Préparation et caractérisation des SDF-1α-chitosane-Sulfate de Dextran nanoparticules

Résumé

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.

Résumé

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

Introduction

Sulfate de dextran (DS) et le chitosan (CS) sont des polysaccharides avec plusieurs groupes sulfate chargés négativement substitués (dans DS) ou des groupes aminés chargés positivement (désacétylés CS). Lorsqu'il est mélangé à une solution aqueuse, les deux polysaccharides forment des complexes polyélectrolytiques par des interactions électrostatiques. Les complexes résultants peuvent former de gros agrégats qui seront phases séparées de la solution aqueuse (précipités), ou de petites particules qui sont dispersables dans l'eau (colloïdes). Les conditions spécifiques qui contribuent à ces résultats ont été largement étudiées et ont été résumés et illustrés en détail dans une étude récente ^1. Parmi ces conditions, deux conditions de base pour la production de particules dispersibles dans l'eau sont les polymères de charges opposées doivent 1) ont une masse molaire sensiblement différente; et 2) être mélangés dans un rapport non stoechiométrique. Ces conditions permettront aux segments polymères complexés charge neutre produites par la chargeneutralisation de séparer et de former le noyau de la particule, et le polymère en excès pour former la coque externe ^1. Les particules glycanes décrites dans ce protocole sont destinés à une administration pulmonaire, et sont conçus pour être nette chargé négativement, et de dimensions nanométriques. La charge de surface négative réduit la probabilité d'absorption cellulaire des particules ^2,3. Les particules de dimension nanométrique de faciliter le passage à travers les voies aériennes distales. Pour atteindre cet objectif, la quantité de DS utilisé dans cette préparation est supérieure à CS (rapport pondéral 3: 1); et de haute masse moléculaire DS (moyenne en poids MW 500 000) et de faible poids moléculaire CS (gamme de 50 à 190 MW kDa, 75-85% désacétylé) sont utilisés.

SDF-1α est un facteur de ralliement de cellules souches, qui exerce la fonction de référencement à travers son activité chimiotactique. SDF-1α joue un rôle important dans la prise d'origine et le maintien des cellules souches hématopoïétiques dans la moelle osseuse, et dans le recrutement de progecellules Nitor à tissus périphériques à la réparation des lésions ^{de 4,5.} SDF-1α a un site de liaison à l'héparine dans la séquence de la protéine, ce qui permet à la protéine de se lier à l'héparine / sulfate d'héparane, former des dimères, être protégés contre la protéase (CD26 / DPPIV) inactivation, et d'interagir avec des cellules cibles par l'intermédiaire des récepteurs de surface cellulaire ^6-8. DS a des propriétés structurelles similaires à celles de l'héparine / héparane-sulfate; Ainsi, la liaison du SDF-1α pour DS serait similaire à celui de ses ligands polymères naturels.

Dans le protocole suivant, nous décrivons la préparation de nanoparticules SDF-1α-DS-CS. Les procédures représentent l'une des formules qui ont été précédemment étudiés ^9. Le protocole est à l'origine adapté d'une enquête de nanoparticules VEGF-DS-CS ^10. Une petite préparation à grande échelle est décrite, qui peut être facilement mise à l'échelle avec les mêmes solutions d'achat d'actions et les conditions de préparation. Après la préparation, les particules sont caractérisées by examiner leur taille, le potentiel zêta, degré d'incorporation SDF-1α, in vitro temps de libération, et l'activité du SDF-1α incorporé.

Protocole

1. Préparation de SDF-1α Glycan nanoparticules

En raison de la fin de la livraison in vivo, stériliser tous les récipients, pipettes et embouts utilisés dans la préparation.

