إعداد وتوصيف SDF-1α-الشيتوزان-ديكستران سلفات النانوية

Summary

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.

Abstract

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

Introduction

كبريتات ديكستران (DS) والشيتوزان (CS) هي السكريات مع عدة مجموعات استبداله سلفات سالبة الشحنة (في DS)، أو مجموعات أمين موجبة الشحنة (deacetylated CS). عندما مختلطة في محلول مائي، والسكريات اثنين تشكل المجمعات متضاعف الكتروليتي من خلال التفاعلات كهرباء. المجمعات الناتجة قد شكل المجاميع الكبيرة التي سيتم فصل-التخلص من محلول مائي (رواسب)، أو الجسيمات الصغيرة التي هي المياه التشتت (الغروية). الظروف الخاصة التي تساهم في هذه النتائج وقد تم دراسة على نطاق واسع، كما تم تلخيص وتوضيح بالتفصيل في استعراض حديث ^1. ومن بين هذه الشروط، واثنين من المتطلبات الأساسية لإنتاج جزيئات الماء تبعثر هي يجب أن 1) لديهم البوليمرات اتهم معاكس مختلفة إلى حد كبير الكتلة المولية. و 2) أن تكون مختلطة في نسبة غير متكافئة. هذه الظروف ستسمح للقطاعات البوليمرية المعقد المسؤول محايد الناتجة عن تهمةتحييد لفصل وتشكل جوهر الجسيمات، والبوليمر الزائد لتشكيل الغلاف الخارجي ^1. المقصود من تلك الجسيمات غليكان الموصوفة في هذا البروتوكول للتسليم الرئوي، وتهدف إلى أن تكون صافية سالبة الشحنة، وذات أبعاد نانومتر. التهمة سطح السلبي يقلل من احتمال امتصاص الخلايا للجسيمات ^2،3. الجسيمات البعد نانومتر تسهيل المرور عبر الممرات الهوائية البعيدة. لتحقيق هذا الهدف، ومقدار DS المستخدمة في هذا المستحضر هو ما يزيد من CS (نسبة الوزن 3: 1)؛ وعالية الوزن الجزيئي DS (الوزن المتوسط ​​MW 500،000) ومنخفضة الوزن الجزيئي CS (المدى MW 50-190 كيلو دالتون، 75-85٪ deacetylated) وتستخدم.

SDF-1α عامل صاروخ موجه الخلايا الجذعية، والذي يمارس وظيفة صاروخ موجه من خلال نشاطها الكيميائي. SDF-1α يلعب دورا هاما في صاروخ موجه وصيانة الخلايا الجذعية المكونة للدم في نخاع العظام، وتوظيف PROGEخلايا nitor إلى الأنسجة الطرفية لإصلاح إصابة ^4،5. SDF-1α له موقع ملزم الهيبارين في تسلسل البروتين، مما يسمح للبروتين لربط الهيبارين / كبريتات heparan، dimers النموذج، تكون محمية من البروتيني (CD26 / DPPIV) تعطيل، وتتفاعل مع الخلايا المستهدفة من خلال مستقبلات سطح الخلية ^6-8. DS له خصائص هيكلية مماثلة الهيبارين / كبريتات heparan. وبالتالي فإن الربط من قوات الدفاع الذاتى-1α لDS تكون مماثلة لتلك التي بروابط لها البوليمرية الطبيعية.

في بروتوكول التالية، ونحن تصف إعداد النانوية SDF-1α-DS-CS. وتمثل الإجراءات احدة من الصيغ التي تم دراستها سابقا ^9. ويتم تكييف البروتوكول في الأصل من التحقيق النانوية VEGF-DS-CS ^10. ووصف إعداد نطاق ضيق، والتي يمكن زيادتها بسهولة مع حلول الأسهم نفسها وظروف التحضير. بعد التحضير، وتتميز الجزيئات بذ فحص حجمها، وإمكانات زيتا ومدى التأسيس SDF-1α، في المختبر الافراج عن الوقت، ونشاط دمج قوات الدفاع الذاتى-1α.

Protocol

1. إعداد SDF-1α غليكان النانوية

ونظرا لغرض في الجسم الحي التسليم، وتعقيم جميع الحاويات، الماصات، ونصائح المستخدمة في إعداد.

