Un protocole simple et rapide aux non enzymatique dissocier frais tissus humains pour l'analyse des lymphocytes infiltrant

Résumé

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45⁺ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Résumé

La capacité des cellules malignes à échapper au système immunitaire, caractérisé par l'échappement tumoral à partir des réponses immunitaires innées et adaptatives, est maintenant accepté comme une caractéristique importante de cancer. Notre recherche sur le cancer du sein se concentre sur le rôle actif que les lymphocytes infiltrant les tumeurs jouent dans la progression tumorale et les résultats des patients. Dans ce but, nous avons développé une méthodologie pour l'isolement rapide des cellules lymphoïdes intacts de tissus normaux et anormaux dans un effort pour les évaluer à proximité de leur état natif. Homogénats préparés en utilisant un spectacle de dissociateur mécanique à la fois la viabilité accrue et la cellule de récupération tout en préservant l'expression du récepteur de surface par rapport aux tissus digéré par une enzyme. En outre, la digestion enzymatique de la matière insoluble restante n'a pas récupéré CD45 ⁺ cellules supplémentaires indiquant que les mesures quantitatives et qualitatives dans l'homogénat primaire susceptibles reflètent véritablement sous-populations infiltrant dans le fragm de tissusent. Les cellules lymphoïdes dans les homogénats peuvent être facilement caractérisées en utilisant immunologique (phénotype, la prolifération, etc.) ou moléculaire (ADN, ARN et / ou protéine) approches. les cellules CD45 ⁺ peuvent également être utilisés pour la purification de la sous-population, l'expansion in vitro ou cryoconservation. Un autre avantage de cette approche est que le surnageant de tissu primaire à partir des homogénats peut être utilisée pour caractériser et de comparer des cytokines, des chimiokines, des immunoglobulines et des antigènes présents dans les tissus normaux et malins. Cette fonction de protocole extrêmement bien pour les tissus mammaires humains et doivent être applicables à une grande variété de tissus normaux et anormaux.

Introduction

The tumor microenvironment is composed of various cell types with numerous studies showing they each play distinct and important roles in tumorigenesis^1,2. These include, but are not limited to, infiltrating immune cells, stromal cells, endothelial cells and tumor cells³. Ex vivo studies of tumor infiltrating lymphocytes (TIL; CD45⁺ cells or leukocytes, which are predominantly lymphocytes in breast tumors) from fresh human tissue samples is made difficult by their low frequency, the small sample sizes often available for research and the potential for loss of viability during extraction. Because immune cells infiltrating tumors are usually present as passengers rather than permanent residents in general they are easier to release from the tissue matrix.

Dissociating tumor tissue while maintaining cellular integrity is technically challenging and has traditionally been performed using a combination of mechanical and enzymatic steps to prepare single cell suspensions^4-8. This approach involves lengthy incubation periods and is associated with a significant reduction in cell viability as well as the loss of cell surface receptors by enzymatic cleavage. High quality flow cytometric studies characterizing TIL in the tumor microenvironment as well as clean purifications of CD45⁺ subpopulations by flow cytometry or antibody-coated beads are more difficult to achieve from enzyme-digested tumor tissue. In addition, the supernatant (SN) from the resulting tumor homogenate is not amenable to further analysis including quantification of secreted proteins (cytokines, chemokines, immunoglobulins or tumor antigens) or experimental treatment of normal cells, because of the potential for protein degradation in the enzymatic digests.

In our search for a method to prepare single cell homogenates from breast tissues [including tumor, non-adjacent non-tumor (NANT) and normal (from mammary reductions) breast tissues] without enzymatic digestion, we tested a variety of mechanical homogenization techniques. Homogenates prepared using a mechanical dissociator had increased cell viability (2-fold) and total cell recovery (2-fold) while preserving surface receptor expression. Enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45⁺ cells suggesting they were all released in the initial homogenate. Thus, this rapid and simple approach allows both qualitative and quantitative assessment of the CD45⁺ subpopulations present in various normal and malignant human tissues. An added advantage of this approach is that the SN from the initial homogenate (primary tissue SN) can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Protocole

REMARQUE: Tous les spécimens ont été acquis au moyen d'un protocole approuvé par le comité d'éthique médicale de l'Institut Jules Bordet avec le consentement éclairé écrit obtenu de chaque patient.

