Eine einfache und schnelle Protokoll zum Nicht enzymatisch Dissociate Frische menschlichen Geweben zur Analyse der infiltrierenden Lymphozyten

Zusammenfassung

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45⁺ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Zusammenfassung

Die Fähigkeit von Tumorzellen, das Immunsystem, gekennzeichnet durch Tumorflucht sowohl angeborenen und erworbenen Immunreaktionen entziehen wird nun als ein wichtiges Merkmal von Krebs angenommen. Unsere Forschung zu Brustkrebs konzentriert sich auf die aktive Rolle, die Tumor-infiltrierenden Lymphozyten in der Tumorprogression und der Behandlungserfolg spielen. Auf dieses Ziel, eine Methodik für die schnelle Isolierung von intakten lymphatischen Zellen von normalen und abnormalen Geweben haben wir in dem Bemühen, zu bewerten nahe ihrem nativen Zustand. Homogenate mit einem mechanischen Dissoziator zeigen sowohl erhöhte Lebensfähigkeit und Zellgewinnung unter Beibehaltung Oberflächenrezeptorexpression im Vergleich zum Enzym verdaute Gewebe vorbereitet. Außerdem hatte enzymatische Verdauung der verbleibenden unlöslichen Materials zusätzliche CD45 ⁺ Zellen anzeigt, dass qualitative und quantitative Messungen im Primär Homogenat wahrscheinlich wirklich infiltrieren Subpopulationen im Gewebe fragm reflektieren nicht wiederherstellenEintr. Die lymphoiden Zellen in diesen Homogenaten man einfach mit immunologischen (Phänotyp, Proliferation usw.) oder Molekular (DNA, RNA und / oder Protein), gekennzeichnet nähert. CD45 ⁺ Zellen können auch für die Reinigung Subpopulation, in vitro Expansion oder Kryokonservierung verwendet werden. Ein zusätzlicher Vorteil dieses Ansatzes ist, dass die Primärgewebe Stand aus den Homogenaten kann verwendet werden, um in normalen und malignen Geweben zu charakterisieren und zu vergleichen, Cytokine, Chemokine, Immunglobuline und Antigenen werden. Diese Protokoll-Funktionen sehr gut für den menschlichen Brustgewebe und sollte für eine breite Vielzahl von normalen und abnormalen Geweben.

Einleitung

The tumor microenvironment is composed of various cell types with numerous studies showing they each play distinct and important roles in tumorigenesis^1,2. These include, but are not limited to, infiltrating immune cells, stromal cells, endothelial cells and tumor cells³. Ex vivo studies of tumor infiltrating lymphocytes (TIL; CD45⁺ cells or leukocytes, which are predominantly lymphocytes in breast tumors) from fresh human tissue samples is made difficult by their low frequency, the small sample sizes often available for research and the potential for loss of viability during extraction. Because immune cells infiltrating tumors are usually present as passengers rather than permanent residents in general they are easier to release from the tissue matrix.

Dissociating tumor tissue while maintaining cellular integrity is technically challenging and has traditionally been performed using a combination of mechanical and enzymatic steps to prepare single cell suspensions^4-8. This approach involves lengthy incubation periods and is associated with a significant reduction in cell viability as well as the loss of cell surface receptors by enzymatic cleavage. High quality flow cytometric studies characterizing TIL in the tumor microenvironment as well as clean purifications of CD45⁺ subpopulations by flow cytometry or antibody-coated beads are more difficult to achieve from enzyme-digested tumor tissue. In addition, the supernatant (SN) from the resulting tumor homogenate is not amenable to further analysis including quantification of secreted proteins (cytokines, chemokines, immunoglobulins or tumor antigens) or experimental treatment of normal cells, because of the potential for protein degradation in the enzymatic digests.

In our search for a method to prepare single cell homogenates from breast tissues [including tumor, non-adjacent non-tumor (NANT) and normal (from mammary reductions) breast tissues] without enzymatic digestion, we tested a variety of mechanical homogenization techniques. Homogenates prepared using a mechanical dissociator had increased cell viability (2-fold) and total cell recovery (2-fold) while preserving surface receptor expression. Enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45⁺ cells suggesting they were all released in the initial homogenate. Thus, this rapid and simple approach allows both qualitative and quantitative assessment of the CD45⁺ subpopulations present in various normal and malignant human tissues. An added advantage of this approach is that the SN from the initial homogenate (primary tissue SN) can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Protokoll

HINWEIS: Alle Proben wurden unter Verwendung eines Protokolls von der Medizinischen Ethik-Kommission des Instituts Jules Bordet mit schriftlicher Einwilligung von jedem Patienten erhalten genehmigt erworben.

