SDF-1α-キトサン硫酸デキストランナノ粒子の調製とキャラクタリゼーション

要約

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.

要約

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

概要

デキストラン硫酸（DS）及びキトサン（CS）は、（CSを脱アセチル化）（DS）の複数の置換、負に帯電した硫酸基を有する多糖類である、又は正に帯電したアミン基を。水溶液中で混合する場合、2つの多糖類は、静電相互作用を介して高分子電解質複合体を形成する。得られた複合体は、水溶液（沈殿物）からの相分離、または水分散性（コロイド）である小さい粒子となり、大きな凝集体を形成することができる。これらの成果に貢献する具体的な条件は、広く研究されており、最近の総説¹にまとめ、詳細に説明してきた。これらの条件の中で、水分散性粒子を製造するための2つの基本的な要件は反対に荷電したポリマーは、1）著しく異なるモル質量を持っている必要がある。 2）非化学量論比で混合する。これらの条件は、電荷によって発生した電荷中立複合化ポリマーセグメントを許可します中和は、分離し、粒子のコアを形成し、過剰なポリマーは、外殻^1を形成するためである。このプロトコールに記載されたグリカン粒子は、肺送達のために意図され、負に帯電し、ナノメートル寸法の正味のように設計されている。負の表面電荷は、粒子^2,3の細胞取り込みの可能性を低減する。ナノメートル寸法の粒子は、遠位気道の通過を容易にする。この目標を達成するために、この調製に用いられるDSの量は、CSの過剰である（重量比3：1）。及び高分子量DS（重量平均MW50万）および低分子量CS（MW範囲50から190 kDaの、75％〜85％脱アセチル化）が使用されている。

SDF-1αは、その走化性活性を通じてホーミング機能を発揮する幹細胞のホーミング因子である。 SDF-1αは、ホーミングおよび骨髄中の造血幹細胞の維持に重要な役割を果たし、progeの動員傷害の修復^4,5のための末梢組織へnitor細胞。 SDF-1αタンパク質は、プロテアーゼ（CD26 / DPPIV）不活性化から保護され、ヘパリン/ヘパラン硫酸、フォームダイマーに結合し、細胞表面受容体を介して標的細胞と相互作用することができ、そのタンパク質配列において、ヘパリン結合部位を有する^6-8。 DSはヘパリン/ヘパラン硫酸と同様の構造特性を持つ。このように、DSにSDF-1αの結合は、その天然高分子リガンドのものと同様であろう。

以下のプロトコールでは、SDF-1α-DS-CSナノ粒子の調製を記載する。手順は以前に^9を検討されてきた製剤のいずれかを表す。プロトコルは、もともとVEGF-DS-CSナノ粒子¹⁰の調査から適合される。小規模調製物は、容易に同一のストック溶液と製造条件をスケールアップすることができ、記載されている。調製の後、粒子がbを特徴とするyは、それらのサイズ、ゼータ電位、SDF-1α取り込みの程度を、in vitroでの放出時間、及び組み込まれたSDF-1αの活性を調べる。

