천장 문화 성숙한 지방 세포의 탈분화를 통해 인간 된 지방 줄기 세포의 생성

요약

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

초록

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

서문

In vitro dedifferentiation of mature adipocytes is achieved through a technique called ceiling culture¹. Because of their natural tendency to float in aqueous solutions, isolated mature adipocytes adhere to the surface of an inverted flask fully filled with culture medium. Over a few days, cells modify their spherical morphology and become fibroblast-like cells. The resulting cells, called dedifferentiated fat (DFAT) cells, are multipotent². Research articles on adipocyte dedifferentiation, especially on human cells, are limited. However, they have already provided interesting information regarding multipotency, cell phenotype and replicative capacity of DFAT cells². Mature adipocytes originating from various fat compartments have been successfully dedifferentiated including those originating from human visceral and subcutaneous adipose tissues^2-4. In addition to these depots, Kishimoto and collaborators sampled adipose tissue from the buccal fat pads and dedifferentiated adipocytes into DFAT cells⁵. Matsumoto and collaborators successfully generated subcutaneous DFAT cells from patients covering a wide range of ages, and the majority of cells had a high proliferative rate and less than 6% of senescence even after 10 passages in culture².

DFAT cells have been successfully re-differentiated into several lineages, including adipogenic, osteogenic, chondrogenic and neurogenic lineages^2,3,6. These cells express several embryonic stem cell markers such as Nanog and the four identified pluripotent factors Oct4, c-myc, Klf4 and Sox2³. They also express markers specific to each of the three germ layers⁷. In addition, DFAT cells are similar to Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells (BM-derived MSC) based on their epigenetic signature³. Exploiting the stem cell capacity of DFAT cells, many groups have investigated their potential to treat or improve various diseases^8,9. Improvements of pathologic conditions, such as infracted cardiac tissue, spinal cord injury and urethral sphincter dysfunction, have been observed with DFAT cell injections in rat models of disease^10-12.

In addition to the stem cell properties of DFAT cells, they may represent a new cellular model for adipocyte physiology studies. The 3T3-L1 cell line is often used for this purpose as these cells differentiate into adherent, lipid-storing adipocytes under adipogenic stimulation¹³. However, these cells originate from mouse embryo tissue¹³. Also, depot-specificity cannot be investigated with this model and it may not fully reflect human adipocyte physiology¹⁴. Other laboratories work with isolated adipose cells from murine fat depots, but fat distribution is not dimorphic in mice and anatomical configuration of the rodent's abdominal cavity prevents from extrapolating directly to humans¹⁵. In order to study adipocytes in the context of the physiopathology of human obesity, consideration of body fat distribution and fat depot-specific differences has become essential¹⁶. Some limitations of primary preadipocyte cultures, including cell quantities obtained from adipose tissue biopsy samples and their senescence after a few passages in culture, created the need for alternate models. Perrini and collaborators investigated depot-specificity in gene expression of DFAT cells originating from visceral and subcutaneous fat and compared them to adipose-derived stem cells (ASC) from the same fat depot. They demonstrated that differences in gene expression and function where mainly found between depots than between cell types, suggesting that DFAT cells are physiologically close to ASC from the same depot. DFAT cells may represent an interesting alternative to available models for studies on fat distribution in the pathophysiology of human obesity. Moreover, ceiling culture is a promising method to obtain adult stem cells for tissue engineering purposes.

Here, we describe collagenase digestion, a widely-used technique to isolate mature adipocytes from the subcutaneous and/or visceral fat samples¹⁷, and the subsequent steps to perform ceiling culture and dedifferentiate these cells into multipotent, fibroblast-like cells.

프로토콜

윤리 문 :이 프로젝트는 이전에 환자 모집에 IUCPQ의 연구 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 이 문서 / 비디오의 목적을 위해, 우리는이 환자의 조직을 얻을 : 1) 57kg의 체질량 지수 50.7 kg / m ^2, 2) 35 세 여자 환자의 BMI와 62 세 남자 환자 / ^2, m. 실험은 모두 지방 구획하여 수행 할 수 있지만,이 동영상의 목적을 위해 하나의 지방 구획에 한정되어왔다. 비디오의 기술적 인 측면은 환자 1 수행하고 FABP4 면역 형광이 환자 세포로부터 분화를 수행 하였다.