1. إعداد الحلول الأسهم التالية في عالى النقاء المياه: 1٪ كبريتات ديكستران. 1 M هيدروكسيد الصوديوم (العقيمة التي تمت تصفيتها مع غشاء PES)؛ 0.1٪ الشيتوزان في 0.2٪ حمض الخليك الجليدي (فلتر من خلال 0.8 و 0.22 ميكرون مرشحات على التوالي، وضبط درجة الحموضة إلى 5.5 مع هيدروكسيد الصوديوم بعد ذلك)؛ 0.1 M ZnSO _4؛ 15٪ مانيتول، و0.92 ملغ / مل SDF-1α (المخزنة في aliquots في 80 ° C، والاحتفاظ بها في 4 درجات مئوية إذابة مرة واحدة).
2. تعقيم حلول الأوراق المالية من خلال 0.22 ميكرون أغشية الترشيح. تقييم مستويات الذيفان الداخلي في حل استعداد مع الليمول خلية أميبية الشكل المحللة (LAL) هلام تجلط الفحص. تأكد من أن مستويات هي <0.06 EU / مل.
3. إضافة 0.18 مل عالى النقاء المياه للكوب 1.5 مل قارورة تحتوي على شريط مغناطيسي. ضبط سرعة ضجة في 800 دورة في الدقيقة. إضافة 0.1 مل 1٪كبريتات ديكستران وتحرك المكونات لمدة 2 دقيقة. إضافة 0.08 ملغ SDF-1α (0.087 مل من 0.92 ملغ / مل SDF-1α الحل) ويقلب لمدة 20 دقيقة.
4. إضافة 0.33 مل 0.1٪ الشيتوزان قطرة قطرة ويقلب لمدة 5 دقائق. تغيير السرعة ضجة إلى أقصى حد وإضافة 0.1 مل 0.1 M ZnSO ₄ ببطء مع حقنة 0.1 مل (أكثر من 1 دقيقة).
5. العودة سرعة ضجة إلى 800 دورة في الدقيقة ويقلب لمدة 30 دقيقة. إضافة 0.4 مل 15٪ مانيتول ويقلب لمدة 5 دقائق. نقل خليط التفاعل إلى أنبوب 1.5 مل microfuge. الطرد المركزي في 16،000 x ج في 4 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة.
   ملاحظة: إن وجود مانيتول يسهل إعادة تعليق من الجسيمات بعد الطرد المركزي. اعتمادا على الاكتناز من بيليه، يمكن أن تختلف تركيز مانيتول من 0٪ إلى 5٪. إعادة تعليق كامل للجسيمات بعد كل الطرد المركزي أمر بالغ الأهمية لتجنب المجاميع في تعليق النهائي.
6. نضح طاف واستخدام ماصة لإزالة آخر قطرة من السائل ببطء. إضافة 0.2 مل 5٪ مانيتول. تعليق بيليه مع 0.5 مل، 29 G نيحقنة DLE. إضافة 1 مل 5٪ مانيتول. أجهزة الطرد المركزي في 16،000 x ج لمدة 15 دقيقة.
7. كرر الخطوة 1.6.
8. نضح طاف. Resuspend وبيليه في 0.2 مل 5٪ مانيتول. تخزين تعليق الجسيمات في 4 درجات مئوية.
   ملاحظة: تعليق الجسيمات يمكن أيضا تخزينها في المجمد -80 ° C أو مجفف بالتجميد. بما في ذلك 5٪ مانيتول في تعليق ضروري لمنع تجميع الجسيمات بعد تجميد والذوبان أو بعد تجفيد والإماهة. يمكن إزالتها مانيتول بواسطة الطرد المركزي للتعليق بعد التخزين.

2. قياس حجم الجسيمات وزيتا المحتملة

ويتم تحليل حجم الجسيمات وزيتا المحتملة من قبل ديناميكية تشتت الضوء وتشتت الضوء الكهربي، على التوالي، مع محلل الجسيمات هو مبين في قائمة المواد.

