Un ratón fetal Modelo de la piel de la reparación de heridas sin cicatrices

Resumen

During mammalian development, early gestational skin wounds heal without a scar. Here we detail a reliable and reproducible model of fetal scarless wound healing in the cutaneous dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Resumen

Early in utero, but not in postnatal life, cutaneous wounds undergo regeneration and heal without formation of a scar. Scarless fetal wound healing occurs across species but is age dependent. The transition from a scarless to scarring phenotype occurs in the third trimester of pregnancy in humans and around embryonic day 18 (E18) in mice. However, this varies with the size of the wound with larger defects generating a scar at an earlier gestational age. The emergence of lineage tracing and other genetic tools in the mouse has opened promising new avenues for investigation of fetal scarless wound healing. However, given the inherently high rates of morbidity and premature uterine contraction associated with fetal surgery, investigations of fetal scarless wound healing in vivo require a precise and reproducible surgical model. Here we detail a reliable model of fetal scarless wound healing in the dorsum of E16.5 (scarless) and E18.5 (scarring) mouse embryos.

Introducción

Heridas en la piel fetales curan rápidamente y scarlessly hasta finales de la gestación ^1. La reparación de heridas sin cicatrices fetal se caracteriza por la regeneración de la arquitectura del tejido normal y la función. La transición de una cicatriz de fenotipo cicatrización se produce en el tercer trimestre del embarazo en los seres humanos y en todo el día embrionario 18 (E18) en ratones ^2,3. En comparación con los adultos, la reparación de heridas fetal se caracteriza por una rápida epitelización, la deposición de tejido conectivo, y la migración de fibroblastos.

Muchos estudios han ofrecido posibles explicaciones para el fenómeno de la cicatrización de heridas sin cicatrices durante el desarrollo fetal temprana. La inflamación es un componente fundamental de la reparación de heridas de adultos; Sin embargo, las heridas fetales se caracterizan por una falta de inflamación aguda ^4. Si esto es una consecuencia de la inmadurez funcional del sistema inmune durante las etapas fetal permanece poco clara. Un estudio reciente sugiere que las diferencias en la abundancia, esteraureza, y la función de los mastocitos en E15 E18 vs. piel fetal pueden ser responsables de la transición de un fenotipo sin cicatrices, al menos en el ratón ^3. Otros estudios postulan que las diferencias en las propiedades y la abundancia de macrófagos heridas fetales y adultos son responsables de la reforma de la matriz extracelular normal (ECM) para la reparación de la herida fetal al ^5.

Las diferencias en los factores ambientales durante el desarrollo fetal y adulto también pueden afectar a la reparación de heridas. Longaker y sus colegas mostraron que el fluido de la herida del feto posee altos niveles de actividad estimulante de ácido hialurónico en comparación con ninguno de heridas en adultos fluido ^6. En consecuencia, los niveles más altos de ácido hialurónico, un glicosaminoglicano que promueve un microambiente favorable para la motilidad celular y la proliferación, en el entorno de la herida fetal puede ser responsable del fenotipo sin cicatrices visto durante el desarrollo fetal temprana. Otras líneas de evidencia apuntan al hecho de que el queso fetaambiente l herida es relativamente hipoxémica y sumergido en el líquido amniótico estéril rico en factores de crecimiento ^7. Sin embargo, hay una respuesta definitiva se ha previsto un evento crítico o factor durante la embriogénesis que desencadena la transición de la regeneración de cicatrices de reparación fibrótica.

La comprensión de los mecanismos responsables de la curación sin cicatrices en el feto requiere un modelo preciso y reproducible. A continuación te detallamos un modelo reproducible de fetal sin cicatrices cicatrización de heridas en el dorso de E16.5 (cicatrices) y embriones E18.5 (cicatrización) del ratón. Además, pequeñas variaciones de este modelo se pueden utilizar para realizar una serie de estudios adicionales, como el análisis de la expresión génica de las heridas fetales y ^8,9 piel. Dado que los embarazos precisamente cronometrados son críticos para la recapitulación con éxito de este modelo de curación sin cicatrices de heridas fetal, también detalle nuestro protocolo de superovulación cronometrado embarazos.

Protocolo

NOTA: Todos los procedimientos descritos en este documento se realizan de acuerdo a los lineamientos establecidos por el Grupo Administrativo de Stanford en Laboratorio Animal Care (APLAC).

1. temporizadas Embarazos - Técnica Superovulación (Figura 1)

NOTA: Precisamente temporizar la edad gestacional de embriones de ratón para la cirugía fetal en E16.5 y E18.5 es de importancia crítica. En esta sección detallamos nuestro protocolo de sincronización embarazos ratón utilizando suero embarazada yeguas (PMS) y gonadotropina coriónica humana (HCG) inyecciones para inducir superovulación.