1. 시료 처리

1. 복강경 비만 수술시의 대망과 피하 지방 구획에서 지방 조직을 수집하는 외과 의사에게 문의하십시오.
2. 빠르게 RT에서 실험실로 지방 샘플을 가져 즉시 처리합니다.
3. 비 멸균 분위기에서, 실험실에서 소화를 수행합니다.결국 세포 배양실에 옮기고 멸균 조건 하에서 배양한다. 오염을 방지하기 위해, 소화 이전에 증류 여과 물 KRH 버퍼를 준비하고 여과 (0.22μM 필터)에 의해 수행합니다. 플라스크 및 플레이트 제조를위한 세포 배양 후드에서 에탄올 전에 전송으로 깨끗하게 청소 튜브.
4. 사전 가중 요리와 기록 체중에 지방 조직을 놓습니다. 파라핀 매립하기 전에 적어도 24 시간 동안 실온에서 10 % 포르말린 버퍼 내의 각 조직 샘플 (이하 1cm ^2)의 작은 조각을 고정. 면역 조직 화학 실험이 포함 된 샘플 (도시하지 않음 기술)를 사용합니다.
5. (- 기술 도시하지 않은 예는, 유전자 발현)이 전체 지방 조직에 대한 자세한 연구를 위해 -80 ° C에 저장하기 전에 액체 질소에 50 ml의 튜브와 플래시 동결의 다른 조각을 놓습니다.

2. 콜라게나 소화

1. 50 ㎖ TU의 나머지 지방 조직 조각을 배치소화합니다.
2. 소화 관에 시료의 g 당 콜라게나 제 (350 U / ml)로 보충 KRH-WB의 4 ML을 추가합니다.
3. 가위로 지방 조직을 말하다.
4. 45 분 배양 (최대 1 시간)에 대한 통에 37 ° C, 90 RPM의 최대, 다진 지방 조직 서스펜션을 놓습니다.

지방 세포 Preadipocytes 3. 정제

1. 플라스틱 비커에 메쉬 400 μm의 나일론을 통해 지방의 몇 덩어리 반투명 솔루션을 붓는다.
2. 핀셋, 나일론 메쉬에 셀 준비를 문질러 KRH-WB 5 ㎖로 세척한다.
3. 섬세 그것에 플라스틱 배관 및 배관 말단에 부착 된 60cc 주사기에 50 ㎖ 튜브에 여과 세포 현탁액을 전송합니다.
4. 성숙한 지방 세포 현탁액으로 세포가 부상하여 버퍼의 상단에 도달 할 수 있도록 약 10 분간 방치하자.
5. 천천히 60cc의 syrin를 사용하여 튜브의 하단에있는 버퍼를 대기음GE의 흡입.
6. KRH-WB 20 ml의 세척에 추가. 2 추가 세척을위한 단계 3.4에서 반복합니다.
7. 셀의 양에 따라, 5 또는 10 ㎖의 최종 부피로 지방 세포 현탁액을 가지고 수집 버퍼. 섹션 5에서 단계를 추구한다.
8. 원하는 경우 상기 일차 세포 배양 용 원심 60cc 주사기 (3000 RPM, RT, 5 분)으로 수집 버퍼로부터 간질 혈관 부분을 복구 (기술은 도시 생략).

4. 성숙한 지방 세포의 세포 수

1. 부하 계산 챔버 (혈구)에 부드럽게 흔들리고 지방 세포 현탁액의 10 μL. 4 번씩 세포 수를 수행합니다.
2. 격리 된 성숙한 세포의 수를 계산합니다.

T-25 플라스크에 5 성숙한 지방 세포 탈분화

1. DMEM / F12-20 %의 혈청을 사용하여 볼륨의 3/4 25cm ^두 조직 문화 플라스크를 입력합니다.
2. 세포 수에 따라, 플라스크 500,000 성숙한 세포를 붓는다.
3. 완전 배지로 50ML 튜브를 사용하여 플라스크를 채우고 가능한 많은 거품을 제거한다.
4. 플라스크에 환기가 안되는 캡 나사.
5. 오염을 방지하기 위해 배양하기 전에 에탄올로 플라스크를 청소합니다.
6. 세포의 흡착을 방해 할 수있는 문화 운동을 방지하기 위해 그것을 건드리지 않고 거꾸로 일주일 동안 플라스크를 품어.
7. 역 문화 7 일에서 플라스크를 반전하기 전에 부드럽게 갑작스러운 움직임을 방지, 플라스크를 조작하고 흡인하여 플라스크에 모든 매체를 제거합니다.
8. DMEM-F12-20 %의 혈청 12 ML을 추가하고 표준 기술을 가진 세포를 배양. 여과 벤트 캡 플라스크에 첨가 될 수있다.

