Herstellung und Charakterisierung von SDF-1α-Chitosan-Nanopartikel Dextransulfat

Zusammenfassung

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.

Zusammenfassung

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

Einleitung

Dextransulfat (DS) und Chitosan (CS) sind Polysaccharide mit mehreren substituierten negativ geladenen Sulfatgruppen (DS) oder positiv geladenen Amingruppen (deacetyliert CS). Wenn in einer wässrigen Lösung gemischt, die zwei Polysacchariden Polyelektrolytkomplexe durch elektrostatische Wechselwirkungen. Die resultierenden Komplexe können große Aggregate, die aus der wässrigen Lösung (Präzipitate)-Phase abgetrennt werden, oder kleine Teilchen, die in Wasser dispergierbare (Kolloide) sind zu bilden. Die spezifischen Bedingungen, die zu diesen Ergebnissen beigetragen haben, wurden ausführlich untersucht und wurden zusammengefasst und in einer aktuellen Bewertung ¹ im Detail dargestellt. Unter diesen Bedingungen sind die entgegengesetzt geladenen Polymere müssen 1) deutlich unterschiedliche Molmasse zwei grundlegende Anforderungen für die Herstellung von in Wasser dispergierbaren Teilchen; und 2) in einem nicht-stöchiometrischen Verhältnis vermischt werden. Diese Bedingungen werden die ladungsneutrale komplexierten Polymersegmente durch Ladungs ​​erzeugt erlaubenNeutralisation zu trennen und bilden den Kern des Teilchens, und das überschüssige Polymer an der Außenschale ¹ bilden. Die in diesem Protokoll beschrieben Glykan Partikel zur pulmonalen Verabreichung von Nanometerdimensionen bestimmt und sind entworfen net werden negativ geladen, und. Die negative Oberflächenladung verringert die Wahrscheinlichkeit der zellulären Aufnahme der Teilchen ^2,3. Partikel von Nanometerdimension erleichtern den Durchgang durch die distalen Atemwege. Um dieses Ziel zu erreichen, ist die Menge des DS in dieser Zubereitung von mehr als CS (Gewichtsverhältnis 3: 1); und hochmolekulare DS (Gewichtsmittel MW 500.000) und Niedermolekulare CS (MW-Bereich von 50 bis 190 kDa, 75-85% deacetylierte) verwendet.

SDF-1α ist ein Stammzelle Homing Faktor, der die Referenzfahrt-Funktion durch seine chemotaktische Aktivität ausübt. SDF-1α spielt eine wichtige Rolle in der Referenzfahrt und der Wartung von hämatopoetischen Stammzellen im Knochenmark, und bei der Einstellung von progenitor Zellen peripheren Gewebe für Verletzungen Reparatur ^4,5. SDF-1α hat eine Heparin-Bindungsstelle in der Proteinsequenz, die das Protein an Heparin / Heparansulfat, Dimere zu binden, aus Protease (CD26 / DPPIV) Inaktivierung geschützt werden, und mit Zielzellen in Wechselwirkung über Zelloberflächenrezeptoren ermöglicht ^6-8. DS ähnliche strukturelle Eigenschaften wie Heparin / Heparansulfat; So kann die Bindung von SDF-1α DS wäre ähnlich der des natürlichen polymeren Liganden.

In dem folgenden Protokoll beschreiben wir die Herstellung von SDF-1α-DS-CS Nanopartikel. Die Verfahren stellen eine der Formulierungen, die bisher untersucht wurden, ^9. Das Protokoll ist ursprünglich aus einer Untersuchung von VEGF-DS-CS-Nanopartikeln ¹⁰ angepasst. Eine kleine technische Herstellung beschrieben, die leicht mit den gleichen Stammlösungen und Herstellungsbedingungen skaliert werden kann. Nach der Herstellung werden die Teilchen b gekennzeichnety Prüfung ihrer Größe, Zetapotential, das Ausmaß der SDF-1α Einarbeitung in vitro Freigabezeit, und die Aktivität des einge SDF-1α.

Protokoll

1. Vorbereitung der SDF-1α Glycan Nanopartikel

Aufgrund der Zweck der in vivo-Abgabe, Sterilisieren alle Behälter, Pipetten und Spitzen in der Zubereitung verwendet.

