הכנה ואפיון של SDF-1α-Chitosan-Dextran סולפט חלקיקים

Summary

The objective of this protocol is to incorporate SDF-1α, a stem cell homing factor, into dextran sulfate-chitosan nanoparticles. The resultant particles are measured for their size and zeta potential, as well as the content, activity, and in vitro release rate of SDF-1α from the nanoparticles.

Abstract

Chitosan (CS) and dextran sulfate (DS) are charged polysaccharides (glycans), which form polyelectrolyte complex-based nanoparticles when mixed under appropriate conditions. The glycan nanoparticles are useful carriers for protein factors, which facilitate the in vivo delivery of the proteins and sustain their retention in the targeted tissue. The glycan polyelectrolyte complexes are also ideal for protein delivery, as the incorporation is carried out in aqueous solution, which reduces the likelihood of inactivation of the proteins. Proteins with a heparin-binding site adhere to dextran sulfate readily, and are, in turn, stabilized by the binding. These particles are also less inflammatory and toxic when delivered in vivo. In the protocol described below, SDF-1α (Stromal cell-derived factor-1α), a stem cell homing factor, is first mixed and incubated with dextran sulfate. Chitosan is added to the mixture to form polyelectrolyte complexes, followed by zinc sulfate to stabilize the complexes with zinc bridges. The resultant SDF-1α-DS-CS particles are measured for size (diameter) and surface charge (zeta potential). The amount of the incorporated SDF-1α is determined, followed by measurements of its in vitro release rate and its chemotactic activity in a particle-bound form.

Introduction

סולפט dextran (DS) וchitosan (CS) הם סוכרים עם מטען שלילי בין מספר קבוצות החליפו סולפט (בDS), או קבוצות האמינים טעונות חיובי (deacetylated CS). כאשר מעורב בתמיסה מימית, שני סוכרים יצירת קומפלקסי polyelectrolyte דרך אינטראקציות אלקטרוסטטיות. המתחמים וכתוצאה מכך עלולים ליצור אגרגטים גדולים שיהיה לשלב מופרדים מהתמיסה המימית (משקעים), או חלקיקים קטנים שמים מסיסים (קולואידים). התנאים הספציפיים שתורמים לתוצאות אלה נחקרו רבים, וכבר סיכמו ומאוירים בפירוט בביקורת האחרונה ^1. בין תנאים אלה, שתי דרישות בסיסיות לייצור חלקיקים מסיסים מים חייבים 1) יש לי הפולימרים הטעונים ההפוך מסה טוחנת שונה באופן משמעותי; ו -2) להיות מעורב ביחס הלא stoichiometric. תנאים אלה יאפשר מגזרי פולימרי complexed תשלום ניטראלי שנוצרו על ידי תשלוםנטרול להפריד ויוצר את הליבה של החלקיקים, והפולימרים העודפים כדי ליצור את המעטפת החיצונית ^1. חלקיקי הסוכרים שתוארו בפרוטוקול זה נועדו למסירת ריאתי, ונועדו להיות נקי טעונים שלילי, וממדי ננומטר. תשלום המשטח השלילי מפחית את הסבירות של ספיגה התאית של החלקיקים ^2,3. חלקיקים של ממד ננומטר להקל על המעבר בדרך נשימת דיסטלי. כדי להשיג מטרה זו, הסכום של DS בשימוש בתכשיר זה הוא בעודף של CS (יחס משקל 3: 1); וגבוה מולקולרי משקל-DS (MW משקל הממוצע 500,000) ומשקל מולקולרי נמוך CS (טווח MW 50-190 kDa, 75-85% deacetylated) משמש.

SDF-1α הוא גורם ביות של תאי גזע, אשר מפעיל את פונקצית הביות באמצעות פעילות chemotactic. SDF-1α ממלאים תפקיד חשוב בביות ותחזוקה של תאי גזע hematopoietic במח העצם, ובגיוס של progeתאי nitor לרקמה ההיקפית ^ל4,5 תיקון פציעה. יש SDF-1α אתר מחייב הפרין ברצף החלבון שלה, המאפשר לחלבון להיקשר להפרין / הפאראן גופרתי, הדימרים צורה, להיות מוגן מפני פרוטאז (CD26 / DPPIV) איון, ואינטראקציה עם תאי מטרה באמצעות קולטנים בתא השטח ^6-8. יש DS תכונות מבניות דומות להפרין / הפאראן גופרתי; כך, המחייב של SDF-1α לDS יהיה דומה לזה של ligands פולימרים הטבעי שלה.