1. إعداد المعلمات التالية لقياس حجم الجسيمات: مرات تراكم: 70. كرر مرات: 4؛ درجة الحرارة: 25 ° C.مخفف: المياه؛ كثافة التعديل: السيارات.
2. تمييع عينة SDF-1α-DS-CS مع الماء (التخفيف 10 أضعاف). تحميل 100 ميكرولتر من العينة إلى كوفيت الأشعة فوق البنفسجية يمكن التخلص منها مثل كفيت إيبندورف. إدراج كفيت في حامل الخلية. انتظر لتعديل كثافة للوصول إلى "الأمثل" (~ 10،000 من القانون الجنائي). بدء الحصول على البيانات.
3. بعد الانتهاء من القياس، تسجيل نتائج cumulants من قطر (نانومتر) ومؤشر التشتت المتعدد. متوسط ​​النتائج المتحصل عليها من كل من القراءات المتكررة 4 وحساب الانحراف المعياري.
4. تحميل 500 ميكرولتر من 10 أضعاف المخفف عينة الجسيمات إلى خلية تدفق لقياس المحتملة زيتا. إعداد المعلمات التالية لقياس: مرات تراكم: 10؛ كرر مرات: 5؛ درجة الحرارة: 25 ° C. مخفف: المياه؛ كثافة التعديل: السيارات. تسجيل نتائج إمكانات زيتا (بالسيارات). متوسط ​​النتيجة التي حصل عليها من كل من قراءات متكررة 5، وحساب deviatio القياسيةن.

3. الكمي لقوات الدفاع الذاتى-1α في الجسيمات

1. تمييع مجانا شكل قوات الدفاع الذاتى-1α لتركيزات من 0.01، 0.02، 0.03، 0.04، و 0.05 ملغ / مل في 1.3x Laemmli عينة العازلة. تمييع 6 ميكرولتر عينات SDF-1α-DS-CS مع 40 ميكرولتر 1.3x Laemmli عينة العازلة. (إعداد 4X Laemmli عازلة الأسهم التي تحتوي على 0.25 M تريس، حمض الهيدروكلوريك، ودرجة الحموضة 7.5، 8٪ SDS، الجلسرين 40٪، 0.05 ملغ / مل برموفينول الأزرق، و 8٪ 2-المركابتويثانول. يقسم الحل الأسهم إلى مأخوذة الصغيرة والحفاظ على -20 ° C للاستخدام مرة واحدة).
2. تسخين العينات عند 100 درجة مئوية لمدة 10 دقيقة. دوامة العينات مرتين (كل لمدة 10 ثانية في أقصى سرعة) خلال فترة التسخين 10 دقيقة من أجل فصل الجزيئات تماما. تهدئة عينات لRT لمدة 2 دقيقة. الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 0.5-1 دقيقة لاسقاط المكثفات المياه. دوامة مرة أخرى إلى المزيج جيدا.
   ملاحظة: عند هذه النقطة، يجب أن يكون الحل عينة واضح مع أي راسب مرئية الحاضر.
3. تحميل 10 &# 181؛ ل عينة / جيد إلى 4-20٪ هلام SDS. تشغيل الكهربائي في 200 V لمدة 20 دقيقة. وصمة عار الجل مع Coomassie الأزرق البروتين وصمة عار.
4. فحص كثافة الفرقة البروتين من قوات الدفاع الذاتى-1α باستخدام الجزيئي تصوير وتحليل كثافة البرامج. حساب كمية من قوات الدفاع الذاتى-1α في الجسيمات ضد منحنى القياسية التي شيدت مع معايير SDF-1α الحرة.

4. في المختبر الإصدار الفحص

1. خلط جزيئات غليكان SDF-1α مع الفوسفات مخزنة المالحة Dulbecco ودون الكالسيوم والمغنيسيوم (D-PBS) في نسبة 1: 1 (ت / ت).
2. تقسيم تعليق الجسيمات إلى 0.05 مل مأخوذة في 1.5 مل أنابيب. تحميل العينات إلى أسفل الأنابيب. تجنب إدخال فقاعات الهواء أو إزعاج سطح السائل. ختم الجزء العلوي من الأنابيب مع بارافيلم.
   ملاحظة: في القيام بذلك، سوف يظل السائل في أسفل أثناء الدوران من أعلى إلى أسفل لاحق على خلاط أنبوب.
3. تدوير أنابيب في 37 و# 176؛ C على الدوارة الصغيرة أنبوب خلاط. إزالة مأخوذة من الأنابيب في الأوقات المعينة وأجهزة الطرد المركزي على الفور العينات عند 16،000 x ج لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية.
4. فصل supernatants والكريات، وإعادة تشكيل بيليه مع 0.05 مل D-PBS. تخزين العينات في -20 ° C. بعد أن يتم جمع كل العينات، دراسة supernatants والكريات على هلام SDS كما هو موضح أعلاه.