1. Préparer les solutions d'achat d'actions suivantes dans UltraPure Eau: 1% de sulfate de dextran; 1 M NaOH (stérile filtrée par une membrane PES); 0,1% de chitosane à 0,2% d'acide acétique glacial (0,8 filtre à travers des filtres de 0,22 um et de façon consécutive et ajuster le pH à 5,5 avec du NaOH après); ZnSO ₄ 0,1 M; 15% de mannitol; et 0,92 mg / ml SDF-1α (stockée en aliquotes à 80 ° C, et maintenu à 4 ° C, une fois décongelés).
2. Stériliser les solutions mères de 0,22 um membranes filtrantes. Évaluer les niveaux d'endotoxines dans la solution préparée avec dosage lysat d'amibocytes de limule (LAL) gel de caillot. Veiller à ce que les niveaux sont <0,06 EU / ml.
3. Ajouter 0,18 ml UltraPure eau pour un flacon en verre de 1,5 ml contenant une barre d'agitation magnétique. Réglez la vitesse d'agitation à 800 tpm. Ajouter 0,1 ml 1%le sulfate de dextrane et agiter pendant 2 min. Ajouter 0,08 mg SDF-1α (0,087 ml de 0,92 mg / ml SDF-1α solution) et agiter pendant 20 min.
4. Ajouter 0,33 ml 0,1% goutte à goutte de chitosane et remuer pendant 5 min. Modifier la vitesse d'agitation au maximum et ajouter 0,1 ml de 0,1 M de ZnSO ₄ lentement avec une seringue 0,1 ml (plus de 1 min).
5. La vitesse d'agitation revenir à 800 tpm et remuer pendant 30 min. Ajouter 0,4 ml 15% de mannitol et remuer pendant 5 min. Transférer le mélange réactionnel dans un tube de microcentrifugation de 1,5 ml. Centrifuger à 16 000 xg à 4 ° C pendant 10 min.
   Remarque: La présence de mannitol facilite la remise en suspension des particules après centrifugation. En fonction de la compacité de la pastille, la concentration en mannitol peut varier de 0% à 5%. Remise en suspension des particules après chaque centrifugation est essentielle pour éviter des agrégats dans la suspension finale.
6. Aspirer le surnageant et utiliser une pipette pour enlever la dernière goutte de liquide lentement. Ajouter 0,2 ml 5% de mannitol. Suspendre le culot avec 0,5 ml, 29 G neeseringue dle. Ajouter 1 ml 5% de mannitol. Centrifuger à 16 000 g pendant 15 min.
7. Répétez l'étape 1.6.
8. Aspirer le surnageant. Reprendre le culot dans 0,2 ml 5% de mannitol. Conservez la suspension de particules à 4 ° C.
   Remarque: La suspension de particules peut également être conservé congelé à -80 ° C ou lyophilisé. Dont 5% de mannitol dans la suspension est essentiel pour empêcher l'agrégation des particules après congélation et décongélation ou après lyophilisation et réhydratation. Le mannitol peut être éliminé par centrifugation de la suspension après le stockage.

2. Mesure de la taille des particules et potentiel Zeta

La taille des particules et le potentiel zêta sont analysées par diffusion de lumière dynamique et électrophorétique diffusion de la lumière, respectivement, avec un analyseur de particules indiqué dans la liste de matériaux.

1. Définissez les paramètres suivants pour la mesure de la taille des particules: temps d'accumulation: 70; Répéter fois: 4; Température: 25 ° C;Diluant: eau; réglage de l'intensité: auto.
2. Diluer l'échantillon SDF-1α-DS-CS avec de l'eau (10 dilution). Charger 100 pl de l'échantillon dans une cuvette UV jetable tel qu'une cuvette Eppendorf. Insérer la cuve dans le porte-cellule. Attendez que le réglage de l'intensité pour atteindre "Optimum" (~ 10 000 cps). Lancer l'acquisition de données.
3. Une fois la mesure terminée, enregistrer les résultats de cumulants diamètre (nm) et l'indice de polydispersité. La moyenne des résultats obtenus à partir de chacune des quatre lectures répétées et calculer l'écart-type.
4. Charge 500 ul de l'échantillon de particules dilué 10 fois à une cellule d'écoulement pour la mesure du potentiel zêta. Définissez les paramètres suivants pour la mesure: temps d'accumulation: 10; Répéter fois: 5; Température: 25 ° C; Diluant: eau; réglage de l'intensité: auto. Consigner les résultats de la potentiel zêta (mV). Moyenne, le résultat obtenu par chacune des cinq lectures répétées, et calculer la norme deviation.

3. Quantification des SDF-1α dans les particules

1. Diluer forme libre SDF-1α à des concentrations de 0,01, 0,02, 0,03, 0,04 et 0,05 mg / ml dans un tampon d'échantillon Laemmli 1.3x. Diluer 6 pi échantillons SDF-1α-DS-CS avec 40 ul 1.3x tampon d'échantillon Laemmli. (Préparer 4x Laemmli stocks tampon contenant 0,25 M Tris-HCl, pH 7,5, 8% de SDS, 40% de glycérol, 0,05 mg / ml de bleu de bromophénol, et 8% de 2-mercaptoéthanol. Divisez la solution mère dans de petites fractions et de garder à -20 ° C à usage unique.)
2. Chauffer les échantillons à 100 ° C pendant 10 min. Vortex les échantillons deux fois (chacun pendant 10 secondes à la vitesse maximale) pendant le temps de chauffage de 10 min pour dissocier les particules complètement. Refroidir les échantillons à température ambiante pendant 2 min. Centrifuger à 10 000 g pendant 0,5 à 1 min pour faire baisser le condensat de l'eau. Vortex à nouveau pour bien mélanger.
   Remarque: À ce stade, la solution de l'échantillon doit être clair sans précipité visible présente.
3. Charge 10 &# 181; l 'échantillon / puits d'un gel de SDS à 4-20%. Exécutez électrophorèse à 200 V pendant 20 min. Colorer le gel avec Coomassie protéines bleuissement.
4. Examiner la densité de la bande de protéine de SDF-1α en utilisant un logiciel d'imagerie et d'analyse de densitométrie moléculaire. Calculer la quantité de SDF-1α dans les particules contre une courbe standard construite aux normes SDF-1α gratuits.

