Un Mouse fetale Modello Skin of Wound Repair scarless

Riepilogo

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Abstract

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Introduzione

Ferite cutanee fetali guariscono rapidamente e scarlessly fino a tardi in gestazione ^1. Fetal riparazione della ferita scarless è caratterizzata dalla rigenerazione di architettura tessuto normale e la funzione. Il passaggio da un scarless a cicatrici fenotipo avviene nel terzo trimestre di gravidanza negli esseri umani e in tutto il giorno embrionale 18 (E18) in topi ^2,3. In confronto ad adulto, riparazione della ferita fetale è caratterizzata da una rapida riepitelizzazione, la deposizione di tessuto connettivo, e la migrazione dei fibroblasti.

Molti studi hanno offerto possibili spiegazioni per il fenomeno di scarless guarigione delle ferite durante le prime fasi dello sviluppo fetale. L'infiammazione è una componente fondamentale di riparazione adulti ferita; Tuttavia, ferite fetali sono caratterizzati da una mancanza di infiammazione acuta ^4. Se questa è una conseguenza della immaturità funzionale del sistema immunitario durante fasi fetale rimane chiaro. Uno studio recente ha suggerito che le differenze di abbondanza, tappetourity, e la funzione dei mastociti in E15 vs. E18 cute fetale possono essere responsabili per il passaggio da un fenotipo scarless, almeno nel topo ^3. Altri studi ipotizzano che le differenze nelle proprietà e abbondanza di macrofagi ferite fetali e adulti sono responsabili per la riforma della matrice extracellulare normale (ECM) durante ferita fetale riparazione ^5.

Le differenze nei fattori ambientali durante lo sviluppo fetale e adulti possono anche interessare la riparazione delle ferite. Longaker e colleghi hanno dimostrato che il fluido ferita dal feto possiede alti livelli di attività acido ialuronico stimolante rispetto a nessuno in adulti ferita fluido ^6. Di conseguenza, i livelli elevati di acido ialuronico, un glicosaminoglicano che promuove un microambiente favorevole alla motilità e proliferazione cellulare, nell'ambiente della ferita fetale possono essere responsabili del fenotipo scarless visto durante precoce sviluppo fetale. Altre linee di punto prova al fatto che la fetaambiente l ferita è relativamente ipossiemico e sommersa in sterile liquido amniotico ricco di fattori di crescita ^7. Tuttavia, nessuna risposta definitiva è stata fornita per un evento critico o fattore durante l'embriogenesi che innesca la transizione dalla rigenerazione scarless a riparazione fibrotica.

La comprensione dei meccanismi responsabili per la guarigione scarless nel feto richiede un modello preciso e riproducibile. Qui i dettagli di un modello riproducibile di fetale scarless guarigione delle ferite nel dorso di E16.5 (scarless) ed embrioni E18.5 (cicatrici) del mouse. Inoltre, variazioni minori di questo modello può essere utilizzato per eseguire una serie di ulteriori studi, come l'analisi di espressione genica di ferite fetali e ^8,9 pelle. Dato che le gravidanze a tempo proprio sono fondamentali per il successo della ricapitolazione questo scarless ferita modello guarigione fetale, abbiamo anche dettagliato il nostro protocollo superovulazione cronometrato gravidanze.

Protocollo

NOTA: Tutte le procedure descritte in questo documento vengono eseguite secondo le linee guida stabilite dal Pannello di Amministrazione Stanford on Laboratory Animal Care (APLAC).

1. Timed Gravidanze - Tecnica Superovulazione (Figura 1)

NOTA: Proprio tempi l'età gestazionale di embrioni di topo per la chirurgia fetale a E16.5 e E18.5 è di importanza fondamentale. In questa sezione abbiamo dettaglio il nostro protocollo di sincronizzazione gravidanze del mouse utilizzando mares siero incinta (PMS) e gonadotropina corionica umana (HCG) iniezioni per indurre superovulazione.