1. Préparation de l'homogénat de tissu

1. Disséquer les tissus (résection de tissus malins et normal résection de la salle d'opération) sont dans le laboratoire de pathologie par du personnel qualifié pour la collecte immédiate. Tumeur, NANT (prise la plus grande distance de la tumeur que possible) et des fragments de tissus normaux sont régulièrement traitées dans 1-3 h de l'excision chirurgicale dans un laboratoire de BSL2 en utilisant des procédures de biosécurité standard pour les tissus humains. Un diagramme de flux du protocole est illustré sur la figure 1.
2. Peser tous les fragments de tissus (normales, NANT et tumorales) et mesurer la longueur, la largeur et la hauteur (longueur x largeur x hauteur). Ce est une étape importante pour la normalisation ultérieure de sous-populations de cellules, l'ARN extrait, etc.
   NOTE: La gamme de taille de l'échantillon est de 100 à 10 000 mm ³ sans gras si possible.
3. Imprimer le fragment de la tumeur sur une lamelle de verre de coloration H & E afin de vérifier que le tissu est en fait une partie de la tumeur.
   1. Pour ce faire, en appuyant sur une lame de microscope en verre sur le fragment de la tumeur et appliquant une légère pression avec les doigts pendant quelques secondes.
   2. Fixer la lame avec de l'isopropanol pendant 2 min, suivie d'une étape de lavage dans l'eau. Counterstain le tissu pendant 30 secondes avec l'hématoxyline de Mayer.
   3. Laver la lame dans six bains d'eau. Colorer dans la phloxine B 2% pendant 15 sec.
   4. Laver à un bain d'eau suivie de quatre salles de bains de l'isopropanol et la finition avec une salle de bain de l'eau.
   5. Incuber dans l'isopropanol pendant 1 min et le drain. Effacer dans deux bains de xylène.
   6. Montez avec un milieu de montage à base de xylène. Examinez pour cellularité tumorale (Figure 2).
      REMARQUE: Principalement, les cellules tumorales collent à la diapositive impressionStylos - les cellules stromales, lymphoïde ou adipose cellules restent rarement, laissant des espaces entre les cellules tumorales (Figure 2).
4. Placez le fragment de tissu dans une petite boîte de culture contenant 1 ml de, milieu de cellules hématopoïétiques sans sérum chimiquement défini (ci-après dénommé milieu) à la température ambiante et couper en petits morceaux (~ 1 à 2 mm ²⁾ en utilisant une solution stérile scalpel.
5. Transférez tout (fragments de tissus + moyenne) à un tube mécanique dissociateur C.
6. Rincer la boîte de Pétri et scalpel avec 2 ml de milieu à l'aide d'une pipette Pasteur et ajouter ceci à tube C (volume du milieu de dissociation = 3 ml).
7. Utilisez le A.01 de programme de dissociateur mécanique pour tubes C (le programme le plus doux) pour homogénéiser les fragments de tissus dans une suspension cellulaire unique. Placer le tube de C dans l'appareil et exécuter le programme deux fois de suite (un cycle = 25 sec).
   NOTE: Cette procédure d'homogénéisation a été établi et validé pour le tissu mammaire humain, autre tumou tissus ou types peuvent avoir besoin d'utiliser un autre programme et devraient être testés en premier.
8. Retirer le tube de l'appareil C et l'homogénat décanter directement dans un tamis cellulaire de 40 pm assis sur un tube de 50 ml. En utilisant la même pipette Pasteur comme à l'étape 1.6, transférer le liquide restant dans le tube de C au tamis cellulaire.
9. Transférer le liquide filtré dans un tube de 15 ml en utilisant une pointe de micropipette 1 ml. Temporairement maintenir le tamis cellulaire et son tube de 50 ml.
10. Rincer le tube de C avec un 3 ml supplémentaires de milieu et transférer ce, encore une fois en utilisant la même pipette Pasteur comme à l'étape 1.6, à l'tamis cellulaire encore assis sur le tube de 50 ml. Pressez un montant maximum de liquide résiduel piégé dans le tissu non homogénéisé dans le tube de 50 ml en déplaçant doucement autour de la crépine avec une pipette Pasteur propre ou une pointe ml qui est ensuite jeté pour éviter de contaminer l'éluat.
11. Placez le filtre cellulaire à l'envers sur til tube d'origine C et rinçage avec 3 ml de milieu de sorte que le tissu non homogénéisé retombe dans le tube C.
12. Re-homogénéiser comme à l'étape 1.7 pour deux cycles du programme A.01.
13. Pour cette deuxième homogénat à travers le tamis cellulaire assis sur le tube de 50 ml, rincer le tube de C de nouveau avec 3 ml de milieu (comme à l'étape 1.10) et transférer à la pipette Pasteur au tamis cellulaire assis sur le tube de 50 ml à nouveau serrant au maximum quantité de liquide à partir du tissu conjonctif résiduel piégé dans le filtre à cellule.
14. À ce stade, un volume de ~ 2,5 ml est dans le tube de 15 ml et ~ 9 ml dans le tube de 50 ml.

