بروتوكول بسيطة وسريعة لغير إنزيمي فصل الطازجة الأنسجة البشرية لتحليل التسلل اللمفاويات

Summary

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45⁺ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Abstract

يتم قبول قدرة الخلايا الخبيثة للتهرب من الجهاز المناعي، ويتميز ورم الهروب من كل من الاستجابات المناعية الفطرية والتكيفية، والآن باعتبارها السمة المميزة مهمة من السرطان. أبحاثنا حول سرطان الثدي يركز على الدور الفعال الذي تلعبه الورم تسلل الخلايا الليمفاوية في تطور الورم ونتائج المرضى. لتحقيق هذا الهدف، وضعنا منهجية لعزل السريع للخلايا اللمفاوية سليمة من الأنسجة العادية وغير العادية في محاولة لتقييمها الداني إلى حالتها الأصلية. الخليط أعدت باستخدام عرض dissociator الميكانيكية على حد سواء زيادة سلامة وخلية الانتعاش مع الحفاظ على مستقبلات سطح التعبير مقارنة الأنسجة هضمها انزيم ل. وعلاوة على ذلك، لم الهضم الأنزيمي من المواد غير القابلة للذوبان المتبقية لا يتعافى CD45 ⁺ خلايا إضافية تشير إلى أن القياسات الكمية والنوعية في جناسة الأساسي من المرجح أن تعكس بصدق تسلل مجموعات سكانية فرعية في fragm الأنسجةوالأنف والحنجرة. الخلايا اللمفاوية في هذه الخليط يمكن أن يكون بسهولة تتميز باستخدام المناعية (النمط الظاهري، والانتشار، وغيرها) أو الجزيئية (DNA، RNA و / أو البروتين) النهج. ويمكن أيضا خلايا CD45 ⁺ أن تستخدم لتنقية حيوانية، والتوسع في المختبر أو الحفظ بالتبريد. فائدة إضافية لهذا النهج هو أن طاف النسيج الأساسي من الخليط يمكن استخدامها لتوصيف ومقارنة السيتوكينات، كيموكينات، والمناعية المستضدات الموجودة في الأنسجة الطبيعية والخبيثة. وينبغي لهذه الوظائف البروتوكول بشكل جيد للغاية لأنسجة الثدي الإنسان وتكون قابلة للتطبيق لمجموعة واسعة من أنسجة طبيعية وغير طبيعية.

Introduction

The tumor microenvironment is composed of various cell types with numerous studies showing they each play distinct and important roles in tumorigenesis^1,2. These include, but are not limited to, infiltrating immune cells, stromal cells, endothelial cells and tumor cells³. Ex vivo studies of tumor infiltrating lymphocytes (TIL; CD45⁺ cells or leukocytes, which are predominantly lymphocytes in breast tumors) from fresh human tissue samples is made difficult by their low frequency, the small sample sizes often available for research and the potential for loss of viability during extraction. Because immune cells infiltrating tumors are usually present as passengers rather than permanent residents in general they are easier to release from the tissue matrix.

Dissociating tumor tissue while maintaining cellular integrity is technically challenging and has traditionally been performed using a combination of mechanical and enzymatic steps to prepare single cell suspensions^4-8. This approach involves lengthy incubation periods and is associated with a significant reduction in cell viability as well as the loss of cell surface receptors by enzymatic cleavage. High quality flow cytometric studies characterizing TIL in the tumor microenvironment as well as clean purifications of CD45⁺ subpopulations by flow cytometry or antibody-coated beads are more difficult to achieve from enzyme-digested tumor tissue. In addition, the supernatant (SN) from the resulting tumor homogenate is not amenable to further analysis including quantification of secreted proteins (cytokines, chemokines, immunoglobulins or tumor antigens) or experimental treatment of normal cells, because of the potential for protein degradation in the enzymatic digests.

In our search for a method to prepare single cell homogenates from breast tissues [including tumor, non-adjacent non-tumor (NANT) and normal (from mammary reductions) breast tissues] without enzymatic digestion, we tested a variety of mechanical homogenization techniques. Homogenates prepared using a mechanical dissociator had increased cell viability (2-fold) and total cell recovery (2-fold) while preserving surface receptor expression. Enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45⁺ cells suggesting they were all released in the initial homogenate. Thus, this rapid and simple approach allows both qualitative and quantitative assessment of the CD45⁺ subpopulations present in various normal and malignant human tissues. An added advantage of this approach is that the SN from the initial homogenate (primary tissue SN) can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Protocol

ملاحظة: تم الحصول على جميع العينات باستخدام بروتوكول افقت عليها لجنة الأخلاقيات الطبية من معهد جول بورديه مع الموافقة المسبقة الخطية التي تم الحصول عليها من كل مريض.