1. Inyectar ratones hembra (<5 por jaula) por vía intraperitoneal (IP) con 3,0 a 5,0 unidades internacionales (UI) de PMS en un volumen de 100 l de PBS 1:00-15:00 para el día 1.
2. Entre las 12:00 y las 14:00 del día 3 (cuarenta y cinco a 47 horas después de la inyección PMS), inyectar ratones hembra IP con 3,0 a 5,0 UI de HCG en un volumen de 100 l de PBS.
   NOTA: Los induce inyección de HCG ovulación, aproximadamente 12 horas después de la inyección.
3. Inmediatamente después de las inyecciones de HCG, aparearse con hembras varones de 8 a 16 semanas.
   NOTA: Por lo general colocamos dos hembras en una jaula de machos individuales.
4. Mujeres separadas de los hombres en la mañana del día 4 (06:00-10 a.m.) y registro como E0.5 edad fetal.
   NOTA: tapones vaginales pueden ser revisados ​​en este momento; sin embargo, la observación de un tapón vaginal no garantiza el embarazo y hembras puede quedar embarazada cuando se observa ningún enchufe. Dado que el embarazo es normalmente observable mediante inspección visual y / o palpación en edades E16.5 y E18.5 gestacional, la comprobación de tapones vaginales en la mañana del día 4 no es estrictamente necesario. En nuestra experiencia, y dependiendo de la cepa, aproximadamente el 30-50% de las mujeres súper-ovulado quedan embarazadas usando la técnica descrita aquí.

pg "/>
Figura 1. Esquema de Superovulación Técnica. Procedimiento de actuación Esquema de superovulación cronometrado embarazos en ratones. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Cirugía Fetal Murino (Dorsal hiriente) en E16.5 y E18.5 embriones (Figura 2)

1. Antes del procedimiento, limpiar todas las superficies de la sala de operaciones y equipos con 70% de alcohol isopropílico. Además, esterilizar todos los suministros quirúrgicos e instrumentos que se utilizan en el procedimiento en autoclave ellos. Algunas instituciones pueden permitir el uso posterior de la esterilización del grano caliente. Por operación, use compresas estériles que incluyen gasas y los instrumentos quirúrgicos.
2. Inducir la anestesia en las madres embarazadas (E16.5 edad fetal o E18.5) bajo 2.5% mezcla de isoflurano / oxígeno a 2 l por min seguido de mantenimiento de la anestesia en 1 L por minuto.
3. Para confirma anestesia adecuada, asegúrese de que los reflejos de pedal profundas del ratón se suprimen y colocar el ratón en la posición prona.
4. Aplique un ungüento oftálmico veterinario como Puralube para evitar irritación de los ojos o la sequedad durante el procedimiento.
5. Preparar abdomen mediante la administración de una ligera aplicación de crema depilatoria durante no más de 30 segundos (Figura 2).
6. Preparar abdomen para la cirugía aséptica con povidona-yodo y alcohol (Figura 2B y 2C).
7. Realizar laparotomía media bajo el microscopio utilizando tijeras de microcirugía (Figura 2D y 2E).
8. Exponer suavemente útero y el feto seleccionado para la cirugía (Figura 2F).
9. Riegue campo quirúrgico con agua tibia (38 ° C) solución salina tamponada con fosfato (PBS) usando una aguja roma-tip
   NOTA: Uno puede hacerse doblando con cuidado la punta de una aguja de calibre grande. (Figura 2G y 2H).
10. Coloque el feto de una manera que permites acceso completo al dorso.
11. Pasar una puntada de hilo de bolsa utilizando sutura de nylon 7-0 a través del útero se sitúa el emplazamiento de la herida dorsal previsto (Figura 2I). Posición cordón de bolsa sobre una región de dorso hacia la izquierda o derecha de la médula espinal, y en una región de la pared uterina desprovista de vasos sanguíneos grandes.
12. Hacer una incisión de 3 mm a través de la pared uterina y el saco amniótico en el centro de la bolsa de tabaco (Figura 2J).
13. Riegue sitio de la incisión con agua tibia (38 ° C) PBS.
14. Con unas tijeras de microcirugía, cortar una sola herida excisional de espesor total, de aproximadamente 1 mm de longitud, en el dorso del feto.
15. Suavemente sitio de la incisión séquela con aplicador de punta de algodón.
16. Inyectar 3 l volumen de la India por vía subcutánea de tinta en la zona de la herida para marcar la posición de la herida (Figura 2C).
17. Irrigar con agua caliente (38 ° C) PBS para asegurarse de tinta ha sido retenido dentro de sitio de la herida.
18. Tener quirúrgica asistente inject caliente (38 ° C) a través de PBS con puntas romas 10 G jeringa en el saco amniótico como el cordón de bolsa está cerrada (Figura 2 l). Repliegue jeringa como cierre en bolsa de tabaco llega a su fin (Figura 2 M).
19. Volver suavemente útero en la cavidad abdominal (Figura 2 N).
20. Piel Evert y el peritoneo.
21. Han asistente quirúrgico irrigar la cavidad abdominal con agua caliente (38 ° C) PBS.
22. Cerrar abdomen rápidamente por grapado piel y peritoneo cerrado (Figura 2O). El cierre estándar se realiza en dos capas; peritoneo y músculo abdominal en una capa, tejido subcutáneo y de la piel en la segunda capa. Para el sacrificio inmediato y la cosecha del feto, nuestra demostración muestra el cierre en una capa.
23. Colocar el animal en observación en una incubadora caliente fijado en 37 ° C durante 30 min o hasta que el animal recupera la consciencia suficiente para mantener decúbito esternal.
24. No returna del animal a la compañía de otros animales hasta que se haya recuperado por completo de la intervención.
25. Al despertar de la anestesia y durante la posterior de 48 horas, administrar la inyección subcutánea de buprenorfina (0,05 mg / kg) cada 12 horas de analgesia según sea necesario, basado en la evaluación del dolor. Administrar carprofeno (5 mg / kg) por vía subcutánea para el alivio del dolor post-operatorio adicional según sea necesario.
26. Vuelta de los animales a la jaula y darles comida y agua ad libitum.
27. Seguir de cerca las manifestaciones de dolor.
28. 48 horas después de la cirugía, sacrifica madre embarazada con una sobredosis de isoflurano y la cosecha heridos feto. Con el fin de hacer esto, ajustar la concentración de isoflurano al 5% o superior y mantener la exposición de 1 min después de la cesación de la respiración. Confirme la eutanasia con dislocación cervical. Cosecha de un embrión no herido por el control de la misma edad. Finales de los embriones deben tener un método separado de la eutanasia consistente con las recomendaciones del IACUC, como decapitación, dislocación cervical, o de inyección de químicos.