1. Die folgenden Stammlösungen in hochreinem Wasser: 1% Dextransulfat; 1M NaOH (steril mit einem PES-Membran gefiltert); 0,1% Chitosan in 0,2% Eisessig (Filter durch 0,8 und 0,22 um Filter nacheinander und Einstellen des pH auf 5,5 mit NaOH später); 0,1M ZnSO _4; 15% Mannit; und 0,92 mg / ml SDF-1α (in Aliquots bei -80 ° C gelagert, und bei 4 ° C gehalten wurde, einmal aufgetaut).
2. Sterilisieren Stammlösungen durch 0,22 um Filtermembranen. Beurteilen Endotoxinspiegel in der hergestellten Lösung mit Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL) Gelklumpens Assay. Stellen Sie sicher, dass die Pegel <0,06 EU / ml.
3. In 0,18 ml Reinstwasser in ein 1,5 ml-Glasfläschchen mit einem magnetischen Rührstab. Stellen Sie die Rührgeschwindigkeit auf 800 Umdrehungen pro Minute. 0,1 ml 1%Dextransulfat und rühre 2 min. Hinzufügen 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml von 0,92 mg / ml SDF-1α-Lösung) und rühre 20 min.
4. In 0,33 ml 0,1% Chitosan tropfenweise und unter Rühren für 5 min. Ändern Rührgeschwindigkeit auf die maximale und 0,1 ml 0,1 M ZnSO ₄ langsam mit einer 0,1 ml Spritze (über 1 min).
5. Zurückzukehren Rührgeschwindigkeit auf 800 Upm und rührt 30 min. Fügen Sie 0,4 ml 15% Mannit und rühren für 5 min. Übertragen der Reaktionsmischung auf ein 1,5 ml Mikrozentrifugenröhrchen. Zentrifugieren bei 16.000 × g bei 4 ° C für 10 min.
   Anmerkung: Die Anwesenheit von Mannit erleichtert die Resuspension der Partikel nach Zentrifugation. Abhängig von der Dichte des Pellets kann Mannit Konzentration von 0% bis 5% variieren. Vollständige Resuspendierung der Partikel nach jedem Zentrifugationsschritt ist kritisch, um Aggregate in der endgültigen Suspension zu vermeiden.
6. Überstand wird abgesaugt und mit einer Pipette den letzten Tropfen Flüssigkeit langsam zu entfernen. 0,2 ml 5% Mannit. Hängen Sie das Pellet mit 0,5 ml, 29 G needle Spritze. 1 ml 5% Mannit. Zentrifugieren bei 16.000 xg für 15 min.
7. Wiederholen Sie Schritt 1.6.
8. Saugen Sie den Überstand. Das Pellet in 0,2 ml 5% Mannit. Bewahren Sie die Partikel-Suspension bei 4 ° C.
   Anmerkung: Die Partikelsuspension kann auch bei -80 ° C gefroren gelagert oder lyophilisiert werden. Einschließlich 5% Mannitol in der Suspension ist wesentlich, um die Aggregation der Partikel nach dem Einfrieren und Auftauen oder nach Lyophilisierung und Rehydratisierung zu verhindern. Mannitol kann durch Zentrifugieren der Suspension nach der Lagerung entfernt werden.

2. Messung der Partikelgröße und Zetapotential

Die Teilchengröße und Zeta-Potential werden durch dynamische Lichtstreuung und Elektrophorese-Lichtstreuung, die jeweils analysiert, mit einer in der Materialliste angegeben Teilchenanalysator.

