JoVE Logo

Oturum Aç

Bu içeriği görüntülemek için JoVE aboneliği gereklidir. Oturum açın veya ücretsiz deneme sürümünü başlatın.

Bu Makalede

  • Özet
  • Özet
  • Giriş
  • Protokol
  • Sonuçlar
  • Tartışmalar
  • Açıklamalar
  • Teşekkürler
  • Malzemeler
  • Referanslar
  • Yeniden Basımlar ve İzinler

Özet

This protocol describes the rapid non-enzymatic dissociation of fresh human tissue fragments for qualitative and quantitative assessment of CD45+ cells (lymphocytes/leukocytes) present in various normal and malignant human tissues. Additionally, the supernatant obtained from the primary tissue homogenate can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Özet

doğal ve adaptif immün yanıtların hem tümör kaçış ile karakterize bağışıklık sistemini, kaçmak için malign hücrelerin yeteneği şimdi kanser önemli bir ayırt edici niteliği olarak kabul edilmektedir. Meme kanseri ile ilgili araştırma tümör infiltre lenfositleri tümör ilerlemesi ve hasta sonuç oynadığı aktif rolü üzerinde duruluyor. Bu hedefe doğru, biz onların yerli devlet onları yakın değerlendirmek için bir çaba, normal ve anormal dokuların sağlam lenfoid hücrelerin hızlı izolasyonu için bir metodoloji geliştirdi. Yüzey reseptörü ifadesi karşılaştırıldığında için enzim-sindirilmiş dokuları koruyarak mekanik ayıracı gösterisi hem artan canlılık ve hücre kurtarma kullanılarak hazırlanan Homojenatlar. Ayrıca, kalan çözünmeyen malzemenin enzimatik sindirim birincil homojenatında nicel ve nitel ölçümler olasılıkla gerçekten doku fragmanının içinde infiltre subpopülasyonunun yansıttığını belirten ek CD45 + hücreler geri vermedient. Bu homojenatlarında lenfoid hücreleri kolayca immünolojik (fenotip, proliferasyon, vs.) ya da moleküler (DNA, RNA ve / veya proteini) ile karakterize edilen yaklaşmaktadır. CD45 + hücreleri, alt popülasyonu saflaştırma in vitro genişlemesi veya iyileştirilmesi için de kullanılabilir. Bu yaklaşımın bir başka faydası da homojenatlarında birincil doku süpernatan normal ve habis dokular sitokinleri, kemokinleri immünoglobinlerin ve bu antijenleri karakterize etmek ve karşılaştırmak için kullanılabilir olmasıdır. Bu protokol, son derece düzgün şekilde insan meme dokularında ve normal ve anormal doku çeşitli için geçerli olmalıdır.

Giriş

The tumor microenvironment is composed of various cell types with numerous studies showing they each play distinct and important roles in tumorigenesis1,2. These include, but are not limited to, infiltrating immune cells, stromal cells, endothelial cells and tumor cells3. Ex vivo studies of tumor infiltrating lymphocytes (TIL; CD45+ cells or leukocytes, which are predominantly lymphocytes in breast tumors) from fresh human tissue samples is made difficult by their low frequency, the small sample sizes often available for research and the potential for loss of viability during extraction. Because immune cells infiltrating tumors are usually present as passengers rather than permanent residents in general they are easier to release from the tissue matrix.

Dissociating tumor tissue while maintaining cellular integrity is technically challenging and has traditionally been performed using a combination of mechanical and enzymatic steps to prepare single cell suspensions4-8. This approach involves lengthy incubation periods and is associated with a significant reduction in cell viability as well as the loss of cell surface receptors by enzymatic cleavage. High quality flow cytometric studies characterizing TIL in the tumor microenvironment as well as clean purifications of CD45+ subpopulations by flow cytometry or antibody-coated beads are more difficult to achieve from enzyme-digested tumor tissue. In addition, the supernatant (SN) from the resulting tumor homogenate is not amenable to further analysis including quantification of secreted proteins (cytokines, chemokines, immunoglobulins or tumor antigens) or experimental treatment of normal cells, because of the potential for protein degradation in the enzymatic digests.

