Geração de adiposo humano Stem Cells através Dedifferentiation de adipócitos maduros em Culturas de teto

Resumo

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

Resumo

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Introdução

In vitro dedifferentiation of mature adipocytes is achieved through a technique called ceiling culture¹. Because of their natural tendency to float in aqueous solutions, isolated mature adipocytes adhere to the surface of an inverted flask fully filled with culture medium. Over a few days, cells modify their spherical morphology and become fibroblast-like cells. The resulting cells, called dedifferentiated fat (DFAT) cells, are multipotent². Research articles on adipocyte dedifferentiation, especially on human cells, are limited. However, they have already provided interesting information regarding multipotency, cell phenotype and replicative capacity of DFAT cells². Mature adipocytes originating from various fat compartments have been successfully dedifferentiated including those originating from human visceral and subcutaneous adipose tissues^2-4. In addition to these depots, Kishimoto and collaborators sampled adipose tissue from the buccal fat pads and dedifferentiated adipocytes into DFAT cells⁵. Matsumoto and collaborators successfully generated subcutaneous DFAT cells from patients covering a wide range of ages, and the majority of cells had a high proliferative rate and less than 6% of senescence even after 10 passages in culture².

DFAT cells have been successfully re-differentiated into several lineages, including adipogenic, osteogenic, chondrogenic and neurogenic lineages^2,3,6. These cells express several embryonic stem cell markers such as Nanog and the four identified pluripotent factors Oct4, c-myc, Klf4 and Sox2³. They also express markers specific to each of the three germ layers⁷. In addition, DFAT cells are similar to Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells (BM-derived MSC) based on their epigenetic signature³. Exploiting the stem cell capacity of DFAT cells, many groups have investigated their potential to treat or improve various diseases^8,9. Improvements of pathologic conditions, such as infracted cardiac tissue, spinal cord injury and urethral sphincter dysfunction, have been observed with DFAT cell injections in rat models of disease^10-12.

In addition to the stem cell properties of DFAT cells, they may represent a new cellular model for adipocyte physiology studies. The 3T3-L1 cell line is often used for this purpose as these cells differentiate into adherent, lipid-storing adipocytes under adipogenic stimulation¹³. However, these cells originate from mouse embryo tissue¹³. Also, depot-specificity cannot be investigated with this model and it may not fully reflect human adipocyte physiology¹⁴. Other laboratories work with isolated adipose cells from murine fat depots, but fat distribution is not dimorphic in mice and anatomical configuration of the rodent's abdominal cavity prevents from extrapolating directly to humans¹⁵. In order to study adipocytes in the context of the physiopathology of human obesity, consideration of body fat distribution and fat depot-specific differences has become essential¹⁶. Some limitations of primary preadipocyte cultures, including cell quantities obtained from adipose tissue biopsy samples and their senescence after a few passages in culture, created the need for alternate models. Perrini and collaborators investigated depot-specificity in gene expression of DFAT cells originating from visceral and subcutaneous fat and compared them to adipose-derived stem cells (ASC) from the same fat depot. They demonstrated that differences in gene expression and function where mainly found between depots than between cell types, suggesting that DFAT cells are physiologically close to ASC from the same depot. DFAT cells may represent an interesting alternative to available models for studies on fat distribution in the pathophysiology of human obesity. Moreover, ceiling culture is a promising method to obtain adult stem cells for tissue engineering purposes.

Here, we describe collagenase digestion, a widely-used technique to isolate mature adipocytes from the subcutaneous and/or visceral fat samples¹⁷, and the subsequent steps to perform ceiling culture and dedifferentiate these cells into multipotent, fibroblast-like cells.

Protocolo

Declaração de Ética: O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da IUCPQ antes de recrutamento de pacientes. Para efeitos deste artigo / vídeo, obtivemos tecidos a partir de 2 pacientes: 1) um paciente do sexo masculino 62 anos de idade, com um IMC de 50,7 kg / m ² e 2) uma paciente de 35 anos de idade, com um IMC de 57 kg / m ^2. Experiências pode ser feito com ambos os compartimentos de gordura, mas têm sido limitadas a um compartimento de gordura para o propósito deste vídeo. Aspectos técnicos do vídeo foram realizadas com o paciente 1 e FABP4 imunofluorescência foi realizada com células indiferenciadas de paciente 2.

