Генерация жировой стволовых клеток через дедифференцировка зрелые адипоциты в потолочных культур

Резюме

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

Аннотация

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Введение

In vitro dedifferentiation of mature adipocytes is achieved through a technique called ceiling culture¹. Because of their natural tendency to float in aqueous solutions, isolated mature adipocytes adhere to the surface of an inverted flask fully filled with culture medium. Over a few days, cells modify their spherical morphology and become fibroblast-like cells. The resulting cells, called dedifferentiated fat (DFAT) cells, are multipotent². Research articles on adipocyte dedifferentiation, especially on human cells, are limited. However, they have already provided interesting information regarding multipotency, cell phenotype and replicative capacity of DFAT cells². Mature adipocytes originating from various fat compartments have been successfully dedifferentiated including those originating from human visceral and subcutaneous adipose tissues^2-4. In addition to these depots, Kishimoto and collaborators sampled adipose tissue from the buccal fat pads and dedifferentiated adipocytes into DFAT cells⁵. Matsumoto and collaborators successfully generated subcutaneous DFAT cells from patients covering a wide range of ages, and the majority of cells had a high proliferative rate and less than 6% of senescence even after 10 passages in culture².

DFAT cells have been successfully re-differentiated into several lineages, including adipogenic, osteogenic, chondrogenic and neurogenic lineages^2,3,6. These cells express several embryonic stem cell markers such as Nanog and the four identified pluripotent factors Oct4, c-myc, Klf4 and Sox2³. They also express markers specific to each of the three germ layers⁷. In addition, DFAT cells are similar to Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells (BM-derived MSC) based on their epigenetic signature³. Exploiting the stem cell capacity of DFAT cells, many groups have investigated their potential to treat or improve various diseases^8,9. Improvements of pathologic conditions, such as infracted cardiac tissue, spinal cord injury and urethral sphincter dysfunction, have been observed with DFAT cell injections in rat models of disease^10-12.

In addition to the stem cell properties of DFAT cells, they may represent a new cellular model for adipocyte physiology studies. The 3T3-L1 cell line is often used for this purpose as these cells differentiate into adherent, lipid-storing adipocytes under adipogenic stimulation¹³. However, these cells originate from mouse embryo tissue¹³. Also, depot-specificity cannot be investigated with this model and it may not fully reflect human adipocyte physiology¹⁴. Other laboratories work with isolated adipose cells from murine fat depots, but fat distribution is not dimorphic in mice and anatomical configuration of the rodent's abdominal cavity prevents from extrapolating directly to humans¹⁵. In order to study adipocytes in the context of the physiopathology of human obesity, consideration of body fat distribution and fat depot-specific differences has become essential¹⁶. Some limitations of primary preadipocyte cultures, including cell quantities obtained from adipose tissue biopsy samples and their senescence after a few passages in culture, created the need for alternate models. Perrini and collaborators investigated depot-specificity in gene expression of DFAT cells originating from visceral and subcutaneous fat and compared them to adipose-derived stem cells (ASC) from the same fat depot. They demonstrated that differences in gene expression and function where mainly found between depots than between cell types, suggesting that DFAT cells are physiologically close to ASC from the same depot. DFAT cells may represent an interesting alternative to available models for studies on fat distribution in the pathophysiology of human obesity. Moreover, ceiling culture is a promising method to obtain adult stem cells for tissue engineering purposes.

Here, we describe collagenase digestion, a widely-used technique to isolate mature adipocytes from the subcutaneous and/or visceral fat samples¹⁷, and the subsequent steps to perform ceiling culture and dedifferentiate these cells into multipotent, fibroblast-like cells.