In our search for a method to prepare single cell homogenates from breast tissues [including tumor, non-adjacent non-tumor (NANT) and normal (from mammary reductions) breast tissues] without enzymatic digestion, we tested a variety of mechanical homogenization techniques. Homogenates prepared using a mechanical dissociator had increased cell viability (2-fold) and total cell recovery (2-fold) while preserving surface receptor expression. Enzymatic digestion of the remaining insoluble material did not recover additional CD45+ cells suggesting they were all released in the initial homogenate. Thus, this rapid and simple approach allows both qualitative and quantitative assessment of the CD45+ subpopulations present in various normal and malignant human tissues. An added advantage of this approach is that the SN from the initial homogenate (primary tissue SN) can be collected and stored for further analysis or experimentation.

Protokol

NOT: Tüm örnekler, her hastadan alınan yazılı bilgilendirilmiş onayı ile Enstitü Jules Bordet Tıp Etiği Komitesi tarafından onaylanan bir protokol kullanılarak elde edildi.

Doku homojenatı hazırlanması 1.

  1. Rezeke dokular (ameliyathane gelen rezeke malign ve normal doku) teşrih hemen pikap için eğitilmiş personel tarafından patoloji laboratuarında vardır. Tümör, NANT (mümkün olduğunca tümör uzak mesafe alınmıştır) ve normal doku parçaları rutin 1 içinde işlenir - insan dokularında için standart biyogüvenlik prosedürleri kullanarak BSL2 laboratuarda cerrahi eksizyon 3 saat. Protokolün bir akış şeması, Şekil 1 'de gösterilmiştir.
  2. Tüm doku parçaları (normal NANT ve tümör) tartılır ve uzunluk, genişlik ve yükseklik (uzunluk x genişlik x yükseklik) ölçer. Bu hücre alt sonraki normalizasyonu için önemli bir adım, ekstre RNA, vb olduğunu
    HAYIRTE: örneklem büyüklüğü aralığı hiç yağ mümkünse 100 10.000 mm 3.
  3. Doku aslında tümör parçası olduğunu doğrulamak için, H & E boyama için bir cam slayt tümör fragmanı basar.
    1. Tümör fragmanı bir cam mikroskop lamı basarak ve bir kaç saniye için parmaklarınızla hafif baskı uygulayarak bunu yapın.
    2. Su içinde bir yıkama aşaması takip 2 dakika boyunca, izopropanol ile slayt sabitleyin. Mayer'in hematoksilen ile 30 saniye boyunca doku Counterstain.
    3. Su altı banyolarında slayt yıkayın. 15 sn için floksin B% 2 Leke.
    4. Suyun bir banyo ile izopropanol ve bitiş dört banyoları ve ardından bir su banyosu içinde yıkayın.
    5. 1 dakika ve drenaj için izopropanol içinde inkübe edin. Ksilen iki hamam Temizle.
    6. Ksilen bazlı montaj orta ile monte edin. Tümör selülarite (Şekil 2) için inceleyin.
      NOT: - stromal, lenfoid veya reklam Temelde, tümör hücrelerinin baskılı slayt sopaipose hücreler nadiren tümör hücreleri arasındaki boşlukların (Şekil 2) kalır.
  4. Steril kullanılarak - kimyasal olarak tanımlanmış, serumsuz hematopoietik hücre ortamının 1 ml içeren küçük bir kültür kabı içinde doku parçasını yerleştirin küçük parçalar (2 mm 2 ~ 1) içine, oda sıcaklığında, (bundan sonra ortam olarak anılacaktır) ve zar Neşter.
  5. Mekanik ayıracı C tüpüne (doku parçaları + orta) her şeyi aktarın.
  6. Pasteur pipeti kullanarak ortam 2 ml petri kabı ve bir neşter durulayın ve C boru (ayrışması için ortamının hacmi = 3 mi) bunu ekleyin.
  7. Tek bir hücre süspansiyonu içine doku parçaları homojenize C tüpler için mekanik ayıracı programı A.01 (en nazik programı) kullanın. (Bir döngü = 25 sn) aparat C tüpü yerleştirin ve arka arkaya iki kez programı çalıştırın.
    NOT: Bu homojenizasyon işlemi kurulmuş ve insan meme dokusu, diğer tum için valide edilmiştirda doku tipleri farklı bir program kullanmanız gerekebilir ilk test edilmelidir.
  8. Aparat C tüpünü çıkarın ve bir 50 ml tüp üzerinde oturan 40 mikron hücre süzgecinden doğrudan Homojenat süzün. Adım 1.6 aynı Pasteur pipet kullanarak, hücre süzgecinden C tüp içinde kalan herhangi bir sıvı transferi.
  9. 1 ml mikropipet ucu kullanılarak 15 ml tüp içine süzülmüş sıvı aktarın. Geçici hücre süzgeç ve 50 ml'lik tüp tutmak.
  10. Ortamın, fazladan bir 3 ml Cı tüp yıkayın ve daha da iyisi 50 mi tübünün üzerine yerleştirilmiş hücre süzgecinden için, Aşama 1.6 ile aynı Pasteur pipeti kullanarak, bu aktarın. Yavaşça sonradan eluatının kirletmesini önlemek için atılır temiz Pasteur pipet veya 1 ml ucu ile süzgeç etrafında hareket ettirerek 50 ml tüp içine unhomogenized dokuda sıkışıp kalan sıvı maksimum miktarda sıkın.
  11. Ters t hücre süzgeç yerleştirino orijinal C boru ve unhomogenized doku geri C tüpüne düşer ve böylece orta 3 ml ile yıkayın.
  12. A.01 program iki döngü Aşama 1.7'de olduğu gibi yeniden homojen hale getirilir.
  13. 50 ml tüp üzerinde oturan hücre süzgecinden bu ikinci homojenatın dökün, (adım 1.10 gibi) 3 ml ortam ile tekrar C tüp durulayın ve tekrar maksimum sıkma 50 ml tüp oturan hücre süzgecinden Pasteur pipeti ile aktarmak hücre süzgecinden tutulan kalıntı bağ dokusu sıvı miktarı.
  14. Bu noktada, ~ 2.5 ml'lik bir hacim 15 ml tüp içinde ve ~ 50 ml tüp içinde 9 mi.