1. إعداد جناسة الأنسجة

1. تشريح الأنسجة مقطوعة (الأنسجة الخبيثة وطبيعية مقطوعة من غرفة العمليات) هي في مختبر علم الأمراض من قبل موظفين مدربين لبيك اب فوري. الورم، NANT (تؤخذ هذه المسافة ابعد من الورم ممكن) وتتم معالجة شظايا الأنسجة الطبيعية بشكل روتيني ضمن 1 - 3 ساعة من الاستئصال الجراحي في مختبر BSL2 باستخدام إجراءات موحدة لالأنسجة البشرية السلامة الأحيائية. ويتضح مخطط تدفق بروتوكول في الشكل 1.
2. تزن كل أجزاء الأنسجة (عادي، NANT وورم) وقياس الطول والعرض، والارتفاع (الطول × العرض × الارتفاع). هذا هو خطوة هامة لتطبيع احق من القطعان الخلية، والحمض النووي الريبي المستخرج، الخ
   NOTE: مجموعة من حجم العينة هو 100 إلى 10،000 مم ³ مع عدم وجود الدهون إذا أمكن ذلك.
3. بصمة جزء الورم على شريحة زجاجية لH & E تلطيخ للتحقق من أن الأنسجة هي في الواقع جزء من الورم.
   1. القيام بذلك عن طريق الضغط على المجهر شريحة زجاجية على جزء الورم وتطبيق ضغط لطيف مع أصابعك لبضع ثوان.
   2. إصلاح الشريحة مع الأيزوبروبانول لمدة 2 دقيقة تليها خطوة الغسيل في الماء. مباين الأنسجة لمدة 30 ثانية مع الهيماتوكسيلين ماير.
   3. غسل الشريحة في ستة حمامات من الماء. وصمة عار في فلوكسين B 2٪ لمدة 15 ثانية.
   4. يغسل في حمام من الماء تليها أربع حمامات الأيزوبروبانول والنهاية مع حمام واحد من الماء.
   5. احتضان في الأيزوبروبانول لمدة 1 دقيقة، واستنزاف. واضح في اثنين من حمامات الزيلين.
   6. جبل مع الزيلين مقرها المتوسطة المتزايدة. دراسة لالخلوية الورم (الشكل 2).
      ملاحظة: في المقام الأول، وخلايا الورم العصا إلى الشريحة مطبوع - واللحمية، اللمفاوية أو إعلاننادرا ما تبقى ipose خلايا، وترك فراغات بين الخلايا السرطانية (الشكل 2).
4. وضع جزء الأنسجة في طبق ثقافة صغير يحتوي على 1 مل من يعرف كيميائيا، وخالية من مصل المتوسطة خلية المكونة للدم (المشار إليها فيما يلي باسم المتوسطة) في درجة حرارة الغرفة والزهر ذلك الى قطع صغيرة (~ 1 - 2 مم ²⁾ باستخدام العقيمة مشرط.
5. نقل كل شيء (شظايا الأنسجة + متوسطة) إلى الميكانيكي أنبوب dissociator C.
6. شطف طبق بيتري ومشرط مع 2 مل من المتوسط ​​باستخدام ماصة باستور وإضافة ذلك إلى C أنبوب (حجم متوسط ​​لتفارق = 3 مل).
7. استخدام A.01 برنامج dissociator الميكانيكية للأنابيب C (البرنامج الأكثر لطيف) إلى التجانس شظايا الأنسجة في تعليق خلية واحدة. وضع أنبوب C في الجهاز وتشغيل البرنامج مرتين على التوالي (دورة واحدة = 25 ثانية).
   ملاحظة: تم إنشاء هذا الإجراء التجانس والتحقق من صحتها لنسيج الثدي الإنسان، توم أخرىأو الأنسجة أو أنواع قد تحتاج إلى استخدام برنامج مختلف، وينبغي أن يتم اختبارها أولا.
8. إزالة أنبوب C من أجهزة وصب جناسة مباشرة الى مصفاة الخلية 40 ميكرومتر جالسا على أنبوب 50 مل. باستخدام نفس ماصة باستور كما في الخطوة 1.6، ونقل أي السائل المتبقي في الأنبوب C إلى مصفاة الخلية.
9. نقل السائل المصفى في أنبوب 15 مل باستخدام 1 مل ممص مكروى طرف. مؤقتا حفاظ على مصفاة الخلية وأنبوب 50 مل به.
10. شطف أنبوب C مع 3 مل إضافية متوسطة ونقل هذا، مرة أخرى باستخدام نفس ماصة باستور كما في الخطوة 1.6، إلى مصفاة الخلية لا يزال جالسا على أنبوب 50 مل. يسجل أكبر قدر ممكن من السائل المتبقي المحاصرين في الأنسجة unhomogenized في أنبوب 50 مل عن طريق تحريك برفق حول مصفاة مع ماصة باستور نظيفة أو 1 مل غيض أن يتم طرح بعد ذلك بعيدا لتجنب تلويث شطافة.
11. وضع مصفاة الخلية رأسا على عقب على رانه أنبوب C الأصلي وشطف مع 3 مل من المتوسط ​​بحيث تنخفض الأنسجة unhomogenized مرة أخرى في أنبوب C.
12. إعادة التجانس كما في الخطوة 1.7 لدورتين للبرنامج A.01.
13. صب هذا جناسة الثاني من خلال مصفاة الخلية يجلس على أنبوب 50 مل، وشطف أنبوب C مرة أخرى مع 3 مل المتوسطة (كما في الخطوة 1.10) ونقل مع ماصة باستور لمصفاة الخلية يجلس على أنبوب 50 مل الضغط مرة أخرى كحد أقصى كمية السائل من النسيج الضام المتبقية المحاصرين في مصفاة الخلية.
14. في هذه المرحلة، وبلغ حجم التداول ~ 2.5 مل في أنبوب 15 مل و~ 9 مل في أنبوب 50 مل.

