Простой и быстрый протокол к неферментативно Диссоциируют Свежие тканей человека для анализа разведку в лимфоцитах

Резюме

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45⁺ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Аннотация

Способность опухолевых клеток, чтобы избежать иммунной системы, характеризующийся выхода опухоли с обеих врожденных и адаптивных иммунных ответов, в настоящее время принимается в качестве важной отличительной чертой рака. Наше исследование на рак молочной железы сосредотачивается на активной роли, что опухолевые проникновения лимфоциты играют в опухолевой прогрессии и результаты лечения. С этой целью мы разработали методику быстрого выделения интактных лимфоидных клеток от нормальных и аномальных тканей с целью оценки их вблизи их родного государства. Гомогенаты, полученные с использованием механического диссоциатора показывать обе повышенную жизнеспособность и клеток восстанавливаться при сохранении поверхностной экспрессии рецептора по сравнению с ферментом усваивается тканями. Кроме того, ферментативное расщепление оставшихся нерастворимого материала не восстановить дополнительные CD45 ⁺ клеток, указывающие, что количественные и качественные измерения в первичной гомогената вероятно, действительно отражают Проникнув субпопуляции в ткани ФрагмEnt. В лимфоидных клеток в этих гомогенатах может быть легко характеризуется использованием иммунологических (фенотип, пролиферацию и т.д.) или молекулярный (ДНК, РНК и / или белка) подходы. CD45 ⁺ клетки могут быть также использованы для очистки субпопуляций, расширение в пробирке или криоконсервации. Дополнительным преимуществом этого подхода является то, что первичный супернатант ткани из гомогенатов может быть использован для характеристики и сравнить цитокины, хемокины, иммуноглобулины и антигенов, присутствующих в нормальных и злокачественных тканей. Этот протокол функционирует очень хорошо для ткани молочной железы человека, а также должны быть применимы к широкому спектру нормальных и ненормальных ткани.

Введение

The tumor microenvironment is composed of various cell types with numerous studies showing they each play distinct and important roles in tumorigenesis^1,2. These include, but are not limited to, infiltrating immune cells, stromal cells, endothelial cells and tumor cells³. Ex vivo studies of tumor infiltrating lymphocytes (TIL; CD45⁺ cells or leukocytes, which are predominantly lymphocytes in breast tumors) from fresh human tissue samples is made difficult by their low frequency, the small sample sizes often available for research and the potential for loss of viability during extraction. Because immune cells infiltrating tumors are usually present as passengers rather than permanent residents in general they are easier to release from the tissue matrix.

Dissociating tumor tissue while maintaining cellular integrity is technically challenging and has traditionally been performed using a combination of mechanical and enzymatic steps to prepare single cell suspensions^4-8. This approach involves lengthy incubation periods and is associated with a significant reduction in cell viability as well as the loss of cell surface receptors by enzymatic cleavage. High quality flow cytometric studies characterizing TIL in the tumor microenvironment as well as clean purifications of CD45⁺ subpopulations by flow cytometry or antibody-coated beads are more difficult to achieve from enzyme-digested tumor tissue. In addition, the supernatant (SN) from the resulting tumor homogenate is not amenable to further analysis including quantification of secreted proteins (cytokines, chemokines, immunoglobulins or tumor antigens) or experimental treatment of normal cells, because of the potential for protein degradation in the enzymatic digests.

In our search for a method to prepare single cell homogenates from breast tissues [including tumor, non-adjacent non-tumor (NANT) and normal (from mammary reductions) breast tissues] without enzymatic digestion, we tested a variety of mechanical homogenization techniques. Homogenates prepared using a mechanical dissociator had increased cell viability (2-fold) and total cell recovery (2-fold) while preserving surface receptor expression. Enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45⁺ cells suggesting they were all released in the initial homogenate. Thus, this rapid and simple approach allows both qualitative and quantitative assessment of the CD45⁺ subpopulations present in various normal and malignant human tissues. An added advantage of this approach is that the SN from the initial homogenate (primary tissue SN) can be collected and stored for further analysis or experimentation.

протокол

ПРИМЕЧАНИЕ: Все образцы были получены с помощью протокола одобрен Комитетом по этике Медицинского института Жюля Борде мимо с письменного информированного согласия, полученного от каждого пациента.