Processamento 1. Amostra

1. Peça cirurgiões para coletar tecido adiposo dos compartimentos de gordura omental e subcutâneas, no momento da cirurgia bariátrica laparoscópica.
2. Rapidamente trazer amostras de tecido adiposo para o laboratório da RT e processar imediatamente.
3. Executar a digestão no laboratório, numa atmosfera não-estéril. Océlulas acabará por ser transferida para a sala de cultura e cultivado em condições estéreis. Para evitar a contaminação, preparar tampão de KRH com água destilada e filtrou-se e seguir por filtração (filtro de 0,22 um) antes da digestão. Tubos cuidadosamente limpos com etanol prévia de transferência na capa de cultura celular para frasco e placa preparação.
4. Coloque o tecido adiposo em um prato pré-pesados ​​e peso recorde. Fixar um pequeno pedaço de cada amostra de tecido (menos de 1 cm ²⁾ em tampão de formalina a 10% à temperatura ambiente durante pelo menos 24 horas antes do bloco de parafina. Utilize esta amostra embutido para experimentos de imunohistoquímica (técnica não apresentado).
5. Coloque outra peça em um tubo de 50 ml e flash por congelação em azoto líquido antes do armazenamento a -80 ° C para estudos posteriores sobre os tecidos adiposos inteiros (por exemplo, a expressão do gene - técnica não mostrado).

2. Collagenase Digestão

1. Coloque o pedaço de tecido adiposo remanescente em 50 ml de um tuser para a digestão.
2. Adicionar 4 ml de KRH-WB suplementados com colagenase (350 U / ml) por grama de amostra no tubo de digestão.
3. Picar o tecido adiposo com uma tesoura.
4. Coloque suspensão de tecido adiposo picada num agitador, 37 ° C, máximo de 90 rpm, durante um período de incubação de 45 minutos (máximo 1 h).

3. Purificação de adipócitos e pré-adipócitos

1. Despeje a solução translúcida com alguns pedaços de gordura através de um nylon 400? M malha em um copo de plástico.
2. Com uma pinça, esfregue a preparação de células na malha de nylon e lavar com 5 ml de KRH-WB.
3. Delicadamente transferir a suspensão de células filtrada para um tubo de 50 ml com o tubo de plástico em que uma seringa de 60 cc e ligado na extremidade de tubos.
4. Deixe a suspensão com adipócitos maduros repouso durante aproximadamente 10 min, permitindo que as células atingissem a parte superior do tampão por flutuação.
5. Lentamente aspirar o tampão na parte inferior do tubo por meio de 60cc Syrinsucção ge.
6. Adicionar 20 ml de KRH-WB para lavar. Repita a partir do passo 3.4 para 2 lavagens adicionais.
7. Recolhe-se o tampão para trazer a suspensão dos adipócitos para um volume final de 5 ou 10 ml, dependendo da quantidade de células. Prosseguir com etapas na seção 5.
8. Recuperar a fracção do estroma vascular do tampão recolhido com a seringa de 60 cc por centrifugação (3000 rpm, TA, 5 min), para posterior cultura de células primária, se desejado (técnica não mostrado).

4. adipócito maduro Contagem de Células

1. Carregar 10 ml de suspensão de adipocitos suavemente agitada em uma câmara de contagem (hemocitómetro). Efectuar a contagem de células em quadruplicado.
2. Calcular o número de células maduras isoladas.