2. Séparation du surnageant de cellules et de tissus

1. Centrifuger les homogénats à 15 ml et les tubes de 50 ml pendant 15 min à 600 x g à température ambiante.
2. Décanter le SN du tube de 15 ml dans un tube propre et stocker temporairement à 4 ° C. Ce surnageant = tumeur primaire, NANT ou ti normalessu SN (de volume final de 2,5 ml) est ensuite clarifié et aliquotée avant le stockage à -80 ° C pour les analyses futures (voir ci-dessous).
3. Jeter le surnageant à partir du tube de 50 ml.
4. Resuspendre doucement les deux culots de cellules dans un volume final de 1 ml de milieu. En bref, la première briser doucement le culot cellulaire dans les deux tubes (en appuyant sur le tube sur une surface dure). Remettre en suspension le culot cellulaire en vrac dans les 50 ml avec 500 ul de milieu et transférer cette suspension de cellules dans le tube de 15 ml pour remettre en suspension le culot secondes. Répétez cette étape une fois avec les secondes 500 pi de milieu pour une récupération maximale des cellules.
5. Transfert 10 ul de la suspension cellulaire dans un petit tube, mélanger avec 10 pi de bleu trypan (dilution 1: 1) et compter le nombre de cellules viables à l'aide d'un hémocytomètre.
   REMARQUE: À ce stade une fraction de la suspension de cellules peut également être analysée par cytométrie de flux pour évaluer la taille de la cellule, la granularité et si on le désire un nombre limité de marqueurs de sous-populations de plus precise évaluation de la distribution des cellules par rapport à l'homogénat avant l'analyse ou expérimentation extensive. Toutes les analyses par cytométrie flux intègrent étiquetage CD45 pour la normalisation des sous-populations.
6. Pellet les cellules par centrifugation à 300 xg pendant 10 min à température ambiante. Les cellules de la tumeur, NANT, ou un tissu normal sont maintenant prêts pour une autre purification ou d'analyse. Ces étapes supplémentaires sont les mieux lorsqu'elles sont effectuées le même jour que la chirurgie.
   NOTE: Pour l'analyse par cytométrie de flux mais pas le tri cellulaire des globules rouges résiduels doivent être lysées après marquage de l'anticorps en ajoutant 0,4 ml de tampon de lyse de globules rouges au culot cellulaire, vortex immédiatement pendant 1 seconde et l'incubation d'un minimum de 10 min à manger température (abri de la lumière) avant l'analyse.

