Um protocolo simples e rápido para não enzimática Separar frescos Tecidos Humanos para a Análise de infiltrar Linfócitos

Resumo

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45⁺ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Resumo

A capacidade das células malignas para evadir o sistema imune, caracterizado por escape do tumor a partir de ambas as respostas imunes inatas e adaptativas, é agora aceite como uma característica importante do cancro. Nossa pesquisa sobre câncer de mama centra-se no papel ativo que os linfócitos tumor infiltrando desempenhar na progressão do tumor e evolução de pacientes. Com esse objetivo, foi desenvolvida uma metodologia para o rápido isolamento de células linfóides intactas de tecidos normais e anormais em um esforço para avaliá-los próximo ao seu estado natal. Homogeneizados preparados utilizando um show Dissociator mecânica tanto maior recuperação e viabilidade celular, preservando a expressão do receptor de superfície em comparação tecidos para enzima-digerida. Além disso, a digestão enzimática do material insolúvel restante não recuperou células adicionais CD45 ^+, indicando que as medidas quantitativas e qualitativas no homogeneizado primária provável genuinamente refletem infiltrando as subpopulações no fragm tecidoent. As células linfóides em homogenatos estes podem ser facilmente caracterizadas utilizando imunológica (fenótipo, proliferação, etc.) ou molecular (DNA, RNA e / ou proteína) se aproxima. As células CD45 ⁺ pode também ser utilizado para a purificação subpopulação, expansão in vitro ou de criopreservação. Um benefício adicional desta abordagem é que o sobrenadante de tecido primário a partir dos homogeneizados podem ser utilizados para caracterizar e comparar as citocinas, quimiocinas e imunoglobulinas, antigénios presentes em tecidos normais e malignos. Este funções de protocolo extremamente bem para tecidos mamários humanos e deve ser aplicável a uma grande variedade de tecidos normais e anormais.

Introdução

The tumor microenvironment is composed of various cell types with numerous studies showing they each play distinct and important roles in tumorigenesis^1,2. These include, but are not limited to, infiltrating immune cells, stromal cells, endothelial cells and tumor cells³. Ex vivo studies of tumor infiltrating lymphocytes (TIL; CD45⁺ cells or leukocytes, which are predominantly lymphocytes in breast tumors) from fresh human tissue samples is made difficult by their low frequency, the small sample sizes often available for research and the potential for loss of viability during extraction. Because immune cells infiltrating tumors are usually present as passengers rather than permanent residents in general they are easier to release from the tissue matrix.

Dissociating tumor tissue while maintaining cellular integrity is technically challenging and has traditionally been performed using a combination of mechanical and enzymatic steps to prepare single cell suspensions^4-8. This approach involves lengthy incubation periods and is associated with a significant reduction in cell viability as well as the loss of cell surface receptors by enzymatic cleavage. High quality flow cytometric studies characterizing TIL in the tumor microenvironment as well as clean purifications of CD45⁺ subpopulations by flow cytometry or antibody-coated beads are more difficult to achieve from enzyme-digested tumor tissue. In addition, the supernatant (SN) from the resulting tumor homogenate is not amenable to further analysis including quantification of secreted proteins (cytokines, chemokines, immunoglobulins or tumor antigens) or experimental treatment of normal cells, because of the potential for protein degradation in the enzymatic digests.

In our search for a method to prepare single cell homogenates from breast tissues [including tumor, non-adjacent non-tumor (NANT) and normal (from mammary reductions) breast tissues] without enzymatic digestion, we tested a variety of mechanical homogenization techniques. Homogenates prepared using a mechanical dissociator had increased cell viability (2-fold) and total cell recovery (2-fold) while preserving surface receptor expression. Enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45⁺ cells suggesting they were all released in the initial homogenate. Thus, this rapid and simple approach allows both qualitative and quantitative assessment of the CD45⁺ subpopulations present in various normal and malignant human tissues. An added advantage of this approach is that the SN from the initial homogenate (primary tissue SN) can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Protocolo

NOTA: Todos os espécimes foram adquiridos através de um protocolo aprovado pelo Comitê de Ética Médica do Instituto Jules Bordet com consentimento informado por escrito obtido de cada paciente.