בפרוטוקול הבא, אנו מתארים את ההכנה של ננו-חלקיקי SDF-1α-DS-CS. הנהלים מייצגים את אחד הניסוחים שנחקרו בעבר ^9. הפרוטוקול מותאם במקור מחקירה של חלקיקי VEGF-DS-CS ^10. הכנה בקנה מידה קטנה מתוארת, אשר ניתן לשנותם בקלות עם אותו פתרונות המניות ותנאי הכנה. לאחר הכנה, החלקיקים מאופיינים בy בחינת גודלם, פוטנציאל זטה, התאגדות SDF-1α מידה, במבחנה זמן שחרור, ופעילות של SDF-1α המשולבים.

Protocol

1. הכנת SDF-1α סוכרי חלקיקים

בשל צורך משלוח in vivo, לעקר את כל המכולות, טפטפות, וטיפים לשימוש בתכשיר.

1. הכן את פתרונות המניות הבאות בultrapure מים: 1% סולפט dextran; 1 M NaOH (סטרילי מסונן עם קרום PES); chitosan 0.1% 0.2% בחומצה אצטית קרחונית (מסנן דרך 0.8 ו0.22 מיקרומטר מסננים ברציפות ולהתאים את ה- pH 5.5 עם NaOH לאחר מכן); 0.1 M ₄ ZnSO; מניטול 15%; ו0.92 מ"ג / מיליליטר SDF-1α (מאוחסנים בaliquots על 80 מעלות צלזיוס, ושמרו על 4 מעלות צלזיוס מופשרים פעם אחת).
2. לעקר פתרונות מניות באמצעות 0.22 מיקרומטר ממברנות סינון. להעריך את רמות רעלן פנימיות בפתרון מוכן עם assay lysate amebocyte Limulus קריש ג'ל (LAL). ודא שהרמות הן <0.06 איחוד אירופי / מיליליטר.
3. להוסיף 0.18 מיליליטר מים ultrapure לבקבוקון זכוכית 1.5 מיליליטר מכיל בר ומערבבים מגנטי. קבע את המהירות ומערבבים ב 800 סל"ד. להוסיף 0.1 מיליליטר 1%סולפט וdextran מערבב במשך 2 דקות. להוסיף SDF-1α 0.08 מ"ג (0.087 מיליליטר של 0.92 מ"ג / מיליליטר SDF-1α פתרון) ומערבבים במשך 20 דקות.
4. להוסיף 0.33 מיליליטר 0.1% dropwise chitosan ומערבבים במשך 5 דקות. מהירות שינוי ומערבבים עד למקסימום ולהוסיף 0.1 מיליליטר 0.1 M ₄ ZnSO לאט עם מזרק 0.1 מיליליטר (מעל 1 דקות).
5. לחזור במהירות ומערבבים עד 800 סל"ד ומערבבים למשך 30 דקות. להוסיף מניטול 0.4 מיליליטר של 15% ומערבבים במשך 5 דקות. מעביר את תערובת התגובה לצינור 1.5 מיליליטר microfuge. צנטריפוגה ב16,000 XG ב 4 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות.
   הערה: הנוכחות של מניטול מאפשרת resuspension של החלקיקים לאחר צנטריפוגה. בהתאם לקומפקטיות של גלולה, ריכוז מניטול יכול להיות מגוון בין 0% ל -5%. resuspension המלא של החלקיקים לאחר כל צנטריפוגה הוא קריטי כדי למנוע אגרגטים בהשעיה הסופית.
6. לשאוב supernatant ולהשתמש פיפטה להסיר את הטיפה האחרונה של נוזל לאט. להוסיף מניטול 0.2 מיליליטר 5%. להשעות את גלולה עם 0.5 מיליליטר, לבית 29 Gמזרק DLE. להוסיף מניטול 1 מיליליטר של 5%. צנטריפוגה XG ב 16,000 במשך 15 דקות.
7. חזור על שלב 1.6.
8. לשאוב supernatant. Resuspend גלולה במניטול 0.2 מיליליטר 5%. אחסן את ההשעיה החלקיקים ב 4 מעלות צלזיוס.
   הערה: ההשעיה החלקיקים יכולה גם להיות מאוחסנת קפוא ב -80 ° C או lyophilized. מניטול 5% כולל בהשעיה הוא חיוני כדי למנוע הצטברות של החלקיקים לאחר ההקפאה והפשרה או אחרי lyophilization והתייבשות. מניטול ניתן להסיר על ידי צנטריפוגה של ההשעיה לאחר האחסון.