5. maduro adipócito Dedifferentiation em T-25 Flask

1. Encha a 25 ^cm2 de cultura de tecidos frasco a ¾ do volume com DMEM / F12-20% de soro.
2. De acordo com a contagem de células, despeje 500.000 células maduras no balão.
3. Encher o balão completamente através de um tubo de 50 ml com meio e retire o máximo de bolhas possível.
4. Colocar a tampa não ventilado no frasco.
5. Limpar o balão com etanol antes da incubação para evitar a contaminação.
6. Incubar o frasco de cabeça para baixo por uma semana sem tocá-lo para evitar o movimento na cultura que possa interromper a adesão celular.
7. Antes de inverter o frasco a 7 dias de cultura invertido, manipular suavemente o frasco e remover todo o meio no frasco por aspiração, evitando movimentos bruscos.
8. Adicionar 12 ml de DMEM-F12-20 soro% bezerro e cultivar células com técnicas convencionais. Um filtrada, tampa ventilada pode ser adicionado ao frasco.

6. adipócito maturo desdiferenciação em uma placa de 6 poços

1. Coloque uma lamela sobre o fundo de cada poço de uma placa de 6 poços
2. Adicionar um ½ "bucha de plástico em cima de cada lamela.
3. Encha os poços com 8 ml de 20% de meio de soro de vitelo-DMEM.
4. Coloque uma lamela em cada bucha de plástico.
5. Insira ponta da pipeta entre a lâmina e o tubo para injetar células sob o slide (50.000 células por poço).
6. Incubar as placas numa incubadora de cultura de células padrão, a 37 ° C com 5% de CO ₂ durante uma semana.
7. Lamela reverso com células ligadas em todos os poços contendo 2 ml de meio suplementado com 20% de soro de bezerro e perseguir cultura.
8. Use lamela com células submetidos desdiferenciação para vários fins, incluindo a imunofluorescência (técnica não mostrado).

Resultados

As principais alterações morfológicas ocorrer a amadurecer adipócitos durante desdiferenciação (Figura 1). Como mostrado na Figura 2, as células submetidas a desdiferenciação foram coradas com um anticorpo anti-FABP4 para análise de fluorescência. As células com uma morfologia redonda expressa a proteína FABP4 enquanto a maioria das células semelhantes a fibroblastos não o fez. Depois de desdiferenciação, células DFAT pode ser cultivada com os procedimentos padrão par...

Discussão

Desdiferenciação de adipócitos maduros com a técnica de cultura de tecto é uma nova abordagem para a obtenção de células estaminais do tecido adiposo a partir de uma pequena amostra de tecido adiposo nativa. Com base em nossa experiência e na de outros ^dois, um grama de tecido é suficiente para a chapa um balão de 25 cm ² e obter uma população de células DFAT para que homogeneidade tem sido demonstrado por Poloni e colaboradores ^3. Adipócito desdiferenciação parece poss?...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumine	Sigma	A7906
Adenosine	Sigma	A4036
Ascorbic acid	Sigma	A0278
NaCl			Any brand can be used
KCl			Any brand can be used
CaCl2			Any brand can be used
MgCl2			Any brand can be used
KH2PO4			Any brand can be used
HEPES			Any brand can be used
Glucose			Any brand can be used
Type I collagenase	Worthington Biochemical Corp	LS-004196
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red	Gibco-Life Technologies	11039-021	Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50 µg/ml) and fungizone (2.5 µg/ml)
Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves	Sigma	C8056-500 ml
1/2 In plastic bushing	Iberville	2704-CP	SKU:1000120918 (Home Depot)
Liquid nitrogen	Linde
Formalin soluton, neutral buffered, 10%	SIGMA	HT501128
Sterile tweezers
Sterile scissors
60 cc syringes	BD Syringe
Plastic tubing
Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH)			Prepare stock buffer as following: 25 mM HEPES pH 7.6, 125 mM NaCl, 3.73 mM KCl, 5 mM CaCl2.2H2O, 2.5 mM MgCl2.6H2O, 1 mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4.
Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)			Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5 mM glucose, 0.1 µM adenosine, 560 µM ascorbic acid
KRH-WB supplemented with Type I collagenase			Add 350 U/ml of Type I collagenase
T25 unvented cap tissue culture flask	Sarsted or other brand
6-well tissue culture plate	BD Falcon or other brand
Microscope cover glass 22x22	Fisherbrand	12-542-B
Sterile beakers