2. فصل طاف الأنسجة والخلايا

1. الطرد المركزي الخليط في 15 مل و 50 مل أنابيب لمدة 15 دقيقة في 600 XG في درجة حرارة الغرفة.
2. صب SN من أنبوب 15 مل في أنبوب نظيفة وتخزين مؤقتا في 4 درجات مئوية. هذا طاف = الورم الرئيسي، NANT أو منظمة الشفافية الدولية العاديةوأوضح ssue SN (الحجم النهائي 2.5 مل) في وقت لاحق وaliquoted قبل التخزين في -80 درجة مئوية لمدة التحليلات المستقبلية (انظر أدناه).
3. تجاهل طاف من أنبوب 50 مل.
4. و resuspend بلطف كل من الكريات خلية في الحجم النهائي من 1 مل المتوسطة. لفترة وجيزة، أولا كسر بلطف بيليه الخلية في كل من أنابيب (من خلال الاستفادة من أنبوب على سطح صلب). resuspend الكرية خلية فضفاض في 50 مل مع 500 ميكرولتر من المتوسطة ونقل هذا التعليق الخلية في أنبوب 15 مل ل resuspend بيليه الثاني. كرر هذه الخطوة مرة واحدة مع الثانية 500 ميكرولتر من المتوسطة لاسترداد الحد الأقصى من الخلايا.
5. نقل 10 ميكرولتر من تعليق خلية إلى أنبوب صغير، مع مزيج 10 ميكرولتر من اللون الأزرق التريبان (التخفيف 1: 1) وحساب عدد خلايا قابلة للحياة باستخدام عدادة الكريات.
   ملاحظة: عند هذه النقطة جزء من تعليق الخلية كما يمكن تحليلها من قبل التدفق الخلوي لتقييم حجم الخلية، تحبب وإذا رغبت في عدد محدود من علامات حيوانية لمزيد من PRECتقييم ايسي لتوزيع الخلية النسبي في جناسة قبل تحليل مستفيض أو التجريب. كل التحليلات التي التدفق الخلوي تتضمن وضع العلامات CD45 للتطبيع المجموعات السكانية الفرعية.
6. بيليه الخلايا بواسطة الطرد المركزي في 300 x ج لمدة 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. خلايا من الورم، NANT، أو الأنسجة الطبيعية جاهزة الآن لمزيد من التنقية أو التحليل. هذه الخطوات الإضافية هي أفضل عندما تجرى على نفس يوم الجراحة.
   ملاحظة: للحصول على تحليل تدفق cytometric ولكن ليس الفرز الخلية خلايا الدم الحمراء المتبقية يجب هي lysed بعد وضع العلامات الأجسام المضادة عن طريق إضافة 0.4 مل من الدم الحمراء العازلة تحلل الخلية إلى خلية بيليه، vortexing لالفور ل1 ثانية واحتضان ما لا يقل عن 10 دقيقة في غرفة درجة الحرارة (محمية من الضوء) قبل التحليل.