2. מדידה של גודל חלקיקים ופוטנציאל זטה

גודל החלקיקים ופוטנציאל זטה מנותחים על ידי פיזור אור דינמי ופיזור אור electrophoretic, בהתאמה, עם נתח של חלקיקים שצוין ברשימת חומר.

1. להגדיר את הפרמטרים הבאים למדידת גודל חלקיקים: פעמים צבירה: 70; פעמים חוזרות: 4; טמפרטורה: 25 ° C;Diluent: מים; התאמת עוצמת: אוטומטי.
2. לדלל את מדגם SDF-1α-DS-CS עם מים (דילול של פי 10). לטעון של המדגם לקובט UV חד פעמי 100 μl כגון קובט אפנדורף. הכנס את קובט לתוך מחזיק התא. חכה להתאמת עוצמת להגיע "אופטימום" (~ 10,000 CPS). התחל רכישת נתונים.
3. לאחר המדידה תושלם, תרשום את תוצאות cumulants של קוטר (ננומטר) ומדד polydispersity. ממוצע התוצאות שהתקבלו מכל אחד 4 הקריאות החוזרות ולחשב את סטיית התקן.
4. עומס 500 μl של מדגם חלקיקים בדילול של פי 10 לתא זרימה למדידת פוטנציאל זטה. להגדיר את הפרמטרים הבאים למדידה: פעמים צבירה: 10; פעמים חוזרות: 5; טמפרטורה: 25 ° C; Diluent: מים; התאמת עוצמת: אוטומטי. רשום את התוצאות של פוטנציאל זטה (mV). ממוצע התוצאות המתקבלות מכל אחד 5 קריאות חוזרות ונשנות, ולחשב את deviatio הסטנדרטיn.

3. כימות של SDF-1α בחלקיקים

1. לדלל צורת SDF-1α חופשיות לריכוזים של 0.01, 0.02, 0.03, 0.04, 0.05 ומ"ג / מיליליטר במאגר מדגם 1.3x Laemmli. לדלל דגימות SDF-1α-DS-CS 6 μl עם 1.3x 40 μl חיץ מדגם Laemmli. (הכן את חיץ מניית 4x Laemmli מכיל 0.25 M טריס-HCl, pH 7.5, 8% SDS, גליצרול 40%, 0.05 מ"ג / 8% 2-mercaptoethanol מיליליטר bromophenol כחול, ו. מחלקים את פתרון המניות לתוך aliquots הקטן ולשמור ב -20 ° C לשימוש יחיד.)
2. מחממים את הדגימות ב 100 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות. מערבולת הדגימות פעמיים (כל אחד במשך 10 שניות במהירות המרבית) בזמן חימום 10 דקות על מנת לנתק את החלקיקים לחלוטין. לצנן את הדגימות לRT למשך 2 דקות. צנטריפוגה ב10,000 XG ל0.5-1 דקות כדי להפיל את עיבוי המים. מערבולת שוב לערבב היטב.
   הערה: בשלב זה, פתרון המדגם צריך להיות ברור שאין הווה משקע גלוי.
3. טען 10 ו# 181; l מדגם / גם לג'ל SDS 4-20%. הפעל אלקטרופורזה ב 200 V עבור 20 דקות. כתם ג'ל עם כתם חלבון הכחול Coomassie.
4. לבחון את צפיפות להקת חלבון של SDF-1α באמצעות תוכנת תרמי וניתוח צפיפות מולקולרית. לחשב את כמות SDF-1α בחלקיקים נגד עקומת סטנדרט נבנתה בסטנדרטים SDF-1α חופשיים.

4. במבחנת השחרור Assay

1. לערבב חלקיקי סוכרי SDF-1α עם פוספט שנאגרו מלוח של Dulbecco ללא סידן ומגנזיום (D-PBS) בשעה 1: 1 (V / V).
2. מחלקים את ההשעיה החלקיקים לתוך 0.05 aliquots מיליליטר ב 1.5 מיליליטר צינורות. טען את הדגימות לתחתית הצינורות. הימנע החדרת בועות אוויר או להפריע את פני השטח של הנוזל. לאטום את חלקו העליון של הצינורות עם Parafilm.
   הערה: בכך, הנוזל יישאר בתחתית בסיבוב העליון לתחתון שלאחר מכן על מיקסר הצינור.
3. סובב את הצינורות על 37 ו# 176; C במיקסר מיקרו-Tube סיבוב. הסר aliquots מהצינורות במועדים המיועדים צנטריפוגות מייד הדגימות ב16,000 XG במשך 10 דקות ב 4 ° C.
4. הפרד את supernatants וכדורים, ולשקם את הכדור עם 0.05 מיליליטר D-PBS. אחסן את הדגימות ב -20 ° C. אחרי הכל הדגימות שנאספו, לבחון את supernatants וכדוריות על ג'ל SDS כפי שתואר לעיל.

