جيل من الخلايا الجذعية الدهنية لجسم الإنسان من خلال فقد التمايز من الناضجة الخلايا الشحمية في الثقافات السقف

Summary

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

Abstract

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Introduction

In vitro dedifferentiation of mature adipocytes is achieved through a technique called ceiling culture¹. Because of their natural tendency to float in aqueous solutions, isolated mature adipocytes adhere to the surface of an inverted flask fully filled with culture medium. Over a few days, cells modify their spherical morphology and become fibroblast-like cells. The resulting cells, called dedifferentiated fat (DFAT) cells, are multipotent². Research articles on adipocyte dedifferentiation, especially on human cells, are limited. However, they have already provided interesting information regarding multipotency, cell phenotype and replicative capacity of DFAT cells². Mature adipocytes originating from various fat compartments have been successfully dedifferentiated including those originating from human visceral and subcutaneous adipose tissues^2-4. In addition to these depots, Kishimoto and collaborators sampled adipose tissue from the buccal fat pads and dedifferentiated adipocytes into DFAT cells⁵. Matsumoto and collaborators successfully generated subcutaneous DFAT cells from patients covering a wide range of ages, and the majority of cells had a high proliferative rate and less than 6% of senescence even after 10 passages in culture².

DFAT cells have been successfully re-differentiated into several lineages, including adipogenic, osteogenic, chondrogenic and neurogenic lineages^2,3,6. These cells express several embryonic stem cell markers such as Nanog and the four identified pluripotent factors Oct4, c-myc, Klf4 and Sox2³. They also express markers specific to each of the three germ layers⁷. In addition, DFAT cells are similar to Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells (BM-derived MSC) based on their epigenetic signature³. Exploiting the stem cell capacity of DFAT cells, many groups have investigated their potential to treat or improve various diseases^8,9. Improvements of pathologic conditions, such as infracted cardiac tissue, spinal cord injury and urethral sphincter dysfunction, have been observed with DFAT cell injections in rat models of disease^10-12.

In addition to the stem cell properties of DFAT cells, they may represent a new cellular model for adipocyte physiology studies. The 3T3-L1 cell line is often used for this purpose as these cells differentiate into adherent, lipid-storing adipocytes under adipogenic stimulation¹³. However, these cells originate from mouse embryo tissue¹³. Also, depot-specificity cannot be investigated with this model and it may not fully reflect human adipocyte physiology¹⁴. Other laboratories work with isolated adipose cells from murine fat depots, but fat distribution is not dimorphic in mice and anatomical configuration of the rodent's abdominal cavity prevents from extrapolating directly to humans¹⁵. In order to study adipocytes in the context of the physiopathology of human obesity, consideration of body fat distribution and fat depot-specific differences has become essential¹⁶. Some limitations of primary preadipocyte cultures, including cell quantities obtained from adipose tissue biopsy samples and their senescence after a few passages in culture, created the need for alternate models. Perrini and collaborators investigated depot-specificity in gene expression of DFAT cells originating from visceral and subcutaneous fat and compared them to adipose-derived stem cells (ASC) from the same fat depot. They demonstrated that differences in gene expression and function where mainly found between depots than between cell types, suggesting that DFAT cells are physiologically close to ASC from the same depot. DFAT cells may represent an interesting alternative to available models for studies on fat distribution in the pathophysiology of human obesity. Moreover, ceiling culture is a promising method to obtain adult stem cells for tissue engineering purposes.

Here, we describe collagenase digestion, a widely-used technique to isolate mature adipocytes from the subcutaneous and/or visceral fat samples¹⁷, and the subsequent steps to perform ceiling culture and dedifferentiate these cells into multipotent, fibroblast-like cells.

Protocol

بيان الأخلاق: تمت الموافقة على المشروع من قبل لجنة أخلاقيات البحث IUCPQ وقبل التوظيف المريض. لأغراض هذه المادة / الفيديو، حصلنا على الأنسجة من 2 المرضى: 1) مريض الذكور البالغ من العمر 62 مع مؤشر كتلة الجسم من 50.7 كجم / م ² و 2) مريضة البالغ من العمر 35 مع مؤشر كتلة الجسم من 57 كجم / م ^2. تجارب يمكن أن يتم مع كل من المقصورات الدهون، ولكن لم تقتصر على مقصورة الدهون واحد لغرض هذا الفيديو. تم تنفيذ الجوانب التقنية للفيديو مع المريض (1) وأجري FABP4 المناعي مع الخلايا dedifferentiated من مريض 2.