протокол

Заявление по этике: проект был одобрен Комитетом по этике научно-исследовательского IUCPQ заключения до набора пациентов. Для целей настоящей статьи / видео, мы получили ткани от 2 пациентов: 1) 62-летний пациент с ИМТ 50,7 кг / м ² и 2) 35-летняя женщина пациента с ИМТ 57 кг / м ^2. Эксперименты может быть сделано с обеих жира отсеков, но были ограничены одной жира отсека для целей этого видео. Технические аспекты видео были выполнены с пациентом 1 и FABP4 иммунофлюоресценции была выполнена с дедифференцированных клеток от пациента 2.

1. Пример обработки

1. Задать хирургов, чтобы собрать жировой ткани из сальника и подкожной клетчатки отсеков во время лапароскопической хирургии ожирения.
2. Быстро довести образцы жировой в лабораторию при комнатной температуре и обрабатывают немедленно.
3. Выполните пищеварение в лаборатории, в нестерильной обстановке.Клетки, в конечном счете быть переведен в культуральной комнате и культивировали в стерильных условиях. Чтобы избежать загрязнения, подготовить KRH буфер дистиллированной и отфильтрованной воды, а затем в фильтрации (0,22 мкм фильтр) до пищеварения. Тщательно чистые пробирки с этанолом предварительного передачи в капот культуре клеток на колбу и подготовки пластины.
4. Поместите жировой ткани на предварительно взвешенный блюдо и записи веса. Fix небольшой кусочек каждого образца ткани (менее 1 см ²⁾ в 10% буфера формалина при комнатной температуре в течение по крайней мере 24 часа до парафин. Используйте этот встроенный образец для иммуногистохимии экспериментов (техника не показано).
5. Поместите другую часть в 50-мл пробирку и флэш-замораживание в жидком азоте перед хранением при -80 ° С для дальнейших исследований на всю жировой ткани (например, экспрессии генов - метод не показан).

2. Коллагеназа Пищеварение

1. Поместите оставшиеся жировой ткани кусок в 50 мл Тубыть для пищеварения.
2. Добавить 4 мл KRH-WB с добавкой коллагеназы (350 ЕД / мл) на грамм образца в пробирку пищеварения.
3. Фарш жировой ткани с помощью ножниц.
4. Поместите фарш жировой ткани подвеску в шейкере, 37 ° C, 90 оборотов в минуту максимум, для 45-минутной инкубации (максимум 1 час).

3. Очистка адипоцитов и преадипоциты

1. Вылейте полупрозрачный решение с несколько кусков жира через 400 мкм нейлоновой сеткой в ​​пластиковом стакане.
2. С помощью пинцета, руб клеточный препарат на нейлоновую сетку и промыть 5 мл KRH-WB.
3. Тонко передачи отфильтрованного клеточной суспензии в 50 мл пробирку с пластиковой трубки в ней, и 60 мл шприц прикрепленной на конце трубы.
4. Пусть подвеска с зрелые адипоциты стоять в течение примерно 10 мин, позволяя клеткам, чтобы достичь вершины буфера путем размещения.
5. Медленно аспирата буфер в нижней части трубки с помощью 60 мл СиринGE всасывания.
6. Добавить 20 мл KRH-WB мыть. Повторите процедуру с шага 3.4 2 дополнительных промывок.
7. Собирают буфер довести адипоцитов суспензии до конечного объема 5 или 10 мл, в зависимости от количества клеток. Проводить с шагом в разделе 5.
8. Восстановление стромальных-сосудистой фракции из буфера собранных с 60 мл шприцом центрифугированием (3000 оборотов в минуту, РТ, 5 мин) для дальнейшего первичной культуры клеток при желании (метод не показан).

4. Зрелые Adipocyte сотовый Граф

1. Добавить 10 мкл осторожно встряхивают адипоцитов, взвешенная в счетной камере (гемоцитометре). Выполните подсчет клеток в четырех.
2. Рассчитать количество изолированных зрелых клеток.

