Preparación y caracterización de SDF-1α-quitosano-sulfato de dextrano Nanopartículas

Resumen

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.

Resumen

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

Introducción

El sulfato de dextrano (DS) y quitosano (CS) son polisacáridos con múltiples grupos sulfato cargados negativamente sustituidos (en DS), o grupos amino cargados positivamente (desacetilado CS). Cuando se mezcla en una solución acuosa, los dos polisacáridos forman complejos de polielectrolitos a través de interacciones electrostáticas. Los complejos resultantes pueden formar grandes agregados que se separación de fases de la solución acuosa (precipitados), o pequeñas partículas que son dispersables en agua (coloides). Las condiciones específicas que contribuyen a estos resultados han sido ampliamente estudiados, y se han resumido y se ilustra en detalle en una reciente revisión ^1. Entre estas condiciones, dos requisitos básicos para la producción de partículas dispersables en agua son los polímeros de carga opuesta deben 1) tienen significativamente diferente masa molar; y 2) ser mezclado en una relación no estequiométrica. Estas condiciones permitirán que los segmentos poliméricos acomplejados carga neutra generados por la carganeutralización para segregar y forman el núcleo de la partícula, y el exceso de polímero para formar la cubierta exterior ^1. Las partículas de glicanos descritos en este protocolo se pretende para la administración pulmonar, y están diseñados para ser neta de carga negativa, y de dimensiones nanométricas. La carga superficial negativa reduce la probabilidad de la captación celular de las partículas de ^2,3. Las partículas de dimensión nanométrica facilitan el paso a través de las vías respiratorias distales. Para lograr este objetivo, la cantidad de DS utilizado en esta preparación es en exceso de CS (relación en peso 3: 1); y de alto peso molecular-DS (promedio en peso MW 500.000) y de bajo peso molecular CS (rango MW 50-190 kDa, 75-85% desacetilado) se utilizan.

SDF-1α es un factor homing de células madre, que ejerce la función de toma de referencia a través de su actividad quimiotáctica. SDF-1α juega un papel importante en homing y mantenimiento de las células madre hematopoyéticas en la médula ósea, y en el reclutamiento de progecélulas NITOR a los tejidos periféricos a ^4,5 reparación de lesiones. SDF-1α tiene un sitio de unión a heparina en su secuencia de la proteína, que permite que la proteína se une a la heparina / heparán sulfato, formar dímeros, ser protegido de la proteasa (CD26 / DPPIV) inactivación, e interactuar con las células diana a través de los receptores de la superficie celular ^6-8. DS tiene propiedades estructurales similares a la heparina / heparán sulfato; Por lo tanto, la unión de SDF-1α a DS sería similar a la de sus ligandos poliméricos naturales.

En el siguiente protocolo, se describe la preparación de nanopartículas SDF-1α-DS-CS. Los procedimientos representan una de las formulaciones que se han estudiado previamente ^9. El protocolo está adaptado originalmente de una investigación de nanopartículas de VEGF-DS-CS ^10. Una preparación a pequeña escala se describe, que se puede escalar fácilmente con las mismas soluciones madre y condiciones de preparación. Después de la preparación, las partículas se caracterizan by el examen de su tamaño, el potencial zeta, grado de incorporación SDF-1α, in vitro tiempo de liberación, y la actividad de la SDF-1α incorporado.

Protocolo

1. Preparación de SDF-1α Glycan Nanopartículas

Debido a los efectos de la administración in vivo, esterilizar todos los recipientes, pipetas y puntas utilizadas en la preparación.