1. Iniettare topi femmina (<5 per gabbia) per via intraperitoneale (IP) con 3,0-5,0 unità internazionali (UI) di PMS in un volume di 100 microlitri PBS 1:00-15:00 per il giorno 1.
2. Tra le 12:00 e le 14:00 del giorno 3 (quarantacinque a 47 ore dopo l'iniezione PMS), iniettare topi femmina IP con 3,0-5,0 UI di HCG in un volume di 100 microlitri PBS.
   NOTA: Le induce iniezione HCG ovulazione circa 12 ore dopo l'iniezione.
3. Subito dopo iniezioni di HCG, accoppiarsi con le femmine i maschi di età compresa tra 8-16 settimane.
   NOTA BENE: Noi di solito poniamo due femmine in una gabbia di singoli uomini.
4. Femmine separati da uomini la mattina del giorno 4 (6:00-10:00) e record come fetale E0.5 età.
   NOTA: tappi vaginali possono essere controllati in questo momento; Tuttavia, l'osservazione di un tappo vaginale non garantisce gravidanza e femmine può diventare incinta quando non si osserva la spina. Dato che la gravidanza è in genere osservabile mediante ispezione visiva e / o la palpazione in età gestazionale E16.5 e E18.5, controllando tappi vaginali la mattina del giorno 4 non è strettamente necessario. Nella nostra esperienza, e seconda del ceppo, circa il 30-50% delle femmine super ovulato diventa incinta utilizzando la tecnica qui descritta.

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Figura 1. Schema di Tecnica Superovulazione. Procedura mostra Schema superovulazione cronometrato gravidanze nei topi. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

2. murino fetale Surgery (Dorsale Ferimento) su E16.5 e E18.5 embrioni (Figura 2)

1. Prima della procedura, pulire tutte le superfici della sala operatoria e attrezzature con il 70% di alcol isopropilico. Inoltre, sterilizzare tutte le forniture chirurgiche e gli strumenti che saranno utilizzati nella procedura da essi autoclave. Alcuni istituti possono consentire il successivo utilizzo di caldo tallone sterilizzazione. Per il funzionamento, utilizzare confezioni sterili che includono la garza e strumenti chirurgici.
2. Indurre l'anestesia in donne in gravidanza (fetale E16.5 età o E18.5) inferiore al 2,5% della miscela isoflurano / ossigeno a 2 L al min seguita da anestesia di mantenimento a 1 L per min.
3. Per conimpresa adeguata anestesia, assicurano i riflessi pedale profondi del mouse vengono soppressi e posizionare il mouse in posizione prona.
4. Applicare una pomata oftalmica veterinario come Puralube prevenire l'irritazione degli occhi o secchezza durante la procedura.
5. Preparare addome somministrando una leggera applicazione di crema depilatoria per non più di 30 secondi (Figura 2A).
6. Preparare addome per la chirurgia asettica con povidone-iodio e di alcol (figura 2B e 2C).
7. Eseguire linea mediana laparotomia sotto il microscopio con le forbici microchirurgia (Figura 2D e 2E).
8. Esporre delicatamente utero e feto selezionato per la chirurgia (Figura 2F).
9. Irrigare campo chirurgico con il caldo (38 ° C) PBS (PBS) con un ago smussato punta
   NOTA: Si può essere fatto piegando con cautela la punta di un ago di grosso calibro. (Figura 2G e 2H).
10. Posizionare il feto in modo da consentires pieno accesso a dorso.
11. Passare un punto stringa di borsa utilizzando 7-0 nylon sutura attraverso l'utero che insiste sul sito di ferimento dorsale previsto (Figura 2I). Posizione stringa di borsa su una regione del dorso a sinistra oa destra del midollo spinale, e in una regione di parete uterina privo di grandi vasi sanguigni.
12. Eseguire un'incisione 3 millimetri attraverso la parete uterina e sacco amniotico nel centro della stringa borsa (Figura 2J).
13. Irrigare sito di incisione con acqua calda (38 ° C) PBS.
14. Utilizzando forbici microchirurgiche, tagliare una sola ferita excisional tutto spessore, di circa 1 mm di lunghezza, nel dorso del feto.
15. Delicatamente sito di incisione asciugare con cotone applicatore.
16. Iniettare 3 ml di volume India sottocutanea inchiostro nel sito della ferita per contrassegnare posizione di ferita (Figura 2K).
17. Irrigare con acqua calda (38 ° C) PBS per assicurare l'inchiostro è stato mantenuto all'interno del sito della ferita.
18. Avere chirurgica assistant inject caldo (38 ° C) PBS attraverso blunt punta siringa da 10 G nel sacco amniotico, come la stringa di borsa è chiusa (Figura 2L). Ritrarre siringa come chiusura stringa di borsa si avvicina al completamento (Figura 2M).
19. Ritorno delicatamente dell'utero nella cavità addominale (Figura 2N).
20. Evert pelle e del peritoneo.
21. Hanno assistente chirurgica irrigare cavità addominale con acqua calda (38 ° C) PBS.
22. Chiudi addome rapidamente pinzatura pelle e del peritoneo chiuso (Figura 2O). La chiusura standard viene eseguita in due strati; peritoneo e muscoli addominali in uno strato, tessuto sottocutaneo e la pelle nel secondo strato. Per sacrificio immediato e la raccolta del feto, la nostra manifestazione dimostra la chiusura in un solo strato.
23. Posto l'animale sotto osservazione in un incubatore calda a 37 ° C per 30 minuti o fino a quando l'animale riprende conoscenza sufficiente per mantenere decubito sternale.
24. Non returna l'animale per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato dalla procedura.
25. Al risveglio dall'anestesia e durante il successivo 48 hr, amministrare l'iniezione sottocutanea di buprenorfina (0,05 mg / kg) ogni 12 ore di analgesia come necessario sulla base della valutazione del dolore. Somministrare carprofen (5 mg / kg) per via sottocutanea per il sollievo del dolore post-operatorio supplementare se necessario.
26. Animali Ritorno alla gabbia e di fornire loro cibo e acqua ad libitum.
27. Monitorare attentamente per manifestazioni di dolore.
28. Post-operatorio 48 ore, sacrificio madre incinta con una dose eccessiva di isoflurano e del raccolto feriti feto. Per fare questo, regolare la concentrazione isoflurano al 5% o superiore e mantenere l'esposizione per 1 min dopo la cessazione della respirazione. Confermare l'eutanasia con dislocazione cervicale. Raccolto un embrione illeso per il controllo di pari età. Embrioni tardivi dovrebbero avere un sistema diverso di eutanasia in linea con le raccomandazioni IACUC, come decaptazione, dislocazione cervicale, o iniezione chimica.