5. Зрелые Adipocyte дедифференцировки в Т-25 колбу

1. Заполните 25 см ² культуре ткани колбу ¾ объема с DMEM / F12-20% телячьей сыворотки.
2. По количеству клеток, залить 500 000 зрелых клеток в колбе.
3. Заполните флягу полностью с помощью 50 мл трубку со средой и удалить как много пузырьков, как это возможно.
4. Винт в закрытой крышки на колбу.
5. Очистите колбу с этанолом до инкубации, чтобы избежать загрязнения.
6. Выдержите колбу с ног на голову в течение недели, не касаясь его, чтобы избежать движения в культуре, которые могут нарушить клеточный приверженность.
7. До вспять колбу 7 дней перевернутой культуры, мягко манипулировать колбу и удалить все среды в колбе путем аспирации, избегая резких движений.
8. Добавить 12 мл DMEM,-F12-20% сыворотки теленка, и культивируют клетки с помощью стандартных методов. Фильтруют, вентилируемые колпачок может быть добавлен в колбу.

6. Зрелые Adipocyte дедифференцировки в 6-луночного планшета

1. Поместите покровное на дно каждой лунки 6-луночного планшета с
2. Добавить ½ "пластмассовую втулку на верхней части каждой покровное.
3. Заполните скважин с 8 мл 20% телячьей сыворотки DMEM-среде.
4. Положите покровное на каждом пластмассовую втулку.
5. Вставка пипетки наконечник между стеклом и трубки для введения клеток в слайде (50000 клеток на лунку).
6. Планшеты инкубируют в стандартном инкубаторе для клеточных культур при 37 ° С с 5% СО ₂ в течение недели.
7. Обратный покровное с прикрепленными клеток в каждую лунку, содержащую 2 мл среды с добавкой 20% телячьей сыворотки и проводить культуры.
8. Использование покровное с клетки подвергаются дедифференцировку для нескольких целей, включая иммунофлюоресценции (метод не показан).

Результаты

Основные морфологические изменения происходят в зрелые адипоциты в течение дедифференцировки (рисунок 1). Как показано на фиг.2, клетки, проходящие дедифференцировку окрашивали анти-антитела FABP4 для флуоресцентного анализа. Клетки с круглым морфологии выразил белка F...

Обсуждение

Дедифференцировка зрелых адипоцитов с техникой потолок культуры является новый подход для получения жировой стволовых клеток из небольшого образца родной жировой ткани. Основываясь на нашем опыте и опыте других ^2, один грамм ткани достаточно пластине 25-см ² колбу и получит...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumine	Sigma	A7906
Adenosine	Sigma	A4036
Ascorbic acid	Sigma	A0278
NaCl			Any brand can be used
KCl			Any brand can be used
CaCl2			Any brand can be used
MgCl2			Any brand can be used
KH2PO4			Any brand can be used
HEPES			Any brand can be used
Glucose			Any brand can be used
Type I collagenase	Worthington Biochemical Corp	LS-004196
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red	Gibco-Life Technologies	11039-021	Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50µg/ml) and fungizone (2.5µg/ml)
Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves	Sigma	C8056-500ml
1/2 In plastic bushing	Iberville	2704-CP	SKU:1000120918 (Home Depot)
Liquid nitrogen	Linde
Formalin soluton, neutral buffered, 10%	SIGMA	HT501128
Sterile tweezers
Sterile scissors
60cc syringes	BD Syringe
Plastic tubing
Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH)			Prepare stock buffer as following: 25mM HEPES pH7.6, 125mM NaCl, 3.73mM KCl, 5mM CaCl2.2H2O, 2.5mM MgCl2.6H2O, 1mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4.
Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)			Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5mM glucose, 0.1µM adenosine, 560 µM ascorbic acid
KRH-WB supplemented with Type I collagenase			Add 350U/ml of Type I collagenase
T25 unvented cap tissue culture flask	Sarsted or other brand
6-well tissue culture plate	BD Falcon or other brand
Microscope cover glass 22x22	Fisherbrand	12-542-B
Sterile beakers