Figura 2. Esquema de Cirugía murino fetal. Los pasos generales para dorsal hiriendo en E16.5 y E18.5 embriones de ratón. (A) de depilación abdomen del ratón. (B y C) Preparación de abdomen del ratón. (D) Microscopio para uso quirúrgico procedimiento. (E) de la línea media laparotomía. (F) La exposición del útero. (G) Creación de aguja roma-punta. (H) Riego del útero con una solución salina tibia. (I) Creación de sutura en bolsa. (J) a través de la incisión uterina pared y 1 mm generación herida por escisión de espesor total. (K) La inyección subcutánea de tinta china. (L y M) Clausura de sutura en bolsa. (N y O)Cierre del abdomen. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Resultados

Para el análisis histológico, heridas cutáneas en la piel dorsal de E16.5 y E18.5 embriones de ratón se deben cosechar 48 horas después de la herida, fijado en el 4% PFA, y embebidos en parafina. En modelos transgénicos fluorescentes, la criopreservación de octubre puede ser apropiado. Hay varias manchas que se pueden usar para visualizar la arquitectura del tejido celular y conectivo. Hematoxilina y eosina es una mancha de dos colores que tiñe los núcleos azules y estructuras de eosinófilos (es decir.,

Discusión

El protocolo quirúrgico se presenta aquí se describe un modelo de escisión de la curación sin cicatrices fetal murino publicado por primera vez en 2006 por nuestro laboratorio ^10. Además de otros modelos establecidos de la herida excisional ^11, existen modelos de incisión de la curación sin cicatrices fetal murino, así ^12,13. Las investigaciones de la cicatrización de heridas sin cicatrices fetal en el mono, cordero, conejo, tlacuache, y la rata se han reportado ^14-17.

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
7-O MONOSOF Suture	eSuture	SN-1647G
Surgical Forceps	Kent Scientific	INS650916
Micro-scissors	Kent Scientific	INS600127
Autoclip 9 mm	Texas Scientific Instruments	205060
Insulin Syringe	Thermo Fisher Scientific	22-272-382
Black Pigment	AIMS	242
BD Safety-Lok 3 ml Syringe	BD Biosciences	309596
Phosphate Buffered Saline	Life Technologies	10010-049
OPMI-MD Surgical Microscope	Carl Zeiss Surgical Inc
Pregnant Mares Serum (PMS)	Millipore	367222
Human Chorionic Gonadotropin (HCG)	Sigma-Aldrich	CG10
Povidone Iodine Prep Solution	Dynarex	1415
Nair (depilatory cream)	Church and Dwight Co.	22600267058