5. ההגירה Assay

assay זה מודד את פעילות chemotactic של SDF-1α. אינטראקציה של SDF-1α עם קולטה (CXCR4) על פני התא גורמת להגירה של התא לכיוון שיפוע SDF-1α. ב assay זה, התאים נטענים לתוך היטב עליון (מופרד על ידי קרום semipermeable מנמוך גם) פתרון וSDF-1α לנמוכים גם.

1. לדלל SDF-1α (חינם או בצורה מאוגדת חלקיק) עם חיץ הגירה (בינוני RPMI-1640 המכילים 0.5% אלבומין בסרום שור) ב3-FOדילול סדרתי ld לריכוזים סופיים של 100, 33, 11, 3.7, 1.2, 0.41, 0.14, 0.05 וng / ml.
2. להוסיף 0.6 מיליליטר של פתרון SDF-1α המדולל או חיץ הגירה (בקרה שלילית) רק כדי גם בצלחת 24 גם. הוסף חוצץ הגירה 0.57 מ"ל לטוב (שליטת תא קלט). לדגור על 37 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. הנח להכניס את תרבות תא חדירה כגון Transwell (גודל נקבובית 5 מיקרומטר, בקוטר 6.5 מ"מ) על גבי נמוך גם. טען 0.1 מיליליטר תאי Jurkat (5 × 10 ⁵⁾ לTranswell להכניס. לטעון 0.03 מיליליטר תאים ישירות לשליטת תא הקלט היטב. דגירה את הצלחת על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 2 ב5% CO ₂ באינקובטור.
3. הסר את מוסיף Transwell. העבר את התאים שהגרו לבארות התחתונות לצינור קלקר 4 מיליליטר. ספירת התאים נדדו עם cytometer זרימה.
4. לחשב הגירה כאחוז ממספר תאי קלט (מספר תאים בשליטת תא הקלט היטב x 100/30) לאחר החיסור של המספרים בnegative פקדים (תאים היגרו לבארות המכילות מאגר הגירה בלבד).

תוצאות

פוטנציאל הגודל וzeta של חלקיקי SDF-1α-DS-CS מוכנים נקבעים עם מנתח חלקיקים. איור 1 מציג את הניתוח של מדידת הגודל. מהתוצאות שהתקבלו מcumulants ארבע מדידות חוזרות, הקוטר הידרודינמית הממוצע של חלקיקי SDF-1α-DS-CS הוא 661 ± 8.2 (ננומטר) וpolydispersity הוא 0.23 ± 0.02. התוצאה של מדידת פוטנציאל ז?...

Discussion

כפי שצוין לעיל, נוצרים חלקיקי DS-CS באמצעות נטרול מטען בין polyanion (DS) וpolycation מולקולות (CS). מאז האינטראקציה תשלום מתרחשת בקלות במהלך ההתנגשות המולקולרית, הריכוז של פתרונות הפולימר ומהירות ערבוב במהלך הערבוב הוא קריטי לגודל של החלקיקים שנוצר. מגמה כללית היא שיותר מדוללת פת?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Dextran sulfate	Fisher	BP1585-100
Chitosan, low molecular weight	Sigma	448869
Zinc sulfate heptahydrate	Sigma	204986
D-Mannitol	Sigma	M9546
UltraPure water	Invitrogen	10977-023
SDF-1α	Prepared according to reference 8.
Syringe filter, PES membrane 0.22 μm	Millipore	SLGP033RS
Magnetic Micro Stirring Bars (2 x 7 mm)	Fisher	14-513-63
Glass vial Kit; SUN-SRi	Fisher	14-823-182
Delsa Nano C Particle Analyzer	Backman Coulter
Eppendorf UVette Cuvets	Eppendorf	952010069
4–20% Mini-PROTEAN TGX Gel	Bio-Rad	456-1096
GelCode Blue Safe Protein Stain	Fisher	PI-24592
Molecular Imager VersaDoc MP 4000 System	BioRad	170-8640
Corning Transwell Permeable Supports	Corning	3421
Accuri C6 Flow Cytometer	BD Biosciences
Dulbecco’s phosphate buffered saline	Sigma	D8537
Pyrogent plus kit	Fisher	NC9753738