1. Получение гомогената ткани

1. Проанализируйте Резецированная тканей (злокачественных и нормальных тканей Резецированная из операционной) находятся в лаборатории патологии обученным персоналом для немедленного пуска. Опухоль, NANT (берутся по дальней дистанции от опухоли, как это возможно) и нормальные фрагменты ткани регулярно обрабатываются в течение 1 - 3 ч хирургического иссечения в BSL2 лаборатории с использованием стандартных процедур биобезопасности для тканей человека. Блок-схема протокола проиллюстрировано на фиг.1.
2. Взвесьте все фрагменты тканей (обычный, Нант и опухоль) и измерить длину, ширину и высоту (длина х ширина х высота). Это важный шаг для последующей нормализацией клеточных субпопуляций, экстрагировали РНК, и т.д.
   НЕТTE: диапазон размеров образца составляет от 100 до 10000 мм ³ без жира, если это возможно.
3. Отказ от ответственности фрагмент опухоли на предметное стекло для H & E окрашивания, чтобы убедиться, что ткань на самом деле часть опухоли.
   1. Для этого нажмите на предметное стекло микроскопа, на фрагменте опухоли и, слегка надавливая пальцами на несколько секунд.
   2. Закрепите слайд с изопропанола в течение 2 мин с последующим стадии промывки в воде. Контрастирующая ткань на 30 сек с гематоксилином Майера.
   3. Вымойте слайд в шести ванн воды. Пятно в Phloxine В 2% в течение 15 сек.
   4. Промыть в одном ванну водой, а затем четыре ванны изопропанола и отделки с одной ванне с водой.
   5. Выдержите в изопропанола в течение 1 мин и канализации. Ясно в двух ваннах ксилола.
   6. Установите ксилолом основе монтажа среды. Проверьте для клетками опухоли (рис 2).
      ПРИМЕЧАНИЕ: В основном, опухолевые клетки прилипают к тисненой слайд - стромы, лимфоидные или объявлениемipose клетки редко остаются, оставляя промежутки между опухолевыми клетками (фиг.2).
4. Поместите ткани фрагмент в небольшой чашки для культивирования, содержащей 1 мл в химически определенной, не содержащей сыворотки среде гемопоэтических клеток (далее по тексту среды) при комнатной температуре и кости его на мелкие кусочки (~ 1 - 2 мм ²⁾ с использованием стерильной скальпель.
5. Передача все (фрагменты ткани + среда) с механической Диссоциатор C трубки.
6. Промойте чашку Петри и скальпель с 2 мл среды с использованием пипетки Пастера и добавить к С трубки (объем среды для диссоциации = 3 мл).
7. Используйте механическую Диссоциатор программы A.01 Для C трубок (самый нежный программы) для гомогенизации фрагментов ткани в одной клеточной суспензии. Поместите C трубку в аппарате и запустить программу два раза подряд (один цикл = 25 сек).
   Примечание: Эта процедура гомогенизации была создана и утверждена для человеческой ткани молочной железы, другие товойили или ткани типа, возможно, потребуется использовать другую программу и должны быть проверены в первую очередь.
8. Снимите C трубку от аппарата и переливать гомогената непосредственно в сито 40 мкм клетки, сидящего на 50 мл трубки. Используя ту же пипетку Пастера как на стадии 1.6, передача какой-либо жидкости, оставшейся в C трубки к клеточный фильтр.
9. Передача отфильтрованной жидкости в 15 мл пробирку с помощью микропипетки наконечник в 1 мл. Временно держать сотовый сетчатый фильтр и его 50 мл трубку.
10. Промойте C трубку с дополнительными 3 мл среды и передавать это, опять же, используя тот же пипетку Пастера как в шаге 1.6, в ячейки фильтра еще сидящего на 50 мл трубки. Сожмите максимальное количество остаточной жидкости в ловушке в unhomogenized ткани в 50 мл пробирку, осторожно перемещая его вокруг сито с чистой пипетки Пастера или 1 мл наконечником, который впоследствии выбросить, чтобы избежать загрязнения элюата.
11. Поместите ячейки фильтра вверх дном на тОн оригинала С трубки и промыть 3 мл среды таким образом, что unhomogenized ткани падает обратно в C трубки.
12. Re-гомогенизации, как в шаге 1,7 в течение двух циклов программы A.01.
13. Вылейте эту вторую гомогената через ячейки сетчатого фильтра, сидящего на 50 мл трубку, промыть C трубку снова 3 мл среды (как в шаге 1,10) и передачи с пипетки Пастера в ячейки фильтра, сидящего на 50 мл трубку снова сжимая максимум Количество жидкости от остаточного соединительной ткани, захваченного в клеточный фильтр.
14. В этот момент, объем ~ 2,5 мл в 15 мл пробирку и ~ 9 мл в 50 мл пробирку.