تجهيز 1. عينة

1. اسأل الجراحين لجمع الأنسجة الدهنية من المقصورات الدهون ثربية وتحت الجلد في وقت لعملية جراحية لعلاج البدانة بالمنظار.
2. جلب عينات الدهنية بسرعة إلى المختبر في RT ومعالجة الفور.
3. أداء الهضم في المختبر، في أجواء غير معقمة. الفي نهاية المطاف سوف يتم نقل الخلايا إلى غرفة الثقافة وزراعتها تحت ظروف معقمة. لتجنب التلوث، وإعداد عازلة KRH مع الماء المقطر ومرشح ومتابعة من قبل ترشيح (فلتر 0.22μM) قبل عملية الهضم. أنابيب نظيفة تماما مع الايثانول نقل مسبق في الخلية هود الثقافة لقارورة وإعداد لوحة.
4. وضع الأنسجة الدهنية على طبق المرجحة قبل والوزن قياسي. إصلاح قطعة صغيرة من كل عينة الأنسجة (أقل من 1 سم ²⁾ في 10٪ عازلة الفورمالين في RT لمدة 24 ساعة على الأقل قبل البارافين التضمين. استخدام هذه العينة جزءا لا يتجزأ من لتجارب المناعية (تقنية لا تظهر).
5. ضع قطعة أخرى في أنبوب 50 مل وفلاش-تجميد في النيتروجين السائل قبل تخزينها في -80 ° C لمزيد من الدراسات على الأنسجة الدهنية كلها (على سبيل المثال، التعبير الجيني - تقنية لا تظهر).

2. كولاجيناز الهضم

1. ضع قطعة الأنسجة الدهنية المتبقية في 50 مل تويكون للهضم.
2. إضافة 4 مل من KRH-WB تستكمل مع كولاجيناز (350 U / مل) في كل غرام من العينة في أنبوب الهضم.
3. تخطر الدهنية الأنسجة مع مقص.
4. وضع مفروم تعليق الأنسجة الدهنية في شاكر، 37 ° C، و 90 دورة في الدقيقة كحد أقصى، على بعد 45 دقيقة الحضانة (بحد أقصى 1 ساعة).

3. تنقية الخلايا الشحمية وPreadipocytes

1. من أجل حل شفافة مع قليل من قطع من الدهون من خلال النايلون 400 ميكرومتر شبكة في كوب من البلاستيك.
2. مع ملاقط، وفرك إعداد الخلايا على شبكة من النايلون ويغسل مع 5 مل من KRH-WB.
3. بدقة نقل تعليق خلية مرشح في أنبوب 50 مل مع أنابيب بلاستيكية في ذلك، وحقنة في 60cc تعلق في أقصى الأنابيب.
4. السماح للتعليق مع الخلايا الشحمية ناضجة الوقوف لمدة حوالي 10 دقيقة، مما يسمح للخلايا للوصول إلى أعلى العازلة الطرح.
5. نضح ببطء المخزن المؤقت في الجزء السفلي من الأنبوب باستخدام في 60cc syrinجنرال الكتريك الشفط.
6. إضافة 20 مل من KRH-WB لغسل. كرر من الخطوة 3.4 ل2 يغسل إضافية.
7. جمع المخزن المؤقت لجلب تعليق خلية شحمية إلى الحجم النهائي من 5 أو 10 مل، اعتمادا على كمية الخلايا. متابعة مع الخطوات الموجودة في القسم 5.
8. استرداد جزء-انسجة الوعائية من المخزن المؤقت التي تم جمعها مع الحقنة في 60cc بواسطة الطرد المركزي (3،000 دورة في الدقيقة، RT، 5 دقائق) لمزيد من الثقافة الخلية الأولية إذا رغبت (تقنية لا تظهر).

4. الناضجة خلية شحمية عدد الخلايا

1. تحميل 10 ميكرولتر من هز بلطف تعليق خلية شحمية في غرفة العد (haemocytometer). أداء عدد الخلايا في quadruplicate.
2. حساب عدد الخلايا الناضجة معزولة.

