورفين (0.05 ملغ / كلغ) كل 12 ساعة لتسكين حسب الحاجة على أساس تقييم الألم. إدارة كاربروفين (5 ملغ / كلغ) عن طريق الحقن تحت الجلد لإضافية لتخفيف الآلام بعد العمليات الجراحية حسب الحاجة.
26. العودة إلى قفص الحيوانات وتزويدهم بالمال وبالشهرة أيضا الطعام والماء الإعلانية.
27. مراقبة عن كثب بحثا عن مظاهر الألم.
28. 48 ساعة بعد الجراحة، وتضحية الأم الحامل مع جرعة زائدة من الأيزوفلورين والحصاد الجرحى الجنين. من أجل القيام بذلك، وضبط تركيز الأيزوفلورين إلى 5٪ أو أعلى والحفاظ على التعرض لمدة 1 دقيقة بعد التوقف عن التنفس. تأكيد القتل الرحيم مع خلع عنق الرحم. حصاد الجنين المعافين من أجل السيطرة العمر المتطابقة. وينبغي أن يكون الأجنة أواخر طريقة منفصل القتل الرحيم يتفق مع توصيات IACUC، مثل ديالرؤوس، خلع عنق الرحم، أو الحقن الكيميائي.

الشكل 2. تخطيطي لجراحة الفئران الجنين. الخطوات العامة لالظهرية اصابة في E16.5 وأجنة الفئران E18.5. (A) إزالة الشعر من الماوس البطن. (B و C) إعداد الماوس البطن. (D) المجاهر المستخدمة في العمليات الجراحية الإجراء. (E) خط الوسط البطن. (F) تعرض الرحم. (G) إنشاء حادة طرف الإبرة. (H) الري الرحم مع المياه المالحة الدافئة. (I) إنشاء سلسلة محفظة خياطة. (J) شق من خلال الرحم جدار و1 ملم الجيل الجرح استئصالية سمك الكامل. (K) الحقن تحت الجلد من الهند الحبر. (L و M) اختتام سلسلة محفظة خياطة. (N و O)إغلاق البطن. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.

النتائج

لتحليل نسيجية، والجروح الجلدية في الجلد الظهري من E16.5 وE18.5 أجنة الفئران يجب حصاد 48 ساعة بعد إصابة، ثابتة في 4٪ PFA، وجزءا لا يتجزأ من البارافين. في النماذج المعدلة وراثيا الفلورسنت، والحفظ بالتبريد مع أكتوبر قد يكون مناسبا. هناك العديد من البقع التي يمكن استخدامها لتصو?...

Discussion

بروتوكول الجراحية المقدمة هنا يصف نموذج استئصالية من الجنين الشفاء scarless الفئران نشرت لأول مرة في عام 2006 من قبل لدينا مختبر ^10. بالإضافة إلى نماذج أخرى أنشئت من جرح استئصالية ^11، ونماذج الجراحي من الجنين الفئران scarless الشفاء موجودة فضلا ^12،13. تم الإبلاغ ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-O MONOSOF Suture	eSuture	SN-1647G
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650916
Micro-scissors	Kent Scientific	INS600127
Autoclip 9 mm	Texas Scientific Instruments	205060
Insulin Syringe	Thermo Fisher Scientific	22-272-382
Black Pigment	AIMS	242
BD Safety-Lok 3 ml Syringe	BD Biosciences	309596
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-049
OPMI-MD Surgical Microscope	Carl Zeiss Surgical Inc
Pregnant Mares Serum (PMS)	Millipore	367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG)	Sigma-Aldrich	CG10
Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415
Nair (depilatory cream)	Church and Dwight Co.	22600267058