4. Dosage de libération in vitro

1. Mélanger des particules de glycane SDF-1α avec une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco sans calcium et magnésium (D-PBS) à un rapport 1: 1 (v / v).
2. Divisez la suspension de particules dans 0,05 ml aliquotes dans 1,5 ml tubes. Charger les échantillons au fond des tubes. Éviter l'introduction de bulles d'air ou de troubler la surface du liquide. Sceller le haut des tubes avec du parafilm.
   Remarque: Ce faisant, le liquide reste au fond lors de la rotation de haut en bas sur le mélangeur ultérieur du tube.
3. Tournez les tubes à 37 ans &# 176; C sur une rotation Micro-Tube Mixer. Enlever des parties aliquotes des tubes aux moments désignés et centrifuger les échantillons immédiatement à 16 000 xg pendant 10 min à 4 ° C.
4. Séparer les surnageants et granulés, et reconstituer le culot avec 0,05 ml de D-PBS. Conserver les échantillons à -20 ° C. Après que tous les échantillons sont prélevés, examiner les surnageants et culots sur un gel de SDS comme décrit ci-dessus.

5. Migration Assay

Ce test mesure l'activité chimiotactique des SDF-1α. Interaction de SDF-1α avec son récepteur (CXCR4) sur la surface de la cellule provoque la migration de la cellule en direction du gradient SDF-1α. Dans ce dosage, les cellules sont chargées dans un puits supérieur (séparés par une membrane semi-perméable à partir d'un puits inférieur) solution SDF-1α et dans une bien moindre.

1. Diluer SDF-1α (libre ou liée à la particule forme) avec le tampon de migration (milieu RPMI-1640 contenant 0,5% d'albumine de sérum bovin) dans un trois-fold dilution en série à des concentrations finales de 100, 33, 11, 3,7, 1,2, 0,41, 0,14, et 0,05 ng / ml.
2. Ajouter 0,6 ml de la solution SDF-1α dilué ou tampon de migration uniquement (contrôle négatif) à un puits dans la plaque de 24 puits. Ajouter 0,57 ml de tampon de migration vers un puits (contrôle de la cellule d'entrée). Incuber à 37 ° C pendant 30 min. Placer un perméable insert de culture cellulaire tel que Transwell (taille des pores 5 um, diamètre 6,5 mm) au-dessus du puits inférieur. Charge 0,1 ml des cellules de Jurkat (5 × 10 ⁵⁾ dans l'insert Transwell. Chargez 0,03 ml de cellules directement à la commande de cellules d'entrée ainsi. Incuber la plaque à 37 ° C pendant 2 heures dans un incubateur à _CO2 à 5%.
3. Retirez les inserts Transwell. Transférer les cellules qui ont migré vers les puits inférieurs à un tube 4 ml de polystyrène. Comptez le nombre de cellules ayant migré avec un cytomètre de flux.
4. Calculer la migration en pourcentage du nombre de cellules d'entrée (nombre de cellules dans le contrôle de la cellule d'entrée et x 100/30) après soustraction des nombres dans negative contrôles (cellules ayant migré dans les puits contenant tampon de migration uniquement).

Résultats

La taille et le potentiel zéta des particules SDF-1α-DS-CS préparés sont déterminées avec un analyseur de particules. La figure 1 montre l'analyse de la mesure de la taille. A partir des résultats obtenus à partir des cumulants quatre mesures répétées, le diamètre hydrodynamique moyen des particules SDF-1α-DS-CS est 661 ± 8,2 (nm) et la polydispersité est de 0,23 ± 0,02. Le résultat de la mesure du potentiel zêta est représenté sur la Figure 2. A partir des cinq ...

Discussion

Comme mentionné ci-dessus, les nanoparticules DS-CS sont formés par neutralisation de la charge entre le polyanion (DS) et de polycation (CS) molécules. Étant donné que l'interaction de charge se produit facilement pendant la collision moléculaire, la concentration des solutions de polymère et la vitesse d'agitation au cours du mélange est critique pour la taille des particules résultantes. Une tendance générale est que plus dilué DS et CS solutions ¹⁵ et le résultat de la vitesse d'a...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran sulfate	Fisher	BP1585-100
Chitosan, low molecular weight	Sigma	448869
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	204986
D-Mannitol	Sigma	M9546
UltraPure water	Invitrogen	10977-023
SDF-1α	Prepared according to reference 8.
Syringe filter, PES membrane 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm)	Fisher	14-513-63
Glass vial Kit; SUN-SRi	Fisher	14-823-182
Delsa Nano C Particle Analyzer	Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets	Eppendorf	952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-Rad	456-1096
GelCode Blue Safe Protein Stain	Fisher	PI-24592
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System	BioRad	170-8640
Corning Transwell Permeable Supports	Corning	3421
Accuri C6 Flow Cytometer	BD Biosciences
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Sigma	D8537
Pyrogent plus kit	Fisher	NC9753738