Doku yüzer madde ve Hücreler 2. Ayırma

  1. Oda sıcaklığında 600 x g'de 15 dakika boyunca 15 ml homojenatları ve 50 ml tüpler santrifüjleyin.
  2. Temiz bir tüp içine, 15 ml tüp SN süzün ve geçici olarak 4 ° C'de muhafaza edin. Bu yüzer = primer tümör, NANT veya normal tissue SN (nihai hacim 2.5 mi) daha sonra açıklık ve gelecekteki analizleri (aşağıya bakınız), -80 ° C'de saklama öncesi örnek olarak alındı.
  3. 50 ml tüpten atın.
  4. Yavaşça 1 ml ortam içinde nihai hacimde iki hücre pelletleri yeniden süspanse edin. Kısaca, ilk yavaşça (sert bir yüzeye tüp dokunarak) her iki tüpler hücre pelet kırmak. Ortamının 500 ul, 50 ml gevşek hücre pelletini ve ikinci pelet tekrar süspansiyon 15 ml'lik bir tüpe, bu hücre süspansiyonu aktarın. Hücrelerin maksimum kurtarma için orta ikinci 500 ul kez bu adımı tekrarlayın.
  5. Bir hemasitometre kullanarak canlı hücre sayısını ve: küçük bir tüp transfer hücre süspansiyonu, 10 ul, tripan mavisi 10 ul (1 seyreltme 1) ile karıştırın.
    NOT: Bu noktada, hücre süspansiyonunun bir fraksiyonu, aynı zamanda, hücre boyutu, granüllü değerlendirmek için akış sitometrisi ile analiz edilebilir ve daha PREC için alt popülasyonu, belirteçlerin sınırlı sayıda arzu edildiği takdirdeönce kapsamlı analiz veya deneylere homojenatında göreceli hücre dağılımının imkb değerlendirmesi. Akışı ile tüm analizler sitometri alt popülasyonlar normalleşmesi için CD45 etiketleme dahil.
  6. Oda sıcaklığında 10 dakika boyunca 300 x g'de santrifüj ile pelet hücreleri. tümör, NANT veya normal dokudan hücrelerin artık daha fazla arıtılmadan ya da analiz için hazırdır. Ameliyat ile aynı günde yapılan Bu ek adımlar en iyisidir.
    Not: akış sitometrik analiz için derhal 1 saniye girdap hücre pelletine alyuvar lisiz tamponu 0.4 mi eklenmesi ve oda sıcaklığında 10 dakika, en az inkübe edilerek Antikor etiketleme işleminden sonra lize gereken Elde edilen kırmızı kan hücreleri sıralama baz istasyonu analizden önce sıcaklığı (ışıktan korumalı).

Doku süpernatan 3. Açıklama

  1. 4 ° C'de 15 dakika boyunca 15,000 x g'de doku SN 1.5 ml tüpler santrifüjleyin.
  2. Dikkatle t kaldırmakO dokunmadan veya pelet bozmadan süpernatanlarına. Sayısı istenen alikotları hacmine bağlı olarak, temiz bir tüpe (veya borular) aktarın.
  3. Gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de süpernatan saklayın.