Figura 2. Schema di Murine fetale Surgery. Passi generali per la dorsale ferendo in E16.5 e E18.5 embrioni di topo. (A) Depilazione di topo dell'addome. (B e C) Preparazione di topo dell'addome. (D) microscopio utilizzato per chirurgica procedura. (E) Midline laparotomia. (F) L'esposizione dell'utero. (G) Creazione di blunt-punta dell'ago. (H) Irrigazione dell'utero con soluzione salina calda. (I) Creazione di stringa di borsa sutura. (J) incisione attraverso uterina muro e 1 mm completa generazione ferita excisional spessore. (K) L'iniezione sottocutanea di inchiostro di china. (L e M) Chiusura della stringa di borsa sutura. (N e O)Chiusura dell'addome. Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.

Risultati

Per l'analisi istologica, ferite cutanee della pelle dorsale E16.5 e E18.5 embrioni di topo dovrebbero essere raccolti 48 ore dopo il ferimento, fissati in 4% PFA, e inclusi in paraffina. Nei modelli transgenici fluorescenti, la crioconservazione di ottobre può essere appropriato. Ci sono diverse macchie che possono essere utilizzati per visualizzare architettura tessuto cellulare e connettivo. Ematossilina e eosina è una macchia a due colori che macchia nuclei blu e strutture eosinofili (es., Citoplasma ...

Discussione

Il protocollo chirurgico presentato qui descrive un modello escissionale fetale guarigione scarless murino pubblicato nel 2006 dal nostro laboratorio ^10. Oltre agli altri modelli consolidati di ferimento excisional ^11, esistono modelli incisionali di fetale murino scarless guarigione così ^12,13. Indagini di fetale guarigione scarless nella scimmia, agnello, coniglio, opossum, e ratti sono stati segnalati ^14-17. Tuttavia, i topi rappresentano un modello ideale per esplorare fe...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-O MONOSOF Suture	eSuture	SN-1647G
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650916
Micro-scissors	Kent Scientific	INS600127
Autoclip 9 mm	Texas Scientific Instruments	205060
Insulin Syringe	Thermo Fisher Scientific	22-272-382
Black Pigment	AIMS	242
BD Safety-Lok 3 ml Syringe	BD Biosciences	309596
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-049
OPMI-MD Surgical Microscope	Carl Zeiss Surgical Inc
Pregnant Mares Serum (PMS)	Millipore	367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG)	Sigma-Aldrich	CG10
Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415
Nair (depilatory cream)	Church and Dwight Co.	22600267058