6 웰 플레이트에 6 성숙한 지방 세포 탈분화

1. 6- 웰 플레이트의 각 웰의 바닥에 배치 커버 슬립
2. 각 커버 슬립 위에 ½ "플라스틱 부싱을 추가합니다.
3. 20 % 송아지 혈청 DMEM 매체의 8 ml로 우물을 입력합니다.
4. 각 플라스틱 부싱에 커버 슬립을 넣습니다.
5. 슬라이드 및 슬라이드에서 세포를 주입하는 튜브 (물론 당 50,000 세포) 사이의 피펫 팁을 삽입합니다.
6. 주 5 % CO _2, 37 ℃에서 표준 세포 배양 인큐베이터에서 인큐베이션 플레이트.
7. 각 웰에 20 % 송아지 혈청 미디어 2 ㎖를 포함하고 추구하는 문화에 부착 된 세포와 역 커버 슬립.
8. 세포가 면역 등 여러 가지 목적으로 탈분화를 겪고로 커버 슬립을 사용 (기술은 도시하지 않음).

결과

주요 형태 학적 변화는 탈분화 (그림 1) 동안 지방 세포를 성숙 발생합니다. 도 2에 도시 된 바와 같이, 탈분화을받은 세포는 형광 분석을위한 안티 FABP4 항체로 염색 하였다. 섬유 아세포 유사 세포의 대부분은하지 않았다 반면 라운드 형태로 세포 FABP4 단백질 발현. 탈분화 후 DFAT 세포는 여러 통로위한 표준 절차를 재배 할 수있다. 우리는 인간 피하 장간막 DFAT 세포주 대 ?...

토론

천장 배양법 성숙한 지방 세포의 탈분화 네이티브 지방 조직의 작은 샘플로부터 지방 줄기 세포를 얻기 위해 새로운 방식이다. 경험 등 ^(2)의 기준, 1g 조직은 25 ^cm-2 플라스크 판형하고 균질 Poloni 협력자 ^(3)에 의해 입증되었다 DFAT있는 세포 집단을 수득하기에 충분하다. 지방 세포의 탈분화는 독립적으로 연령, 성별 및 기타 특성, 어떤 기증자 세포 가능한 것 같다. DFAT는 얻?...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumine	Sigma	A7906
Adenosine	Sigma	A4036
Ascorbic acid	Sigma	A0278
NaCl			Any brand can be used
KCl			Any brand can be used
CaCl2			Any brand can be used
MgCl2			Any brand can be used
KH2PO4			Any brand can be used
HEPES			Any brand can be used
Glucose			Any brand can be used
Type I collagenase	Worthington Biochemical Corp	LS-004196
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red	Gibco-Life Technologies	11039-021	Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50µg/ml) and fungizone (2.5µg/ml)
Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves	Sigma	C8056-500ml
1/2 In plastic bushing	Iberville	2704-CP	SKU:1000120918 (Home Depot)
Liquid nitrogen	Linde
Formalin soluton, neutral buffered, 10%	SIGMA	HT501128
Sterile tweezers
Sterile scissors
60cc syringes	BD Syringe
Plastic tubing
Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH)			Prepare stock buffer as following: 25mM HEPES pH7.6, 125mM NaCl, 3.73mM KCl, 5mM CaCl2.2H2O, 2.5mM MgCl2.6H2O, 1mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4.
Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)			Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5mM glucose, 0.1µM adenosine, 560 µM ascorbic acid
KRH-WB supplemented with Type I collagenase			Add 350U/ml of Type I collagenase
T25 unvented cap tissue culture flask	Sarsted or other brand
6-well tissue culture plate	BD Falcon or other brand
Microscope cover glass 22x22	Fisherbrand	12-542-B
Sterile beakers