4. Hasta Kan

  1. Heparinli tüplere Venipunktür tarafından kontrol ameliyattan önce günde her hastadan kan örneği toplayın. Plazma ve buffy coat elde etmek fren kapalı olan 20 ºC de 10 dakika boyunca 400 xg'de kan santrifüj.
  2. Plazma çıkarın ve 20 ° C'de 15 dakika boyunca 10,000 x g'de santrifüj ile bir açıklık. Gelecekte kullanılmak üzere -80 ° C'de kısım ve mağaza plazma. Orta buffy coat seyreltin
  3. Hemen analiz alt popülasyonu izole DNA / RNA / protein ekstraksiyonu veya dondurarak saklama önce, standart bir Ficoll-hipak gradyan santrifüjlemesi kullanılarak, tek çekirdekli hücreler ayırın.

5. Akış Sitometri

  1. Üretim göre etiket hücreleriışıksız bir ortamda 4 ° C 'de r' talimatları. Hücre pelletine hücre parçalama tamponu içinde 0.4 ml ilave etmek suretiyle Antikor etiketleme işleminden sonra, doku parçalarından hücre süspansiyonlarında Lyse kırmızı kan hücreleri.
  2. Vorteks hemen 1 saniye ve ışıksız bir ortamda oda sıcaklığında 10 dakika, en az, inkübe edilir. Yıkamadan veri toplama için bir akış sitometresinde etiketli hücreler geçirin.

Sonuçlar

Ticari olarak temin edilebilen doku ayrılma çözeltiler ya da kollajenaz çeşitli laboratuar karışımları DNase ve / veya hiyaluronidaz önleyicileri ya da doku parçalarının enzimatik sindirim, hücre yüzeyi üzerindeki reseptörler çeşitli bölmektedir. Ilk olarak göğüs tümörlerini nüfuz eden CD4 + T hücreleri üzerinde duruldu Çalışmalarımız, hızlı bir şekilde bağlı standart enzimatik sindirim protokolleri 4-8 kullanılarak yüzey CD4 reseptör ayrılması için önem...

Tartışmalar

Bu çalışma, daha sonra hücre sıralama, ekstraksiyon, dondurarak saklama ve / veya CD45 + altgrupları fenotipik analizi için enzimatik sindirme, normal ve habis meme doku homojenatlarında hızlı hazırlanması için iyileştirilmiş bir yöntem tarif etmektedir. Bu deneysel yaklaşımın amacı yakından in vivo durumunu yansıtır ve ameliyathane taze dokuların az manipülasyon ile normal dokulara bunları karşılaştırmak TIL görüntüleri üretmektir. Bugüne kadar, bizim laboratuvar&g...

Açıklamalar

The authors declare that no conflict of interest exists.

Teşekkürler

Hibe tarafından desteklenen bu çalışma Bilimsel Araştırma (FNRS), Les Amis de l'Institut Bordet, FNRS-Opération Télévie, Belçika Planı Kanser, Fonds Lambeau-Marteaux, Fonds JC Heuson ve Fonds Barsy Belçika Fonu verdiğinde.

Malzemeler

NameCompanyCatalog NumberComments
GentleMacs DissociatorMiltenyi Biotec130-093-235BD Medimachine is somewhat equivalent
Centrifuge 5810 REppendorfor other standard table top centrifuge
Centrifuge 5417 REppendorfor other standard microcentrifuge
Esco Class II A2 Biosafety CabinetESCO globalor other standard BSL2 hood
Inverted MicroscopeNikon eclipse TS100or other microscope compatible for a hemacytometer
Bürker ChamberMarienfield 640210or other standard hemacytometer
Navios Flow CytometerBeckman Coulteror other flow cytometer (8-10 color recommended)
GentleMacs C-TubeMiltenyi Biotec130-096-344BD Medimachine uses Filcon
Cell Culture DishSarstedt72,710or other non-pyrogenic plasticware
Disposable ScalpelSwann-Morton0510or standard single use sterile scalpel
BD Cell Strainer 40 µmBecton Dickinson734-0002or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 50 mlBecton Dickinson352070or other non-pyrogenic plasticware
BD Falcon Tube 15 mlBecton Dickinson352097or other non-pyrogenic plasticware
BD FACS Tube 5 mlBecton Dickinson352008or other non-pyrogenic plasticware
Sterile Pasteur Pipette 5 mlVWR612-1685or other non-pyrogenic plasticware
Microfuge Tube 1.5 mlEppendorf7805-00or other non-pyrogenic plasticware
X-Vivo 20LonzaBE04-448Qserum-free medium recommended
Phosphate buffered salineLonzaBE17-516Fstandard physiological PBS
Trypan blueVWR17942Eor other vital stain
VersaLyseBeckman CoulterA09777for flow cytometry experiments
Fixable viability Dye eFluor 780eBioscience65-0865-14for flow cytometry experiments
anti-CD3 FITCBD Biosciences345763for flow cytometry experiments
anti-CD3 Vio BlueMiltenyi Biotec130-094-363for flow cytometry experiments
anti-CD4 PEBD Biosciences345769for flow cytometry experiments
anti-CD4 APCMiltenyi Biotec130-091-232for flow cytometry experiments
anti-CD8 ECDBeckman Coulter737659for flow cytometry experiments
anti-CD8 PerCPBD Biosciences345774for flow cytometry experiments
anti-CD19 APC-Vio770Miltenyi Biotec130-096-643for flow cytometry experiments
anti-CD45 VioGreenMiltenyi Biotec130-096-906for flow cytometry experiments

