Generation of Human Fettgewebestammzellen durch Dedifferenzierung der Reife Adipozyten in Decken Kulturen

Zusammenfassung

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

Zusammenfassung

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Einleitung

In vitro dedifferentiation of mature adipocytes is achieved through a technique called ceiling culture¹. Because of their natural tendency to float in aqueous solutions, isolated mature adipocytes adhere to the surface of an inverted flask fully filled with culture medium. Over a few days, cells modify their spherical morphology and become fibroblast-like cells. The resulting cells, called dedifferentiated fat (DFAT) cells, are multipotent². Research articles on adipocyte dedifferentiation, especially on human cells, are limited. However, they have already provided interesting information regarding multipotency, cell phenotype and replicative capacity of DFAT cells². Mature adipocytes originating from various fat compartments have been successfully dedifferentiated including those originating from human visceral and subcutaneous adipose tissues^2-4. In addition to these depots, Kishimoto and collaborators sampled adipose tissue from the buccal fat pads and dedifferentiated adipocytes into DFAT cells⁵. Matsumoto and collaborators successfully generated subcutaneous DFAT cells from patients covering a wide range of ages, and the majority of cells had a high proliferative rate and less than 6% of senescence even after 10 passages in culture².

DFAT cells have been successfully re-differentiated into several lineages, including adipogenic, osteogenic, chondrogenic and neurogenic lineages^2,3,6. These cells express several embryonic stem cell markers such as Nanog and the four identified pluripotent factors Oct4, c-myc, Klf4 and Sox2³. They also express markers specific to each of the three germ layers⁷. In addition, DFAT cells are similar to Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells (BM-derived MSC) based on their epigenetic signature³. Exploiting the stem cell capacity of DFAT cells, many groups have investigated their potential to treat or improve various diseases^8,9. Improvements of pathologic conditions, such as infracted cardiac tissue, spinal cord injury and urethral sphincter dysfunction, have been observed with DFAT cell injections in rat models of disease^10-12.

In addition to the stem cell properties of DFAT cells, they may represent a new cellular model for adipocyte physiology studies. The 3T3-L1 cell line is often used for this purpose as these cells differentiate into adherent, lipid-storing adipocytes under adipogenic stimulation¹³. However, these cells originate from mouse embryo tissue¹³. Also, depot-specificity cannot be investigated with this model and it may not fully reflect human adipocyte physiology¹⁴. Other laboratories work with isolated adipose cells from murine fat depots, but fat distribution is not dimorphic in mice and anatomical configuration of the rodent's abdominal cavity prevents from extrapolating directly to humans¹⁵. In order to study adipocytes in the context of the physiopathology of human obesity, consideration of body fat distribution and fat depot-specific differences has become essential¹⁶. Some limitations of primary preadipocyte cultures, including cell quantities obtained from adipose tissue biopsy samples and their senescence after a few passages in culture, created the need for alternate models. Perrini and collaborators investigated depot-specificity in gene expression of DFAT cells originating from visceral and subcutaneous fat and compared them to adipose-derived stem cells (ASC) from the same fat depot. They demonstrated that differences in gene expression and function where mainly found between depots than between cell types, suggesting that DFAT cells are physiologically close to ASC from the same depot. DFAT cells may represent an interesting alternative to available models for studies on fat distribution in the pathophysiology of human obesity. Moreover, ceiling culture is a promising method to obtain adult stem cells for tissue engineering purposes.

Here, we describe collagenase digestion, a widely-used technique to isolate mature adipocytes from the subcutaneous and/or visceral fat samples¹⁷, and the subsequent steps to perform ceiling culture and dedifferentiate these cells into multipotent, fibroblast-like cells.

Protokoll

Ethics Statement: Das Projekt wurde von Forschungsethikkommission IUCPQ die vor der Rekrutierung von Patienten zugelassen. Für die Zwecke dieses Artikels / Video, erhalten wir Gewebe von 2 Patienten: 1) ein 62 Jahre alten männlichen Patienten mit einem BMI von 50,7 kg / m ² und 2) eine 35-jährige Patientin mit einem BMI von 57 kg / m ^2. Experimente können mit beiden Fettkompartimente geführt werden, sondern müssen eine Fettkammer für die Zwecke dieser Video beschränkt. Technische Aspekte der Video wurden mit Patienten-1 durchgeführt, und FABP4 Immunofluoreszenz wurde mit undifferenzierten Zellen von Patienten 2 durchgeführt.