1. Preparar las siguientes soluciones madre en agua ultrapura: sulfato de dextrano al 1%; 1 M NaOH (esterilizada por filtración con una membrana de PES); 0,1% de quitosano en 0,2% de ácido acético glacial (filtro a través del 0,8 y 0,22 micras filtros consecutivos y ajustar el pH a 5,5 con NaOH después); 0,1 M ZnSO _4; 15% de manitol; y 0,92 mg / ml SDF-1α (almacenado en alícuotas a 80 ° C, y se mantiene a 4 ° C una vez descongelados).
2. Esterilizar soluciones madre a través de 0,22 micras membranas de filtro. Evaluar los niveles de endotoxina en la solución preparada con el ensayo de lisado de amebocitos de Limulus (LAL) coágulo de gel. Asegúrese de que los niveles son <0,06 UE / ml.
3. Añadir 0,18 ml de agua ultrapura a un vial de vidrio de 1,5 ml que contenía una barra de agitación magnética. Ajuste la velocidad de agitación a 800 rpm. Añadir 0,1 ml 1%sulfato de dextrano y se agita durante 2 min. Añadir 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml de 0,92 mg / ml SDF-1α solución) y se agita durante 20 min.
4. Añadir 0,33 ml 0,1% gota a gota quitosano y se agita durante 5 min. Cambiar la velocidad de agitación al máximo y añadir 0,1 ml 0,1 M _ZnSO4 lentamente con una jeringa 0,1 ml (más de 1 min).
5. Volver velocidad de agitación a 800 rpm y agitar durante 30 min. Añadir 0,4 ml 15% de manitol y se agita durante 5 min. Transferir la mezcla de reacción a un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Centrifugar a 16.000 xg a 4 ° C durante 10 min.
   Nota: La presencia de manitol facilita la resuspensión de las partículas después de la centrifugación. Dependiendo de la compacidad de la pastilla, la concentración de manitol puede variar de 0% a 5%. La resuspensión completa de las partículas después de cada centrifugación es crítico para evitar los agregados en la suspensión final.
6. Aspirar el sobrenadante y utilizar una pipeta para extraer la última gota de líquido lentamente. Añadir 0,2 ml 5% de manitol. Suspender el pellet con 0,5 ml, 29 G neejeringa dle. Añadir 1 ml de manitol al 5%. Centrifugar a 16000 xg durante 15 min.
7. Repita el paso 1.6.
8. Aspirar el sobrenadante. Resuspender el precipitado en 0,2 ml 5% de manitol. Guarde la suspensión de partículas a 4 ° C.
   Nota: La suspensión de partículas también puede ser almacenado congelado a -80 ° C o liofilizado. Incluyendo manitol 5% en la suspensión es esencial para evitar la agregación de las partículas después de la congelación y descongelación o después de la liofilización y la rehidratación. El manitol se puede eliminar por centrifugación de la suspensión después de que el almacenamiento.

2. Medición de tamaño de partícula y Potencial Zeta

El tamaño de partícula y el potencial zeta se analizan mediante dispersión de luz dinámica y dispersión de luz electroforética, respectivamente, con un analizador de partículas se indica en la Lista de Materiales.

1. Ajuste los siguientes parámetros para la medición del tamaño de partícula: tiempos de acumulación: 70; Repetir las veces: 4; Temperatura: 25 ° C;Diluyente: agua; Ajuste de intensidad: auto.
2. Diluir la muestra SDF-1α-DS-CS con agua (dilución de 10 veces). Carga de 100 l de la muestra a una cubeta UV desechable tal como una cubeta de Eppendorf. Inserte la cubeta en el soporte de la celda. Espere a que el ajuste de la intensidad de alcanzar "óptimo" (~ 10.000 cps). Iniciar la adquisición de datos.
3. Después de que se ha completado la medición, registrar los resultados de cumulantes diámetro (nm) y el índice de polidispersidad. Media de los resultados obtenidos a partir de cada uno de los 4 lecturas repetidas y calcular la desviación estándar.
4. Carga de 500 l de la muestra de partículas diluida 10 veces a una celda de flujo para la medición de potencial zeta. Ajuste los siguientes parámetros para la medición: los tiempos de acumulación: 10; Repetir las veces: 5; Temperatura: 25 ° C; Diluyente: agua; Ajuste de intensidad: auto. Registre los resultados del potencial zeta (mV). La media de los resultados obtenidos a partir de cada una de las 5 lecturas repetidas, y calcular el deviatio estándarn.

3. Cuantificación de SDF-1α en las Partículas

1. Diluir de forma libre SDF-1α a concentraciones de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04, y 0,05 mg / ml en tampón de muestra Laemmli 1,3x. Diluir 6 mu l muestras SDF-1α-DS-CS con 40 l 1.3x tampón de muestra Laemmli. (4x Preparar tampón de Laemmli madre que contiene 0,25 M Tris-HCl, pH 7,5, 8% de SDS, 40% de glicerol, 0,05 mg / ml de azul de bromofenol, y 8% de 2-mercaptoetanol. Dividir la solución madre en pequeñas alícuotas y mantenerla en -20 ° C para uso individual.)
2. Calentar las muestras a 100 ° C durante 10 min. Vortex las muestras dos veces (cada uno durante 10 segundos a velocidad máxima) durante el tiempo de calentamiento 10 min con el fin de disociar las partículas completamente. Enfriar las muestras a temperatura ambiente durante 2 min. Se centrifuga a 10.000 xg durante 0,5-1 min para reducir el agua de condensación. Vortex de nuevo para mezclar bien.
   Nota: En este punto, la solución de la muestra debe ser clara sin visible precipitado presente.
3. Carga 10 y# 181; l muestra / pocillo de un gel SDS 4-20%. Ejecutar la electroforesis a 200 V durante 20 min. Teñir el gel con Coomassie proteína mancha azul.
4. Examine la densidad de banda de proteína de SDF-1α usando un generador de imágenes y análisis de densitometría software molecular. Calcular la cantidad de SDF-1α en las partículas frente a una curva patrón construida con las normas SDF-1α libres.