3. توضيح طاف الأنسجة

1. الطرد المركزي 1.5 مل أنابيب مع SN الأنسجة في 15،000 x ج لمدة 15 دقيقة على 4 درجات مئوية.
2. إزالة بعناية رانه طاف دون لمس أو إزعاج بيليه. نقل إلى أنبوب نظيفة (أو أنابيب) تبعا لعدد وحجم مأخوذة المطلوب.
3. تخزين طاف في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل.

4. الدم المرضى

1. جمع عينة الدم من كل مريض كعنصر تحكم من قبل بزل الوريد إلى أنابيب heparinized اليوم قبل الجراحة. أجهزة الطرد المركزي الدم في 400 x ج لمدة 10 دقيقة في 20 درجة مئوية مع قبالة الفرامل للحصول على البلازما ومعطف الشهباء.
2. إزالة البلازما وتوضيح ذلك بواسطة الطرد المركزي عند 10،000 x ج لمدة 15 دقيقة في 20 درجة مئوية. قسامة وتخزين البلازما في -80 درجة مئوية لاستخدامها في المستقبل. تمييع معطف الشهباء في المتوسط
3. فصل الخلايا وحيدة النواة باستخدام معيار-ficoll hypaque التدرج الطرد المركزي قبل التحليل الفوري، حيوانية العزلة، DNA / RNA / استخراج البروتين أو الحفظ بالتبريد.

5. التدفق الخلوي

1. خلايا التسمية وفقا لتصنيعتعليمات آر في 4 درجات مئوية، محمية من الضوء. ليز خلايا الدم الحمراء في تعليق خلية من شظايا الأنسجة بعد وضع العلامات الأجسام المضادة عن طريق إضافة 0.4 مل من خلية تحلل العازلة لبيليه الخلية.
2. دوامة فورا ل1 ثانية واحتضان ما لا يقل عن 10 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، محمية من الضوء. تمرير الخلايا المسمى في تدفق عداد الكريات للحصول على البيانات دون غسل.

النتائج

الهضم الأنزيمي من شظايا الأنسجة مع أي من الحلول المتاحة تجاريا تفارق الأنسجة أو مخاليط مختبر مختلفة من كولاجيناز، الدناز و / أو مثبطات هيالورونيداز، يلتصق مجموعة واسعة من المستقبلات على سطح الخلايا. لدينا دراسات، ركزت في البداية على خلايا CD4 ⁺ T التسلل أورام الث...

Discussion

توضح هذه الدراسة طريقة الأمثل لإعداد السريع من الخليط أنسجة الثدي العادية والخبيثة دون الهضم الأنزيمي للفرز لاحق الخلية، والاستخراج، والحفظ بالتبريد و / أو تحليل المظهري من CD45 ⁺ القطعان. والهدف من هذا النهج التجريبي لإنتاج صور للسمسم التي تعكس بشكل وثيق دولتهم...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber	Marienfield	640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain
VersaLyse	Beckman Coulter	A09777	for flow cytometry experiments
Fixable viability Dye eFluor 780	eBioscience	65-0865-14	for flow cytometry experiments
anti-CD3 FITC	BD Biosciences	345763	for flow cytometry experiments
anti-CD3 Vio Blue	Miltenyi Biotec	130-094-363	for flow cytometry experiments
anti-CD4 PE	BD Biosciences	345769	for flow cytometry experiments
anti-CD4 APC	Miltenyi Biotec	130-091-232	for flow cytometry experiments
anti-CD8 ECD	Beckman Coulter	737659	for flow cytometry experiments
anti-CD8 PerCP	BD Biosciences	345774	for flow cytometry experiments
anti-CD19 APC-Vio770	Miltenyi Biotec	130-096-643	for flow cytometry experiments
anti-CD45 VioGreen	Miltenyi Biotec	130-096-906	for flow cytometry experiments