1. Herstellung des Gewebehomogenats

1. Sezieren resezierten Gewebe (malignen und normalen Gewebe aus dem OP-Saal resezierten) sind in der Pathologie-Labor durch geschultes Personal zur sofortigen Abholung. Tumor, NANT (aufgenommen am weitesten Abstand von der Tumor wie möglich) und Normalgewebefragmente werden routinemäßig auf 1 bearbeitet - 3 h chirurgische Exzision in einem BSL2 Labor unter Verwendung von Standardverfahren der biologischen Sicherheit für menschliche Gewebe. Ein Ablaufdiagramm des Protokolls ist in Abbildung 1 dargestellt.
2. Wiegen Sie alle Gewebestücke (normal, NANT und Tumor) und messen Sie die Länge, Breite und Höhe (Länge x Breite x Höhe). Dies ist ein wichtiger Schritt für die anschließende Normalisierung des Zellpopulationen, extrahierte RNA usw.
   NEINTE: Der Bereich der Stichprobengröße ist 100 bis 10.000 mm ³ ohne Fett, wenn möglich.
3. Impressum der Tumorfragment auf einem Objektträger für H & E Färbung, um zu überprüfen, dass das Gewebe ist eigentlich ein Teil des Tumors.
   1. Tun Sie dies, indem Sie einen Glasobjektträger auf den Tumor-Fragment und mit leichtem Druck mit den Fingern für ein paar Sekunden.
   2. Befestigen Sie die Folie mit Isopropanol für 2 Minuten, gefolgt von einem Waschschritt in Wasser. Gegenfärbung des Gewebes für 30 Sekunden mit Mayers Hämatoxylin.
   3. In sechs Bäder Wasser Waschen Sie den Objektträger. Fleck in Phloxin B 2% für 15 Sekunden.
   4. In einem Bad aus Wasser, gefolgt von vier Bäder Isopropanol und Finish mit einem Bad aus Wasser waschen.
   5. Inkubiere in Isopropanol für 1 min und Drain. Klar in zwei Bäder Xylol.
   6. Montieren Sie mit Xylol basiert Eindeckmedium. Untersuchen der Tumorzellzahl (Abbildung 2).
      HINWEIS: Vor allem, Tumorzellen haften an der aufgedruckten Rutsche - das Stroma, lymphatischen oder Ad-ipose Zellen selten bleiben, so dass Zwischenräume zwischen den Tumorzellen (Abbildung 2).
4. Mit einer sterilen - Legen Sie die Gewebefragment in einer kleinen Kulturschale mit 1 ml der chemisch definierten, serumfreien hämatopoetischen Zellmedium bei Raumtemperatur in kleine Stücke (2 mm ^{2 bis} 1) (im Folgenden als Medium bezeichnet), und in Würfel schneiden Skalpell.
5. Bringen Sie alles, was (Gewebefragmente + Medium) zu einer mechanischen Dissoziator C Rohr.
6. Mit 2 ml Medium mit einer Pasteurpipette gründlich die Petrischale und Skalpell und addieren sie zum C Rohr (Volumen des Mediums für die Dissoziation = 3 ml).
7. Verwenden Sie die mechanische Dissoziator Programm A.01 für C Rohre (die schonendste Programm), um die Gewebefragmente in eine Einzelzellsuspension zu homogenisieren. Stellen Sie das C-Rohr in der Vorrichtung und zweimal das Programm in Folge (ein Zyklus = 25 sec).
   HINWEIS: Diese Homogenisierung Verfahren hergestellt wurde und für den menschlichen Brustgewebe, andere tum validiertoder oder Gewebetypen müssen vielleicht ein anderes Programm verwenden und sollten zuerst getestet werden.
8. Entfernen Sie das C-Rohr aus dem Gerät und dekantiert die Homogenat direkt in ein 40 um Zellsieb auf einem 50-ml-Tube sitzt. Mit der gleichen Pasteur-Pipette, wie in Schritt 1.6, übertragen jede in der C-Rohr in die Zelle Sieb zurückbleibende Flüssigkeit.
9. Übertragen Sie die gefilterte Flüssigkeit in einen 15-ml-Röhrchen mit einem 1 ml Mikropipettenspitze. Vorübergehend halten die Zellsieb und seine 50-ml-Tube.
10. Mit weiteren 3 ml Medium spülen C Röhrchen sammeln und diese wieder mit dem gleichen Pasteur-Pipette, wie in Schritt 1.6, auf die Zellsieb noch auf dem 50-ml-Tube sitzt. Drücken Sie eine maximale Menge der Restflüssigkeit in der nicht homogenisierten Gewebe eingeklemmt in die 50-ml-Röhrchen durch leichtes Verschieben der ganzen Sieb mit einem sauberen Pasteurpipette oder 1 ml-Spitze, die dann weggeworfen wird, um zu vermeiden, eine Verunreinigung des Eluats.
11. Legen Sie die Zellsieb kopfüber auf ter Original C Rohr und spülen Sie mit 3 ml Medium, so dass die nicht homogenisierten Gewebe fällt zurück in die C-Rohr.
12. Re-Homogenisierung, wie in Schritt 1.7 für zwei Zyklen des A.01 Programms.
13. Gießen Sie diese zweite Homogenat durch die Zelle Sieb auf dem 50-ml-Tube sitzt, spülen Sie das C-Rohr wieder mit 3 ml Medium (wie in Schritt 1.10) und Transfer mit dem Pasteur-Pipette an die Zelle Sieb auf dem 50-ml-Tube sitzt wieder drückte maximal Flüssigkeitsmenge aus dem Rest Bindegewebes im Zellsieb gefangen.
14. Zu diesem Zeitpunkt ist ein Volumen von ~ 2,5 ml in 15 ml-Röhrchen und ~ 9 ml in 50-ml-Röhrchen.