プロトコル

SDF-1αグリカンナノ粒子の作製

インビボ送達の目的のために、調製に使用される全ての容器、ピペット、とヒントを滅菌する。

1. 超純水で、次のストック溶液の準備：1％硫酸デキストランを。 1 MのNaOH（滅菌PES膜で濾過したもの）; 0.2％の氷酢酸中の0.1％キトサン（連続して、0.8〜0.22μmのフィルターを通して濾過し、その後NaOHでpHを5.5に調整する）; 0.1 MのZnSO _4。 15％マンニトール。 0.92 mg / mlのSDF-1α（80℃でアリコートで保存し、4℃で維持を一旦解凍C）。
2. 0.22μmのフィルター膜を通すストック溶液を滅菌する。カブトガニ変形細胞溶解物（LAL）ゲルクロットアッセイと調製した溶液中のエンドトキシンレベルを評価。レベルは<0.06 EU / mlであることを確認します。
3. 磁気撹拌棒を含む1.5 mlのガラスバイアルに0.18ミリリットルの超純水を加える。 800rpmで撹拌速度を設定します。 0.1ミリリットルの1％を追加します。硫酸デキストラン、2分間撹拌した。 0.08 mgのSDF-1α（0.92 mg / mlのSDF-1α溶液を0.087ミリリットル）を追加し、20分間攪拌。
4. 0.33ミリリットルの0.1％キトサンを滴下して添加し、5分間撹拌した。最大に変更し、撹拌速度をと（1分以上）0.1ミリリットルの注射器でゆっくりと0.1ミリリットルの0.1MのZnSO _4を追加します。
5. を800rpmに攪拌速度を戻し、30分間撹拌した。 0.4ミリリットルの15％のマンニトールを加え、5分間攪拌する。 1.5mlマイクロチューブに反応混合物を転送します。 10分間4℃で16000×gで遠心し。
   注意：マンニトールの存在は、遠心分離後の粒子の再懸濁を容易にします。ペレットの小型化に応じて、マンニトールの濃度は、0％から5％に変化させることができる。各遠心分離後の粒子の完全な再懸濁は、最終懸濁液中の凝集を回避することが重要です。
6. 上清を吸引し、ゆっくりと液体の最後の一滴を削除するには、ピペットを使用しています。 0.2ミリリットルの5％マンニトールを追加します。 0.5ミリリットルとのペレットを中断し、29 G旧姓DLE注射器。 1ミリリットルの5％マンニトールを追加します。 15分間16000×gで遠心分離する。
7. 手順を繰り返し1.6。
8. 上清を吸引除去する。 0.2ミリリットルの5％マンニトールでペレットを再懸濁。 4℃で粒子懸濁液に保管してください。
   注：粒子懸濁液は、-80℃で凍結または凍結乾燥することができる。懸濁液中を含む5％のマンニトールを凍結融解した後、凍結乾燥及び再水和の後、粒子の凝集を防止することが必須である。マンニトールは、保存後の懸濁液の遠心分離により除去することができる。

粒子径およびゼータ電位の2.測定

粒径およびゼータ電位を素材リストに示され、粒子分析器を用いて、それぞれ、動的光散乱法、電気泳動光散乱によって分析される。

1. 積算回数：以下の粒子サイズ測定のためのパラメータを設定する70。リピート回数：4;温度：25°C。希釈液：水;強度調整：オート。
2. 水（10倍希釈）とSDF-1α-DS-CSサンプルを希釈する。そのようなエッペンドルフキュベットのような使い捨てのUVキュベットに100μlの試料をロードします。セルホルダーにキュベットを挿入します。 「最適」（〜万CPS）に到達するために強度調整を待ちます。データ収集を開始します。
3. 測定が完了した後、直径（nm）であり、多分散性指数のキュムラントの結果を記録する。 4繰り返し測定値のそれぞれから得られた結果を平均し、標準偏差を計算する。
4. 負荷ゼータ電位測定用のフローセルに10倍希釈された粒子試料を500μl。蓄積時間：以下の測定のためのパラメータを設定し10と、リピート回数：5;温度：25°C。希釈液：水;強度調整：オート。ゼータ電位（MV）の結果を記録します。平均の結果は、5を繰り返し測定値のそれぞれから得られ、標準deviatioを計算N。

粒子におけるSDF-1αの3定量

1. 1.3倍Laemmliサンプルバッファーで0.01、0.02、0.03、0.04、および0.05 mg / mlの濃度に自由形式のSDF-1αを希釈する。 40μlの1.3倍Laemmliサンプルバッファーで6μlのSDF-1α-DS-CSサンプルを希釈する。 （0.05ミリグラム/ブロモフェノールブルーミリリットル、8％2-メルカプトエタノール0.25 Mトリス塩酸、pHが7.5、8％SDS、40％グリセロールを含む4倍レムリストック緩衝を準備します。小さなアリコートに原液を分割し、-20℃で保つ単回使用のためにCを°。）
2. 10分間100℃で試料を加熱する。渦完全に粒子を解離するために、10分の加熱時間の間、二倍のサンプル（最大速度で10秒間ずつ）。 2分間RTにサンプルをクールダウン。凝縮水をダウンさせるために30秒〜1分間万×gで遠心し。もう一度よく混ぜるする渦。
   注：この時点では、試料液が目に見える沈殿物が存在すると明確にする必要があります。
3. 負荷10＆＃181; Lサンプル/ウェルに4〜20％SDSゲル。 20分間200Vで電気泳動を実行します。クマシーブルータンパク質染色でゲルを染色。
4. 分子イメージャとトメ解析ソフトウェアを使用して、SDF-1αのタンパク質バンドの密度を調べます。無料のSDF-1α基準に作成した標準曲線に対して粒子中のSDF-1αの量を計算します。

インビトロ放出アッセイ4.