2. Разделение тканей супернатанта и клеток

1. Центрифуга гомогенатах в 15 мл и 50 мл пробирки в течение 15 мин при 600 х г при комнатной температуре.
2. Декантировать SN от 15 мл пробирку в чистую пробирку и временно хранить при 4 ° С. Этот супернатант = первичная опухоль, NANT или нормальный тиСГУП SN (конечный объем 2,5 мл) с последующим уточнением и аликвоты перед хранением при -80 ° С в течение будущих анализов (см. ниже)
3. Жидкость над осадком сливают из 50 мл пробирку.
4. Осторожно ресуспендирования обеих клеточных гранул в конечном объеме 1 мл среды. Короче говоря, сначала слегка нарушить осадок клеток в обеих трубках (нажав трубку на твердую поверхность). Ресуспендируют осадок клеток свободную в 50 мл 500 мкл среды и передачи этой клеточной суспензии в 15 мл пробирку для ресуспендирования второй осадок. Повторите этот шаг, как только со второй 500 мкл среды для максимального восстановления клеток.
5. Передача 10 мкл клеточной суспензии в небольшой трубки, смешать с 10 мкл трипанового синего (разведение 1: 1) и подсчитать количество жизнеспособных клеток с использованием гемоцитометра.
   Примечание: В этот момент часть клеточной суспензии могут также быть проанализированы с помощью проточной цитометрии, чтобы оценить размер ячейки, детализации и, если желательно ограниченное число маркеров субпопуляций для получения дополнительной PRECISE оценка относительного распределения клеток в гомогенате до всестороннего анализа или эксперимента. Все анализы методом проточной цитометрии включают CD45 маркировки для нормализации субпопуляции.
6. Гранул клетки центрифугированием при 300 х г в течение 10 мин при комнатной температуре. Клетки из опухоли, NANT, или нормальной ткани готовы к дальнейшей очистки или анализа. Эти дополнительные шаги лучше всего, когда выполняется в тот же день, как операции.
   Примечание: Для анализа проточной цитометрии, но не сортировки клеток остаточные красные кровяные клетки лизируют следует после мечения антител путем добавления 0,4 мл буфера для лизиса клеток красных кровяных к осадку клеток, сразу же встряхиванием в течение 1 сек и инкубации минимум 10 мин при комнатной Температура (в защищенном от света) перед анализом.

3. Уточнение ткани супернатанта

1. Центрифуга трубки 1,5 мл тканевой SN при 15000 х г в течение 15 мин при 4 ° С.
2. Осторожно снимите тон супернатант, не касаясь или нарушая гранул. Передача в чистую пробирку (или труб), в зависимости от количества и объема аликвоты желаемых.
3. Хранить надосадочную жидкость при температуре -80 ° С для последующего использования.

4. Пациент крови

1. Возьмите образец крови от каждого пациента в качестве контроля из вены в гепаринизированные труб день до операции. Центрифуга крови при 400 х г в течение 10 мин при 20 ° С с тормозом выключения для получения плазмы и лейкоцитарной пленки.
2. Удалить плазму и уточнения его центрифугированием при 10000 х г в течение 15 мин при 20 ° С. Аликвоты и хранить в плазме при -80 ° С для последующего использования. Развести Баффи пальто в среде
3. Отделите мононуклеарных клеток, используя стандартные Ficoll-гипак центрифугирование в градиенте до немедленного анализа, выделения субпопуляции, ДНК / РНК / извлечения белка или криоконсервации.

5. проточной цитометрии

1. Этикетка клетки в соответствии с производстваИнструкция по R, при 4 ° С, в защищенном от света месте. Лизировать красные кровяные клетки в суспензии клеток из фрагментов ткани после маркировки антител путем добавления 0,4 мл клеточной буфера для лизиса к осадку клеток.
2. Вихревой сразу же в течение 1 сек и инкубировать минимум 10 мин при комнатной температуре, в защищенном от света. Проходят меченых клеток в проточной цитометрии для сбора данных без промывки.

Результаты

Переваривание ферментом фрагментов ткани с коммерчески доступными ткани диссоциации растворов или смесей различных лабораторных коллагеназы, ДНКазы и / или ингибиторов гиалуронидаза, расщеплять широкий спектр рецепторов на поверхности клеток. Наши исследования, изначально нацелен?...

Обсуждение

Это исследование описывает оптимизированный способ быстрого приготовления нормальных и злокачественных гомогенатах ткани молочной железы без ферментативного расщепления для последующей сортировки клеток, экстракции, криоконсервации и / или фенотипического анализа CD45 ⁺ субпо...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber	Marienfield	640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain
VersaLyse	Beckman Coulter	A09777	for flow cytometry experiments
Fixable viability Dye eFluor 780	eBioscience	65-0865-14	for flow cytometry experiments
anti-CD3 FITC	BD Biosciences	345763	for flow cytometry experiments
anti-CD3 Vio Blue	Miltenyi Biotec	130-094-363	for flow cytometry experiments
anti-CD4 PE	BD Biosciences	345769	for flow cytometry experiments
anti-CD4 APC	Miltenyi Biotec	130-091-232	for flow cytometry experiments
anti-CD8 ECD	Beckman Coulter	737659	for flow cytometry experiments
anti-CD8 PerCP	BD Biosciences	345774	for flow cytometry experiments
anti-CD19 APC-Vio770	Miltenyi Biotec	130-096-643	for flow cytometry experiments
anti-CD45 VioGreen	Miltenyi Biotec	130-096-906	for flow cytometry experiments