2. Trennung der Gewebeüberstand und Zellen

1. Zentrifugieren Homogenate in 15 ml und 50 ml-Röhrchen für 15 min bei 600 × g bei Raumtemperatur.
2. Dekantiert man die SN aus dem 15-ml-Röhrchen in ein sauberes Röhrchen und vorübergehend bei 4 ° C zu lagern. Dieser Überstand = Primärtumor, NANT oder normale tiUSGABE SN (Endvolumen 2,5 ml) wird anschließend geklärt und aliquotiert vor der Lagerung bei -80 ° C für zukünftige Analysen (siehe unten).
3. Überstand verwerfen aus dem 50-ml-Tube.
4. Vorsichtig resuspendieren beiden Zellpellets in einem Endvolumen von 1 ml Medium. Kurz gesagt, zuerst sanft brechen die Zellpellets in beiden Röhren (durch Tippen auf das Rohr auf eine harte Oberfläche). Resuspendieren Sie das lose Zellpellet in den 50 ml mit 500 ul Medium und übertragen diese Zellsuspension in die 15-ml-Tube, um die zweite Pellet resuspendieren. Wiederholen Sie diesen Schritt einmal mit der zweiten 500 ul Medium für maximale Rückgewinnung von Zellen.
5. Transfer 10 ul der Zellsuspension in ein kleines Röhrchen, mischen mit 10 ul Trypanblau (Verdünnung 1: 1) und die Anzahl der lebensfähigen Zellen unter Verwendung eines Hämocytometers.
   HINWEIS: An diesem Punkt eine Fraktion der Zellsuspension können auch mittels Durchflusscytometrie analysiert, um die Zellgröße, Granularität zu bewerten und, falls gewünscht eine begrenzte Anzahl von Subpopulation Marker für weitere precise Abschätzung der Zellverteilung in dem Homogenat vor der umfassenden Analyse oder Experimente. Alle Analysen mittels Durchflusszytometrie integrieren CD45 Kennzeichnung für die Normalisierung der Subpopulationen.
6. Pellet die Zellen durch Zentrifugation bei 300 × g für 10 min bei Raumtemperatur. Die Zellen aus dem Tumor, NANT oder normales Gewebe sind nun bereit für die weitere Reinigung oder Analyse. Diese zusätzlichen Schritte sind am besten, wenn am selben Tag wie die Chirurgie durchgeführt.
   HINWEIS: Für Durchflusszytometrieanalyse aber nicht zell Sortieren der Rest Erythrozyten sollten nach der Antikörper-Markierung nach Zugabe von 0,4 ml von roten Blutzellen Lysepuffer zu dem Zellpellet sofort Vortexen für 1 sec und Inkubieren von mindestens 10 min bei Raum lysierenden Temperatur (lichtgeschützt) vor der Analyse.

3. Klärung der Gewebeüberstand

1. Zentrifugieren 1,5-ml-Röhrchen mit Gewebe SN bei 15.000 xg für 15 min bei 4 ° C.
2. Entfernen Sie vorsichtig ter Überstand ohne sie zu berühren oder das Pellet aufzurühren. Transfer in ein sauberes Röhrchen (oder Röhren) in Abhängigkeit von der Anzahl und Volumen der Aliquote gewünscht.
3. Lagern Sie den Überstand bei -80 ° C für eine spätere Verwendung.