1. Richten Sie die folgenden Parameter für Partikelgrößenmessung: Thesaurierung Zeiten: 70; Wiederholungszeiten: 4; Temperatur: 25 ° C;Verdünnungsmittel: Wasser; Intensitätseinstellung: auto.
2. Verdünnen Sie die SDF-1α-DS-CS-Probe mit Wasser (10-fache Verdünnung). Last 100 ul der Probe auf eine wegwerfbare UV Küvette wie einem Eppendorf Küvette. Die Küvette in den Küvettenhalter einsetzen. Warten Sie auf die Intensitätseinstellung zu "Optimum" (~ 10.000 cps) zu erreichen. Starten Sie die Datenerfassung.
3. Nachdem die Messung abgeschlossen ist, notieren Sie die Kumulanten Ergebnisse der Durchmesser (nm) und Polydispersitätsindex. Der Mittelwert der von jedem der vier wiederholten Ablesungen stammenden Ergebnisse und die Berechnung der Standardabweichung.
4. Last 500 ul des 10-fach verdünnten Partikelprobe zu einer Durchflusszelle zum Zeta-Potential-Messung. Richten Sie die folgenden Parameter für die Messung: Thesaurierung Zeiten: 10; Wiederholzeiten: 5; Temperatur: 25 ° C; Verdünnungsmittel: Wasser; Intensitätseinstellung: auto. Aufzeichnung der Ergebnisse des Zetapotential (mV). Durchschnitt das Ergebnis von jedem der 5 wiederholten Ablesungen stammenden, und berechnen Sie die Standard deviation.

3. Quantifizierung von SDF-1α in den Teilchen

1. Verdünne freier Form SDF-1α, um Konzentrationen von 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 und 0,05 mg / ml in 1,3 x Laemmli-Probenpuffer. Verdünnen 6 ul SDF-1α-DS-CS Proben mit 40 ul 1,3x Laemmli-Probenpuffer. (Bereiten 4x Laemmli Lager-Puffer, der 0,25 M Tris-HCl, pH 7,5, 8% SDS, 40% Glycerin, 0,05 mg / ml Bromphenolblau und 8% 2-Mercaptoethanol. Teilen Sie die Stammlösung in kleine Aliquots bringen und -20 ° C zur Einzelnutzung.)
2. Erhitzen Sie die Proben bei 100 ° C für 10 min. Vortex die Proben zweimal (jeweils 10 Sekunden bei maximaler Geschwindigkeit) während des 10 min Erhitzungsdauer, um die Teilchen vollständig zu dissoziieren. Kühlen Sie die Proben auf Raumtemperatur für 2 min. Zentrifuge bei 10.000 × g für 0,5-1 min hinunter die Wasserkondensat zu bringen. Vortex wieder gut mischen.
   Hinweis: An dieser Stelle sollte der Probenlösung klar ohne sichtbare Niederschlag vorhanden sein.
3. Last 10 &# 181; l Probe / Vertiefung zu einem 4-20% SDS-Gel. Führen Elektrophorese bei 200 V für 20 min. Färben Sie das Gel mit Coomassie-Blau-Färbung Protein.
4. Untersuchen Sie die Proteinbande Dichte von SDF-1α mit einem Molekular Imager und Densitometrie-Analyse-Software. Berechnen der Menge des SDF-1α in den Teilchen mit einer Standardkurve mit freiem SDF-1α-Standards konstruiert.

4. In-vitro-Freisetzungstest

1. Mischungs SDF-1α Glykan Teilchen mit Dulbeccos phosphatgepufferter Salzlösung ohne Calcium und Magnesium (D-PBS) bei einem Verhältnis 1: 1 (v / v).
2. Teilen Sie die Partikelsuspension in 0,05 ml-Aliquots in 1,5-ml-Röhrchen. Laden der Proben auf den Boden der Röhrchen. Einleiten von Luftblasen zu vermeiden oder die Oberfläche der Flüssigkeit zu stören. Verschließen Sie die Spitze der Röhrchen mit Parafilm.
   Anmerkung: Dabei wird die Flüssigkeit am Boden während der nachfolgenden oben nach unten auf dem Drehrohrmischer sein.
3. Drehen Sie die Rohre auf 37 &# 176; C auf einer rotierenden Mikrorohr Mixer. Aliquots Entfernen aus den Rohren in den angegebenen Zeiten und sofort zu zentrifugieren die Proben bei 16.000 g für 10 min bei 4 ° C.
4. Trennen Sie die Überstände und Pellets und Rekonstitution des Pellets mit 0,05 ml D-PBS. Lagern Sie die Proben bei -20 ° C. Nachdem alle Proben gesammelt werden, prüft die Überstände und Pellets auf einem SDS-Gel, wie oben beschrieben.