1. 1でカルシウムとマグネシウム（D-PBS）なしのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水でSDF-1αグリカン粒子を混ぜる：1の比（v / v）である。
2. 1.5ミリリットルチューブ内の0.05ミリリットルのアリコートに粒子懸濁液を分割します。チューブの底にサンプルをロードします。気泡を導入するか、液体の表面を乱さない。パラフィルムを有する管の上部をシール。
   注：その際、液体がチューブミキサーに後続の上から下への回転時に底に残る。
3. 37でチューブを回転させて＃176; C回転マイクロ​​チューブミキサーで。指定された時間にチューブからアリコートを取り出し、すぐに4℃で10分間16000×gでサンプルを遠心する。
4. 上清およびペレットを分離し、0.05ミリリットルD-PBSでペレットを再構成。 -20℃でサンプルを保管してください。全てのサンプルが収集された後、上述したように、SDSゲル上で上清およびペレットを調べる。

5.移動アッセイ

このアッセイは、SDF-1αの走化性活性を測定します。細胞表面上のその受容体（CXCR4）とSDF-1αの相互作用は、SDF-1αの勾配に向かって細胞の遊走を引き起こす。このアッセイでは、細胞が低くウェルに及びSDF-1α溶液（下井戸から半透膜で区切られた）上部のウェルにロードされます。

1. SDF-1αを希釈（遊離または粒子に結合した形）3-foのマイグレーションバッファー（0.5％ウシ血清アルブミンを含むRPMI-1640培地）と100、33、11、3.7、1.2、0.41、0.14、および0.05 ng / mlの最終濃度にLDの連続希釈。
2. 24ウェルプレート中のウェルに希釈したSDF-1αソリューションや移行バッファーのみ（陰性対照）の0.6ミリリットルを追加します。ウェル（入力セル制御）に0.57ミリリットルの移行バッファを追加します。 30分間37℃でインキュベートする。そのような低いウェルの上にトランスウェル（孔径5μmの、直径6.5ミリメートル）のような透過性細胞培養インサートを置きます。トランスウェルインサートにロード0.1ミリリットルジャーカット細胞（5×10 ^5）。よく直接入力セルコントロールに0.03ミリリットルの細胞をロードします。 5％CO ₂インキュベーター中で2時間、37℃でプレートをインキュベート。
3. トランスウェルインサートを取り外します。 4ミリリットルポリスチレンチューブに下のウェルに移動した細胞を転送します。フローサイトメーターで移動した細胞を数える。
4. negat内の数字を引いた後の入力セル数（ウェル100/30入力xセル制御中の細胞数）の割合としての移行を計算するコントロール（のみ泳動緩衝液を含むウェルに遊走した細胞）をアイブ。

結果

調製されたSDF-1α-DS-CS粒子のサイズとゼータ電位は、粒子分析器を用いて測定される。1、サイズ測定の分析を示す図 。 4反復測定から得られたキュムラント結果から、SDF-1α-DS-CS粒子の平均流体力学的直径は661±8.2（nm）であり、多分散性は0.23±0.02である。ゼータ電位測定の結果を図2に示されている5つ繰り返し測定から、SDF-1α-DS-CS粒子のゼータ電位は、-2...

ディスカッション

上記のように、DS-CSナノ粒子はポリアニオン（DS）及びポリカチオン（CS）分子間の電荷中和により形成される。電荷相互作用は、分子衝突の間に容易に起こるので、混合中のポリマー溶液と撹拌速度の濃度は、得られた粒子のサイズのために重要である。一般的な傾向は、よりDSとCSのソリューション¹⁵と、より小さい粒子より高い撹拌速度結果を希釈することである。

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran sulfate	Fisher	BP1585-100
Chitosan, low molecular weight	Sigma	448869
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	204986
D-Mannitol	Sigma	M9546
UltraPure water	Invitrogen	10977-023
SDF-1α	Prepared according to reference 8.
Syringe filter, PES membrane 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm)	Fisher	14-513-63
Glass vial Kit; SUN-SRi	Fisher	14-823-182
Delsa Nano C Particle Analyzer	Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets	Eppendorf	952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-Rad	456-1096
GelCode Blue Safe Protein Stain	Fisher	PI-24592
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System	BioRad	170-8640
Corning Transwell Permeable Supports	Corning	3421
Accuri C6 Flow Cytometer	BD Biosciences
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Sigma	D8537
Pyrogent plus kit	Fisher	NC9753738