5. هجرة الفحص

ويقيس هذا الاختبار النشاط الكيميائي لقوات الدفاع الذاتى-1α. تفاعل SDF-1α مع مستقبلات لها (CXCR4) على سطح الخلية يسبب هجرة الخلية نحو الانحدار SDF-1α. في هذا الاختبار، يتم تحميل الخلايا في بئر العلوي (مفصولة غشاء نصف نافذ من أقل أيضا) حل وSDF-1α إلى أقل أيضا.

1. تمييع SDF-1α (مجانا أو شكل محدد الجسيمات) مع العازلة الهجرة (متوسطة RPMI-1640 تحتوي على 0.5٪ ألبومين المصل البقري) في 3-FOالتخفيف المتسلسل دينار لتركيزات النهائية من 100، 33، 11، 3.7، 1.2، 0.41، 0.14، و 0.05 نانوغرام / مل.
2. إضافة 0.6 مل من محلول SDF-1α المخفف أو عازلة الهجرة فقط (المراقبة السلبية) إلى بئر في لوحة 24-جيدا. إضافة 0.57 مل عازلة الهجرة إلى بئر (سيطرة خلية الإدخال). احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. وضع نفاذية إدراج الثقافة الخلية مثل Transwell (حجم المسام 5 ميكرون، وقطرها 6.5 ملم) على أعلى من أقل أيضا. تحميل 0.1 مل خلايا Jurkat (5 × 10 ⁵⁾ في Transwell إدراج. تحميل 0.03 مل الخلايا مباشرة لسيطرة خلية إدخال جيدا. احتضان لوحة عند 37 درجة مئوية لمدة 2 ساعة في 5٪ CO ₂ الحاضنة.
3. إزالة إدراج Transwell. نقل الخلايا التي هاجروا إلى انخفاض الآبار إلى أنبوب البوليسترين 4 مل. عد الخلايا هاجر مع عداد الكريات التدفق.
4. حساب الهجرة كنسبة مئوية من عدد الخلايا الإدخال (عدد الخلايا في السيطرة خلية إدخال جيدا س 100/30) بعد الطرح من الأرقام في negatإيف الضوابط (خلايا هاجروا إلى الآبار التي تحتوي عازلة الهجرة الوحيد).

النتائج

يتم تحديد حجم وزيتا إمكانات مستعدة الجسيمات SDF-1α-DS-CS مع محلل الجسيمات الشكل 1 يوضح تحليل قياس الحجم. من نتائج cumulants تم الحصول عليها من أربعة القياسات المتكررة، فإن متوسط ​​قطرها الهيدروديناميكية من الجسيمات SDF-1α-DS-CS هو 661 ± 8.2 (نانومتر) والتشتت المتعدد هو 0.23 ± 0...

Discussion

كما ذكر أعلاه، يتم تشكيل النانوية DS-CS من خلال تحييد تهمة بين polyanion (DS) وpolycation (CS) الجزيئات. منذ التفاعل تهمة يحدث بسهولة خلال الاصطدام الجزيئية، وتركيز الحلول البوليمر وسرعة التحريك أثناء الخلط هو أمر حاسم لحجم الجسيمات الناتجة. والاتجاه العام هو أن أكثر المخفف DS وCS حل?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran sulfate	Fisher	BP1585-100
Chitosan, low molecular weight	Sigma	448869
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	204986
D-Mannitol	Sigma	M9546
UltraPure water	Invitrogen	10977-023
SDF-1α	Prepared according to reference 8.
Syringe filter, PES membrane 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm)	Fisher	14-513-63
Glass vial Kit; SUN-SRi	Fisher	14-823-182
Delsa Nano C Particle Analyzer	Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets	Eppendorf	952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-Rad	456-1096
GelCode Blue Safe Protein Stain	Fisher	PI-24592
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System	BioRad	170-8640
Corning Transwell Permeable Supports	Corning	3421
Accuri C6 Flow Cytometer	BD Biosciences
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Sigma	D8537
Pyrogent plus kit	Fisher	NC9753738