3. Clarification du surnageant tissulaire

1. Centrifuger les tubes de 1,5 ml avec SN tissulaire à 15 000 xg pendant 15 min à 4 ° C.
2. Retirez délicatement til surnageant sans toucher ni déranger le culot. Transférer dans un tube propre (ou tubes) selon le nombre et le volume des aliquotes souhaités.
3. Stocker le surnageant à -80 ° C pour une utilisation future.

4. sang du patient

1. Prélever un échantillon de sang de chaque patient, en tant que témoin par ponction veineuse dans des tubes héparinisés le jour avant la chirurgie. Centrifuger le sang à 400 g pendant 10 min à 20 ° C avec le frein, pour obtenir le plasma et une couenne.
2. Retirez le plasma et la clarifier par centrifugation à 10 000 g pendant 15 min à 20 ºC. Aliquoter et magasin plasma à -80 ° C pour une utilisation future. Diluer la couche leuco-plaquettaire en milieu
3. Séparer les cellules mononucléaires en utilisant la centrifugation en gradient de Ficoll-Hypaque norme avant l'analyse immédiate, l'isolement des sous-populations, / ARN / extraction de protéines ou d'ADN cryoconservation.

5. cytométrie en flux

1. cellules d'étiquetage selon la fabricationles instructions r à 4 ° C à l'abri de la lumière. Lyser les globules rouges dans les suspensions cellulaires à partir de fragments de tissus après le marquage de l'anticorps en ajoutant 0,4 ml de tampon de lyse cellulaire au culot cellulaire.
2. Vortexer immédiatement une seconde et incuber un minimum de 10 min à température ambiante, à l'abri de la lumière. Passez les cellules marquées dans un cytomètre de flux pour l'acquisition de données sans lavage.

Résultats

La digestion enzymatique de fragments de tissus disponibles dans le commerce avec des solutions de dissociation des tissus ou divers mélanges de laboratoire de la collagénase, la DNase et / ou des inhibiteurs de la hyaluronidase, cliver une large gamme de récepteurs à la surface des cellules. Nos études, d'abord axées sur les cellules T CD4 ⁺ infiltrant les tumeurs du sein, ont été rapidement présentés à un problème technique majeur dû au clivage des récepteurs CD4 de surface en utilisant de...

Discussion

Cette étude décrit un procédé optimisé pour la préparation rapide d'homogénats de tissus du sein normaux et malins sans digestion enzymatique pour le tri ultérieur de la cellule, l'extraction, la cryoconservation et / ou l'analyse phénotypique de CD45 ⁺ sous-populations. L'objectif de cette approche expérimentale est de produire des images de la TIL qui reflètent étroitement leur état ​​in vivo et de les comparer aux tissus normaux avec une manipulation minimale des t...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber	Marienfield	640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain
VersaLyse	Beckman Coulter	A09777	for flow cytometry experiments
Fixable viability Dye eFluor 780	eBioscience	65-0865-14	for flow cytometry experiments
anti-CD3 FITC	BD Biosciences	345763	for flow cytometry experiments
anti-CD3 Vio Blue	Miltenyi Biotec	130-094-363	for flow cytometry experiments
anti-CD4 PE	BD Biosciences	345769	for flow cytometry experiments
anti-CD4 APC	Miltenyi Biotec	130-091-232	for flow cytometry experiments
anti-CD8 ECD	Beckman Coulter	737659	for flow cytometry experiments
anti-CD8 PerCP	BD Biosciences	345774	for flow cytometry experiments
anti-CD19 APC-Vio770	Miltenyi Biotec	130-096-643	for flow cytometry experiments
anti-CD45 VioGreen	Miltenyi Biotec	130-096-906	for flow cytometry experiments