4. Patient Blut

1. Sammeln einer Blutprobe von jedem Patienten als Kontrolle durch Venenpunktion in heparinisierte Röhrchen am Tag vor der Operation. Zentrifugieren des Bluts bei 400 · g für 10 min bei 20 ºC mit der Bremse aus, um das Plasma und Buffy-Coat erhalten.
2. Entfernen Sie das Plasma und klären sie durch Zentrifugation bei 10.000 × g für 15 min bei 20 ºC. Aliquot und speichern Plasma bei -80 ° C für zukünftige Verwendung. Verdünnen Sie die Buffy-Coat in Medium
3. Trenne die mononukleäre Zellen unter Verwendung von Standard-Ficoll-Hypaque-Gradienten-Zentrifugation vor der unmittelbaren Analyse Subpopulation Isolierung, DNA / RNA / Protein-Extraktion oder Kryokonservierung.

5. Durchflusszytometrie

1. Etikett Zellen nach der Herstellungr Angaben bei 4 ° C, vor Licht geschützt. Lyse der roten Blutzellen in Zellsuspensionen aus Gewebefragmenten nach der Antikörper-Markierung nach Zugabe von 0,4 ml der Zell-Lyse-Puffer zu dem Zellpellet.
2. Vortex sofort für 1 Sekunde und Inkubation von mindestens 10 Minuten bei Raumtemperatur, vor Licht geschützt. Führen Sie die markierten Zellen in einem Durchflusszytometer für die Datenerfassung ohne Waschen.

Ergebnisse

Enzymatische Verdauung von Gewebefragmenten entweder im Handel erhältlich Gewebedissoziation Lösungen oder verschiedene Labor Mischungen Kollagenase, DNase und / oder Hyaluronidase-Inhibitoren sind, schneiden eine Vielzahl von Rezeptoren auf der Oberfläche von Zellen. Unsere Studien, zunächst auf CD4 ⁺ T-Zellen infiltrieren Brusttumoren fokussiert wurden schnell mit einem großen technischen Problem wegen Spaltung Oberfläche CD4-Rezeptoren unter Verwendung von Standardprotokollen enzymatische Verdauung <...

Diskussion

Diese Studie beschreibt ein optimiertes Verfahren für die schnelle Herstellung von normalen und malignen Brust Gewebehomogenaten ohne enzymatische Verdauung für nachfolgende Zellsortierung, Extraktion, Kryokonservierung und / oder phänotypische Analyse von CD45 ⁺ Subpopulationen. Das Ziel dieser experimentellen Ansatz ist es, Bilder der TIL, die ihre in vivo Zustand genau wieder und vergleichen sie mit normalen Geweben mit minimaler Manipulation der Gewebe frisch aus dem OP-Saal zu produzieren. Bi...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
GentleMacs Dissociator	Miltenyi Biotec	130-093-235	BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 R	Eppendorf		or other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 R	Eppendorf		or other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety Cabinet	ESCO global		or other standard BSL2 hood
Inverted Microscope	Nikon eclipse TS100		or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker Chamber	Marienfield	640210	or other standard hemacytometer
Navios Flow Cytometer	Beckman Coulter		or other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-Tube	Miltenyi Biotec	130-096-344	BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture Dish	Sarstedt	72,710	or other non-pyrogenic plasticware
Disposable Scalpel	Swann-Morton	0510	or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µm	Becton Dickinson	734-0002	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 ml	Becton Dickinson	352070	or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 ml	Becton Dickinson	352097	or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 ml	Becton Dickinson	352008	or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 ml	VWR	612-1685	or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 ml	Eppendorf	7805-00	or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20	Lonza	BE04-448Q	serum-free medium recommended
Phosphate buffered saline	Lonza	BE17-516F	standard physiological PBS
Trypan blue	VWR	17942E	or other vital stain
VersaLyse	Beckman Coulter	A09777	for flow cytometry experiments
Fixable viability Dye eFluor 780	eBioscience	65-0865-14	for flow cytometry experiments
anti-CD3 FITC	BD Biosciences	345763	for flow cytometry experiments
anti-CD3 Vio Blue	Miltenyi Biotec	130-094-363	for flow cytometry experiments
anti-CD4 PE	BD Biosciences	345769	for flow cytometry experiments
anti-CD4 APC	Miltenyi Biotec	130-091-232	for flow cytometry experiments
anti-CD8 ECD	Beckman Coulter	737659	for flow cytometry experiments
anti-CD8 PerCP	BD Biosciences	345774	for flow cytometry experiments
anti-CD19 APC-Vio770	Miltenyi Biotec	130-096-643	for flow cytometry experiments
anti-CD45 VioGreen	Miltenyi Biotec	130-096-906	for flow cytometry experiments