1. Preparação do homogenato de tecido

1. Dissecar tecidos ressecados (tecido maligno e normal ressecado da sala de cirurgia) estão no laboratório de patologia por pessoal treinado para a coleta imediata. Tumor, NANT (tomado a maior distância possível do tumor) e fragmentos de tecidos normais são rotineiramente processados ​​dentro de 1-3 horas de excisão cirúrgica em um laboratório BSL2 utilizando procedimentos de biossegurança padrão para os tecidos humanos. Um diagrama de fluxo do protocolo é ilustrada na Figura 1.
2. Pesar todos os fragmentos de tecido (normal, NANT e tumorais) e medir o comprimento, largura e altura (comprimento x largura x altura). Este é um passo importante para a posterior normalização de subpopulações de células, RNA extraído, etc.
   NOTE: A gama de tamanho da amostra é de 100 a 10.000 ^mm3, sem gordura, se possível.
3. Imprimir o fragmento de tumor numa lâmina de vidro para H & E coloração para verificar se o tecido é realmente parte do tumor.
   1. Faça isso pressionando uma lâmina de microscópio de vidro sobre o fragmento de tumor e aplicar uma leve pressão com os dedos por alguns segundos.
   2. Corrigir o diapositivo com isopropanol durante 2 min, seguido por um passo de lavagem em água. Contracorante o tecido durante 30 segundos com hematoxilina de Mayer.
   3. Lave o slide em seis banhos de água. Mancha em Floxina B 2% por 15 segundos.
   4. Lave em um banho de água, seguido de quatro banhos de isopropanol e terminar com um banho de água.
   5. Incubar em isopropanol, durante 1 min e de drenagem. Limpar em dois banhos de xileno.
   6. Montar com meio de montagem com base xileno. Examinar para a celularidade do tumor (Figura 2).
      NOTA: Principalmente, as células tumorais ficar com o slide impressa - o estroma, linfóide ou adipose células permanecem raramente, deixando espaços entre as células de tumor (Figura 2).
4. Inserir o fragmento de tecido em um pequeno prato de cultura contendo 1 mL de o, meio de células hematopoiéticas isento de soro quimicamente definido (daqui em diante referido como meio) à temperatura ambiente e corte em pedaços pequenos (~ 1 - 2 mm ^2), utilizando um filtro estéril bisturi.
5. Transfira tudo (fragmentos de tecido + média) para um tubo de Dissociator C mecânica.
6. Lavar a placa de Petri e bisturi com 2 ml de meio com uma pipeta de Pasteur e adicionar este ao tubo C (volume de meio de dissociação = 3 ml).
7. Use a A.01 programa Dissociator mecânica para tubos C (o programa mais suave) para homogeneizar os fragmentos de tecido em uma suspensão de células individuais. Colocar o tubo C no aparelho e executa o programa de duas vezes em sucessão (um ciclo = 25 seg).
   NOTA: Este procedimento homogeneização foi estabelecido e validado para o tecido mamário humano, outro tumou ou tecido tipos pode precisar usar um programa diferente e deve ser testado pela primeira vez.
8. Remover o tubo C do aparelho e decanta-se o homogeneizado directamente para um filtro de células de 40 mm assentado em um tubo de 50 ml. Usando a mesma pipeta de Pasteur, como na etapa 1.6, transferir qualquer líquido remanescente no tubo C para o coador de células.
9. Transferir o líquido filtrado para um tubo de 15 ml utilizando uma ponta de micropipeta 1 ml. Temporariamente manter o filtro de células e o seu tubo de 50 ml.
10. Lavar o tubo C com um adicional de 3 ml de meio e transferir este, de novo usando a mesma pipeta de Pasteur, como na etapa 1.6, para o filtro de células ainda sentado no tubo de 50 ml. Esprema um montante máximo do líquido residual preso no tecido unhomogenized para dentro do tubo de 50 ml, movendo-a suavemente ao redor do filtro com uma pipeta Pasteur limpa ou 1 ml dica que é posteriormente jogado fora para evitar a contaminação do fluido.
11. Coloque o filtro de células de cabeça para baixo em tele tubo original C e enxagua-se com 3 ml de meio de modo que o tecido unhomogenized cai de volta para dentro do tubo C.
12. Re-homogeneizar como no passo 1.7 para dois ciclos do programa A.01.
13. Coloque esta segunda homogenato através do filtro de células sentado no tubo de 50 mL, enxaguar o tubo C de novo com 3 mL de meio (tal como no passo 1.10) e de transferência com a pipeta de Pasteur para o coador de células sentado no tubo de 50 ml novo apertando um máximo quantidade de líquido a partir do tecido conjuntivo residual preso no filtro celular.
14. Neste ponto, um volume de ~ 2,5 ml é no tubo de 15 ml e ~ 9 ml no tubo de 50 ml.