5. Migration Assay

Dieser Test misst die chemotaktische Aktivität von SDF-1α. Wechselwirkung von SDF-1α mit seinem Rezeptor (CXCR4) auf der Zelloberfläche bewirkt Migration der Zelle in Richtung der SDF-1α Gradienten. In diesem Assay werden die Zellen in einen oberen und und SDF-1α-Lösung (die durch eine semipermeable Membran von einer unteren Vertiefung getrennt) in einer unteren Vertiefung geladen.

1. Verdünne SDF-1α (frei oder partikelgebundene Form) mit Migrationspuffer (RPMI-1640-Medium, das 0,5% Rinderserumalbumin) in einem 3-fold serielle Verdünnung, um Endkonzentrationen von 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14 und 0,05 ng / ml.
2. Hinzufügen von 0,6 ml der verdünnten SDF-1α Lösung oder Migrationspuffer allein (negative Kontrolle), um ein gut in der 24-Well-Platte. In 0,57 ml Migrationspuffer auf eine gut (Eingabezellensteuerung). Bei 37 ° C für 30 min. Legen Sie einen durchlässigen Zellkultureinsatzes wie Transwell (Porengröße 5 um, Durchmesser 6,5 mm) auf der Oberseite des unteren gut. Last 0,1 ml Jurkat-Zellen (5 × 10 ⁵⁾ in den Transwell einzufügen. Laden 0,03 ml Zellen direkt an die Eingangszelle Kontrollvertiefung. Inkubieren der Platte bei 37 ° C für 2 h in einem 5% CO ₂ -Inkubator.
3. Entfernen Sie die Transwell-Einsätze. Übertragen Sie die Zellen, die zu den unteren Vertiefungen in ein 4 ml Polystyrolröhrchen eingewandert sind. Zählen Sie die migrierten Zellen mit einem Durchflusszytometer.
4. Migrations Berechnen als Prozentsatz der Eingangszellennummer (Zellennummer in der Eingangszelle Kontrollkavität x 100/30) nach Subtraktion der Anzahlen in negative Kontrollen (Zellen, die Vertiefungen, die nur Migrationspuffer migriert).

Ergebnisse

Die Größe und Zetapotential der vorbereiteten SDF-1α-DS-CS-Partikel mit einer Partikelanalysegerät bestimmt. Figur 1 zeigt die Analyse der Größenmessung. Aus den Ergebnissen von Kumulanten vier wiederholten Messungen erhalten wird, ist die mittlere hydrodynamische Durchmesser der SDF-1α-DS-CS Partikel 661 ± 8,2 (nm) und die Polydispersität beträgt 0,23 ± 0,02. Das Ergebnis der Zetapotentialmessung ist in Fig. 2 gezeigt Von den fünf wiederholten Messungen, das Zetapotential d...

Diskussion

Wie oben erwähnt, werden die DS-CS Nanopartikeln durch Ladungsneutralisation zwischen Polyanion (DS) und Polykation (CS) Molekülen gebildet. Da die Ladungswechselwirkung während der Molekular Kollision leicht, die Konzentration der Polymerlösungen und die Rührgeschwindigkeit beim Vermischen von entscheidender Bedeutung für die Größe der resultierenden Teilchen. Ein genereller Trend ist, dass mehr DS und CS-Lösungen ¹⁵ und höhere Rührgeschwindigkeit Ergebnis in kleinere Partikel verdünnt.

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran sulfate	Fisher	BP1585-100
Chitosan, low molecular weight	Sigma	448869
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	204986
D-Mannitol	Sigma	M9546
UltraPure water	Invitrogen	10977-023
SDF-1α	Prepared according to reference 8.
Syringe filter, PES membrane 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm)	Fisher	14-513-63
Glass vial Kit; SUN-SRi	Fisher	14-823-182
Delsa Nano C Particle Analyzer	Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets	Eppendorf	952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-Rad	456-1096
GelCode Blue Safe Protein Stain	Fisher	PI-24592
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System	BioRad	170-8640
Corning Transwell Permeable Supports	Corning	3421
Accuri C6 Flow Cytometer	BD Biosciences
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Sigma	D8537
Pyrogent plus kit	Fisher	NC9753738