1. Probenbearbeitung

1. Frag Chirurgen Fettgewebe aus den omentalis und subkutane Fett Fächer bei der laparoskopischen Adipositaschirurgie zu sammeln.
2. Bringen schnell adipose Proben an das Labor bei RT und sofort verarbeitet.
3. Führen Verdauung im Labor, in einer nicht sterilen Atmosphäre. DieZellen werden schließlich zu dem Kulturraum überführt und unter sterilen Bedingungen kultiviert werden. Um Verunreinigungen zu vermeiden, bereiten KRH-Puffer mit destilliertem Wasser und filtriert, und folgen Sie durch eine Filtration (0,22 um Filter) vor dem Aufschluss. Gründlich reinigen Rohre mit Ethanol vor Transfer in die Zellkultur Haube für Kolben und Plattenherstellung.
4. Zeigen Fettgewebe auf einem bereits gewichtet Gericht und Rekordgewicht. Fix ein kleines Stück von jeder Gewebeprobe (weniger als 1 cm ²⁾ in 10% Formalin-Puffer bei Raumtemperatur mindestens 24 Stunden vor der Paraffineinbettung. Verwenden Sie diese eingebetteten Probe für die Immunhistochemie Experimente (Technik nicht gezeigt).
5. Stellen Sie ein weiteres Stück in einem 50-ml-Tube und Flash-freeze in flüssigem Stickstoff vor der Lagerung bei -80 ° C für weitere Studien auf ganzen Fettgewebe (zB Genexpression - Technik nicht gezeigt).

2. Kollagenaseverdau

1. Legen Sie die übrigen Fettgewebe Stück in einem 50 ml-tuist für die Verdauung.
2. 4 ml KRH-WB mit Collagenase (350 U / ml) ergänzt pro Gramm Probe in dem Aufschlußbehälter.
3. Hackfleisch Fettgewebe mit einer Schere.
4. Platzieren Hackfleisch Fettgewebe Suspension in einem Schüttler bei 37 ° C, 90 Upm maximale, für eine 45-minütige Inkubation (für 1 h).

3. Reinigung von Adipozyten und Präadipozyten

1. Gießen Sie das durchscheinende Lösung mit wenigen Stücke von Fett durch ein 400 & mgr; M Nylon Netz in einen Kunststoffbecher.
2. Mit Pinzette, reiben Sie die Zellpräparation auf der Nylon-Mesh und wäscht mit 5 ml KRH-WB.
3. Die filtrierte Zellsuspension in ein 50 ml Röhrchen mit dem Kunststoffschlauch in ihm und einer 60 cm³-Spritze am Rohrglied befestigbar zart zu übertragen.
4. Lassen Sie die Suspension mit reifen Fettzellen stehen für etwa 10 Minuten, so dass die Zellen an die Spitze des Puffers durch Flotation zu erreichen.
5. Langsam absaugen Puffer am Boden des Röhrchens mit 60cc syringe Absaugung.
6. 20 ml KRH-WB zu waschen. Wiederholen Sie ab Schritt 3.4 für 2 zusätzliche Wäschen.
7. Sammeln Sie den Puffer, um die Adipozyten Suspension bis zu einem Endvolumen von 5 bzw. 10 ml zu bringen, abhängig von der Zellmenge. Verfolgen Sie mit den Schritten in Abschnitt 5.
8. Wiederherstellen des Stroma-Kreisfraktion aus der mit dem 60 cm³-Spritze durch Zentrifugation (3000 rpm, RT, 5 min) zur weiteren primären Zellkultur gesammelt falls Puffer (Technik nicht gezeigt).

4. Mature Adipocyte Zellzahl

1. Last 10 ul sanft geschüttelt Adipozyten-Suspension in einer Zählkammer (Hämozytometer). Führen Zellzahl in vierfacher Ausfertigung.
2. Berechnung der Anzahl der isolierten reifen Zellen.

5. Mature Adipocyte Dedifferenzierung in T-25-Kolben

1. Ein 25 cm ² Zellkulturflasche auf das Volumen mit DMEM / F12-20% Kälberserum ¾ füllen.
2. Nach Zellzahl, gießen 500.000 reifen Zellen in den Kolben.
3. Der Kolben wird komplett mit einem 50 ml Röhrchen mit Medium Füllen Sie und entfernen Sie so viele Blasen wie möglich.
4. Schrauben Sie den unbelüfteten Kappe auf den Kolben.
5. Der Kolben wird mit Ethanol vor der Inkubation zur Vermeidung von Verunreinigungen zu säubern.
6. Die Flasche auf den Kopf für eine Woche Inkubation ohne es zu berühren, um eine Bewegung in der Kultur, die Zelladhärenzfaktor stören könnten.
7. Vor der Umkehr des Kolbens bei 7 Tagen nach der umgekehrten Kultur vorsichtig die Flasche zu manipulieren und entfernen Sie alle Medium im Kolben durch Aspiration, die Vermeidung abrupter Bewegungen.
8. Fügen Sie 12 ml DMEM-F12-20% Kälberserum und pflegen Zellen mit Standardtechniken. Eine gefilterte, belüfteten Kappe kann in den Kolben gegeben werden.