2. Separação do sobrenadante de células e tecidos

1. Centrifugar os homogeneizados em 15 mL e tubos de 50 ml durante 15 minutos a 600 xg à temperatura ambiente.
2. Decantar o SN do tubo de 15 ml para um tubo limpo e armazenar temporariamente a 4 ° C. Este sobrenadante = tumor primário, NANT ou ti normaisssue SN (volume final de 2,5 ml) é posteriormente clarificada e aliquotadas antes do armazenamento a -80 ° C para futuras análises (ver abaixo).
3. Descartar o sobrenadante do tubo de 50 ml.
4. Suavemente ressuspender ambos os peletes de células, num volume final de 1 ml de meio. Resumidamente, em primeiro lugar quebrar suavemente o sedimento de células em ambos os tubos (tocando o tubo sobre uma superfície dura). Ressuspender o sedimento de células soltas no 50 ml com 500 ul de meio e transferir esta suspensão celular para o tubo de 15 ml para ressuspender o sedimento de segundo. Repetir esta etapa uma vez com o segundo 500 ul de meio para a recuperação máxima de células.
5. Transferir 10 uL da suspensão de células para um pequeno tubo, misturar com 10 ul de azul de tripano (diluição 1: 1) e contar o número de células viáveis ​​utilizando um hemocitómetro.
   NOTA: Neste ponto, uma fracção da suspensão de células podem também ser analisados ​​por citometria de fluxo para avaliar o tamanho das células, granularidade e se desejado um número limitado de marcadores de subpopulação para mais precise avaliação da distribuição de célula relativa no homogeneizado antes da análise extensiva ou experimentação. Todas as análises por citometria de fluxo incorporar rotulagem CD45 para normalizar as subpopulações.
6. Agregar as células por centrifugação a 300 xg durante 10 min à temperatura ambiente. As células do tumor, NANT, ou tecido normal são agora pronta para purificação adicional ou análise. Estes passos adicionais são melhor quando realizada no mesmo dia que a cirurgia.
   NOTA: Para a análise de citometria de fluxo, mas não de separação de células dos glóbulos vermelhos residuais devem ser lisadas após marcação com anticorpos pela adição de 0,4 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos para a pelete de células, imediatamente vortex durante 1 seg e incubar um mínimo de 10 min a sala temperatura (protegido da luz), antes da análise.

3. Clarificação do sobrenadante Tissue

1. Centrifugar os tubos de 1,5 ml com SN tecido a 15.000 xg durante 15 min a 4 ° C.
2. Retire com cuidado tele sobrenadante sem tocar ou perturbar o sedimento. Transferir para um tubo limpo (ou tubos), dependendo do número e volume de alíquotas desejados.
3. Armazenar o sobrenadante a -80 ° C para uso futuro.

4. O sangue do paciente

1. Recolher uma amostra de sangue de cada paciente como um controlo por venipunctura para dentro de tubos heparinizados o dia antes da cirurgia. Centrifuga-se o sangue a 400 xg durante 10 min a 20 ºC, com o travão para se obter o plasma e um creme leucocitário.
2. Remover o plasma e esclarecer-o por centrifugação a 10.000 xg durante 15 min a 20 ºC. Alíquotas e armazenamento de plasma a -80 ° C para uso futuro. Diluir o creme leucocitário em meio
3. Separam-se as células mononucleares utilizando centrifugação em gradiente de padrão de Ficoll-Hypaque antes da análise imediata, isolamento subpopulação, / ARN de extracção de ADN / proteína ou de criopreservação.

5. Citometria de Fluxo

1. Células etiqueta de acordo com a produçãoinstruções de r, a 4 ° C, protegidos da luz. Lisar as células vermelhas do sangue em suspensões de células a partir de fragmentos de tecido após a marcação de anticorpos por adição de 0,4 ml de tampão de lise de células para a pelete de células.
2. Vortex imediatamente por 1 segundo e incubar um mínimo de 10 min à temperatura ambiente, protegida da luz. Passe as células marcadas em um citômetro de fluxo para aquisição de dados, sem lavar.

Resultados

A digestão enzimática de fragmentos de tecido, quer com soluções comercialmente disponíveis de dissociação de tecido ou várias misturas de laboratório de colagenase, ADNase e / ou inibidores de hialuronidase, clivar uma grande variedade de receptores na superfície das células. Os nossos estudos, inicialmente centrado sobre as células T CD4 ⁺ que infiltram os tumores de mama, foram rapidamente apresentados com um grande problema técnico, devido à clivagem dos receptores de CD4 de superfície util...

Discussão

Este estudo descreve um método otimizado para o preparo rápido de homogeneizados normais e malignas do tecido mamário, sem digestão enzimática para classificação subseqüente celular, extração, criopreservação e / ou análise fenotípica de CD45 ⁺ subpopulações. O objetivo dessa abordagem experimental é produzir imagens da TIL que refletem de perto seu estado in vivo e compará-los aos tecidos normais com mínima manipulação dos tecidos frescos da sala de cirurgia. Até o momento, o n...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber	Marienfield	640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain
VersaLyse	Beckman Coulter	A09777	for flow cytometry experiments
Fixable viability Dye eFluor 780	eBioscience	65-0865-14	for flow cytometry experiments
anti-CD3 FITC	BD Biosciences	345763	for flow cytometry experiments
anti-CD3 Vio Blue	Miltenyi Biotec	130-094-363	for flow cytometry experiments
anti-CD4 PE	BD Biosciences	345769	for flow cytometry experiments
anti-CD4 APC	Miltenyi Biotec	130-091-232	for flow cytometry experiments
anti-CD8 ECD	Beckman Coulter	737659	for flow cytometry experiments
anti-CD8 PerCP	BD Biosciences	345774	for flow cytometry experiments
anti-CD19 APC-Vio770	Miltenyi Biotec	130-096-643	for flow cytometry experiments
anti-CD45 VioGreen	Miltenyi Biotec	130-096-906	for flow cytometry experiments