5. الناضجة خلية شحمية فقد التمايز إلى T-25 قارورة

1. ملء 25 سم ² الأنسجة قارورة الثقافة إلى ¾ من حجم مع DMEM / F12-20٪ العجل المصل.
2. وفقا لعدد خلايا، صب 500000 خلايا ناضجة في قارورة.
3. ملء قارورة تماما باستخدام أنبوب 50ML مع المتوسطة وإزالة العديد من الفقاعات ممكن.
4. المسمار غطاء unvented على القارورة.
5. تنظيف القارورة مع الايثانول قبل الحضانة لتجنب التلوث.
6. احتضان القارورة رأسا على عقب لمدة أسبوع دون لمسها لتجنب الحركة في الثقافة والذي قد يضر الالتزام الخلوية.
7. قبل عكس القارورة في 7 أيام من ثقافة مقلوب، والتعامل معها بلطف القارورة وإزالة كافة المتوسطة في قارورة بواسطة الشفط، وتجنب الحركات المفاجئة.
8. إضافة 12 مل من DMEM-F12-20٪ العجل المصل وزراعة الخلايا مع التقنيات القياسية. يمكن إضافة تصفيتها، وكأب تنفيس للقارورة.

6. الناضجة خلية شحمية فقد التمايز إلى لوحة 6 جيدا

1. وضع ساترة على الجزء السفلي من كل بئر من لوحة 6 جيدا
2. إضافة ½ "جلبة من البلاستيك على رأس كل ساترة.
3. ملء الآبار مع 8 مل من 20٪ العجل المصل DMEM المتوسطة.
4. وضع ساترة على كل جلبة البلاستيكية.
5. إدراج طرف الماصة بين الشريحة والأنبوب لحقن الخلايا تحت الشريحة (50،000 الخلايا لكل بئر).
6. احتضان لوحات في معيار ثقافة الخلية الحاضنة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO ₂ لمدة أسبوع.
7. ساترة العكسية مع خلايا المرفقة إلى كل منها يحتوي أيضا 2 مل من وسائل الإعلام تستكمل مع 20٪ مصل العجل ومتابعة الثقافة.
8. استخدام ساترة مع الخلايا التي تمر فقد التمايز لأغراض عدة بما في ذلك المناعي (تقنية لا تظهر).

النتائج

تحدث تغيرات شكلية الرئيسية لتنضج الخلايا الشحمية خلال فقد التمايز (الشكل 1). كما هو مبين في الشكل 2، كانت ملطخة الخلايا التي تمر فقد التمايز مع الأجسام المضادة لمكافحة FABP4 لتحليل مضان. أعربت الخلايا مع التشكل الجولة البروتين FABP4 في حين أن الغالبية الع...

Discussion

فقد التمايز من الخلايا الشحمية ناضجة مع تقنية ثقافة السقف هو نهج جديد للحصول على الخلايا الجذعية الدهنية من عينة صغيرة من الأنسجة الدهنية الأم. بناء على خبرتنا وأن الآخرين ^2، غرام واحد من الأنسجة غير كافية لوحة 25 سم ² قارورة والحصول على عدد سكانها خلايا DFAT ...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumine	Sigma	A7906
Adenosine	Sigma	A4036
Ascorbic acid	Sigma	A0278
NaCl			Any brand can be used
KCl			Any brand can be used
CaCl2			Any brand can be used
MgCl2			Any brand can be used
KH2PO4			Any brand can be used
HEPES			Any brand can be used
Glucose			Any brand can be used
Type I collagenase	Worthington Biochemical Corp	LS-004196
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red	Gibco-Life Technologies	11039-021	Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50µg/ml) and fungizone (2.5µg/ml)
Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves	Sigma	C8056-500ml
1/2 In plastic bushing	Iberville	2704-CP	SKU:1000120918 (Home Depot)
Liquid nitrogen	Linde
Formalin soluton, neutral buffered, 10%	SIGMA	HT501128
Sterile tweezers
Sterile scissors
60cc syringes	BD Syringe
Plastic tubing
Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH)			Prepare stock buffer as following: 25mM HEPES pH7.6, 125mM NaCl, 3.73mM KCl, 5mM CaCl2.2H2O, 2.5mM MgCl2.6H2O, 1mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4.
Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)			Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5mM glucose, 0.1µM adenosine, 560 µM ascorbic acid
KRH-WB supplemented with Type I collagenase			Add 350U/ml of Type I collagenase
T25 unvented cap tissue culture flask	Sarsted or other brand
6-well tissue culture plate	BD Falcon or other brand
Microscope cover glass 22x22	Fisherbrand	12-542-B
Sterile beakers