6. Mature Adipocyte Dedifferenzierung in einer 6-Well-Platte

1. Legen Sie ein Deckglas auf dem Boden jeder Vertiefung einer Platte mit 6 Vertiefungen
2. Fügen Sie einen ½ "Kunststoffbuchse auf der jeweils Deckglas.
3. Füllen Vertiefungen mit 8 ml 20% Kälberserum-DMEM Medium.
4. Setzen Sie ein Deckglas auf jedem Kunststoffbuchse.
5. Legen Pipettenspitze zwischen dem Schieber und dem Rohr, Zellen unter dem Objektträger zu injizieren (50.000 Zellen pro Vertiefung).
6. Platten in einem Standardzellkulturbrutschrank bei 37 ° C mit 5% CO ₂ für eine Woche.
7. Reverse Deckglas mit anhaftenden Zellen in jeder Vertiefung, die 2 ml Medium mit 20% Kälberserum und verfolgen Kultur.
8. Verwenden Deck mit Zellen, die eine Dedifferenzierung für mehrere Zwecke, einschließlich Immunfluoreszenz (Technik nicht gezeigt).

Ergebnisse

Wichtige morphologische Veränderungen auftreten, um Fettzellen während der Entdifferenzierung (Abbildung 1) zu reifen. Wie in Figur 2 gezeigt ist, wurden Zellen, die eine Dedifferenzierung mit einem Anti FABP4 Antikörper zur Fluoreszenz-Analyse gefärbt. Zellen mit einem runden Morphologie äußerte die FABP4 Protein, während die Mehrheit der Fibroblasten-ähnlichen Zellen nicht. Nach Entdifferenzierung kann DFAT Zellen mit Standardverfahren für mehrere Passagen kultiviert werden. ...

Diskussion

Entdifferenzierung von reifen Fettzellen mit der Decke Kulturtechnik ist ein neues Konzept für die Fettgewebestammzellen aus einer kleinen Probe von einheimischen Fettgewebe erhalten. Aufgrund unserer Erfahrungen und die der anderen ² ist ein Gramm Gewebe ausreichend, um eine 25-cm ^2-Kolben Platte und eine Bevölkerung von DFAT Zellen, für die Homogenität von Poloni und Mitarbeiter ³ gezeigt zu erhalten. Adipocyte Entdifferenzierung scheint mit Zellen von jedem Spender möglich, unabh...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumine	Sigma	A7906
Adenosine	Sigma	A4036
Ascorbic acid	Sigma	A0278
NaCl			Any brand can be used
KCl			Any brand can be used
CaCl2			Any brand can be used
MgCl2			Any brand can be used
KH2PO4			Any brand can be used
HEPES			Any brand can be used
Glucose			Any brand can be used
Type I collagenase	Worthington Biochemical Corp	LS-004196
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red	Gibco-Life Technologies	11039-021	Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50µg/ml) and fungizone (2.5µg/ml)
Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves	Sigma	C8056-500ml
1/2 In plastic bushing	Iberville	2704-CP	SKU:1000120918 (Home Depot)
Liquid nitrogen	Linde
Formalin soluton, neutral buffered, 10%	SIGMA	HT501128
Sterile tweezers
Sterile scissors
60cc syringes	BD Syringe
Plastic tubing
Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH)			Prepare stock buffer as following: 25mM HEPES pH7.6, 125mM NaCl, 3.73mM KCl, 5mM CaCl2.2H2O, 2.5mM MgCl2.6H2O, 1mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4.
Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)			Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5mM glucose, 0.1µM adenosine, 560 µM ascorbic acid
KRH-WB supplemented with Type I collagenase			Add 350U/ml of Type I collagenase
T25 unvented cap tissue culture flask	Sarsted or other brand
6-well tissue culture plate	BD Falcon or other brand
Microscope cover glass 22x22	Fisherbrand	12-542-B
Sterile beakers