4. In Vitro Ensayo de liberación

1. Mezclar partículas de glicano SDF-1α con solución salina tamponada con fosfato de Dulbecco sin calcio y magnesio (D-PBS) a una proporción de 1: 1 (v / v).
2. Divida la suspensión de partículas en 0,05 ml alícuotas en tubos de 1,5 ml. Cargar las muestras a la parte inferior de los tubos. Evitar la introducción de burbujas de aire o alterar la superficie del líquido. Selle la parte superior de los tubos con Parafilm.
   NOTA: Al hacer esto, el líquido se mantendrá en la parte inferior durante la rotación de arriba a abajo posterior en el mezclador tubo.
3. Gire los tubos a 37 y# 176; C en un mezclador giratorio de Micro-Tube. Retire las alícuotas de a las horas designadas y centrifugar inmediatamente las muestras a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C.
4. Separar los sobrenadantes y pellets, y reconstituir el pellet con 0,05 ml D-PBS. Almacenar las muestras a -20 ° C. Después se recogen todas las muestras, examinar los sobrenadantes y pellets en un gel de SDS como se describió anteriormente.

5. Ensayo de Migración

Este ensayo mide la actividad quimiotáctica de SDF-1α. Interacción de SDF-1α con su receptor (CXCR4) en la superficie celular provoca la migración de la célula hacia el gradiente de SDF-1α. En este ensayo, las células se cargan en un pozo superior (separados por una membrana semipermeable desde un pocillo inferior) solución y SDF-1α en un pocillo inferior.

1. Diluir SDF-1α (libre o unido a partículas formulario) con tampón de migración (medio RPMI-1640 que contiene 0,5% de albúmina de suero bovino) en un 3-fodilución en serie ld a concentraciones finales de 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14, y 0,05 ng / ml.
2. Añadir 0,6 ml de la solución de SDF-1α diluido o tampón de migración sólo (control negativo) a un pocillo de la placa de 24 pocillos. Añadir 0,57 ml de tampón de migración a un pozo (control celda de entrada). Incubar a 37 ° C durante 30 min. Coloque un inserto de cultivo celular permeable tales como Transwell (tamaño de poro 5 m, diámetro 6,5 mm) en la parte superior de la inferior también. Cargar 0,1 ml células Jurkat (5 × 10 ⁵⁾ en la Transwell insertan. Cargar 0,03 ml células directamente al control de celda de entrada también. Incubar la placa a 37 ° C durante 2 horas en una incubadora de _CO2 al 5%.
3. Quite los insertos Transwell. Transferencia de las células que han migrado a los pocillos inferiores a un tubo de poliestireno de 4 ml. Contar las células migraron con un citómetro de flujo.
4. Calcular la migración como un porcentaje del número de células de entrada (el número de células en el control de células de entrada bien x 100/30) después de la sustracción de los números en negative controles (células migradas a los pocillos que contienen sólo tampón de migración).

Resultados

El tamaño y el potencial zeta de las partículas de SDF-1α-DS-CS preparados se determinó con un analizador de partículas. La figura 1 muestra el análisis de la medida del tamaño. De los resultados obtenidos a partir de cumulantes cuatro mediciones repetidas, el diámetro hidrodinámico medio de las partículas SDF-1α-DS-CS es 661 ± 8,2 (nm) y la polidispersidad es de 0,23 ± 0,02. El resultado de la medición del potencial zeta se muestra en la Figura 2. De los cinco mediciones ...

Discusión

Como se mencionó anteriormente, las nanopartículas DS-CS se forman a través de neutralización de la carga entre el polianión (DS) y policatión (CS) moléculas. Dado que la interacción de carga se produce fácilmente durante la colisión molecular, la concentración de las soluciones de polímero y la velocidad de agitación durante la mezcla es crítica para el tamaño de las partículas resultantes. Una tendencia general es que las soluciones de DS y CS ¹⁵ y mayor resultado velocidad de agitación en ...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran sulfate	Fisher	BP1585-100
Chitosan, low molecular weight	Sigma	448869
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	204986
D-Mannitol	Sigma	M9546
UltraPure water	Invitrogen	10977-023
SDF-1α	Prepared according to reference 8.
Syringe filter, PES membrane 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm)	Fisher	14-513-63
Glass vial Kit; SUN-SRi	Fisher	14-823-182
Delsa Nano C Particle Analyzer	Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets	Eppendorf	952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-Rad	456-1096
GelCode Blue Safe Protein Stain	Fisher	PI-24592
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System	BioRad	170-8640
Corning Transwell Permeable Supports	Corning	3421
Accuri C6 Flow Cytometer	BD Biosciences
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Sigma	D8537
Pyrogent plus kit	Fisher	NC9753738