Referanslar

  1. Chen, D. S., Mellman, I. Oncology meets immunology: the cancer-immunity cycle. Immunity. 39 (1), 1-10 (2013).
  2. Boudreau, A., van't Veer, J. L., Bissell, M. J. An 'elite hacker': breast tumors exploit the normal microenvironment program to instruct their progression and biological diversity. Cell Adh Migr. 6 (3), 236-248 (2012).
  3. Gajewski, T. F., Schreiber, H., Fu, Y. X. Innate and adaptive immune cells in the tumor microenvironment. Nat Immunol. 14 (10), 1014-1022 (2013).
  4. Quezada, S. A., et al. Limited tumor infiltration by activated T effector cells restricts the therapeutic activity of regulatory T cell depletion against established melanoma. J Exp Med. 205 (9), 2125-2138 (2008).
  5. Grange, C., et al. Phenotypic characterization and functional analysis of human tumor immune infiltration after mechanical and enzymatic disaggregation. J Immunol Methods. 372 (1-2), 119-126 (2011).
  6. McCauley, H. A., Guasch, G. Serial orthotopic transplantation of epithelial tumors in single-cell suspension. Methods Mol Biol. 1035, 231-245 (2013).
  7. Gros, A., et al. Myeloid cells obtained from the blood but not from the tumor can suppress T-cell proliferation in patients with melanoma. Clin Cancer Res. 18 (19), 5212-5223 (2012).
  8. Zirakzadeh, A. A., Marits, P., Sherif, A., Winqvist, O. Multiplex B cell characterization in blood, lymph nodes, and tumors from patients with malignancies. J Immunol. 190 (11), 5847-5855 (2013).
  9. Gu-Trantien, C., et al. CD4(+) follicular helper T cell infiltration predicts breast cancer survival. J Clin Invest. 123 (7), 2873-2892 (2013).
  10. Buisseret, L., et al. Lymphocytes Infiltrating Breast Cancer : Density, Composition And Organization. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
  11. Garaud, S., et al. Characterization of B Cells Infiltrating Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 18 (2014).
  12. Gu-Trantien, C., et al. Cxcl13-Producing Follicular Helper T Cells In Human Breast Cancer. Annals of Oncology. 25 (1), 17 (2014).
  13. Yee, C. The use of endogenous T cells for adoptive transfer. Immunol Rev. 257 (1), 250-263 (2014).
  14. Butler, M. O., et al. Ex vivo expansion of human CD8+ T cells using autologous CD4+ T cell help. PLoS One. 7 (1), 30229 (2012).
  15. Ye, Q., et al. Engineered artificial antigen presenting cells facilitate direct and efficient expansion of tumor infiltrating lymphocytes. J Transl Med. 9, 131 (2011).

Yeniden Basımlar ve İzinler

Bu JoVE makalesinin metnini veya resimlerini yeniden kullanma izni talebi

Izin talebi

Daha Fazla Makale Keşfet

ImmunologySay 94T m r imm nolojit m r lenfositlerCD45G s kanseritaze doku homojenatenzimatik olmayan ayr lmatemel doku y zer

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Gizlilik

Kullanım Şartları

İlkeler

Araştırma

Eğitim

JoVE Hakkında

Telif Hakkı © 2020 MyJove Corporation. Tüm hakları saklıdır