דור של תאי גזע שומן האדם דרך Dedifferentiation של מבוגרים adipocytes בתרבויות תקרה

Summary

Mature adipocytes may represent an abundant source of stem cells through dedifferentiation, which leads to a homogenous population of fibroblast-like cells. Collagenase digestion is used to isolate mature adipocytes from human fat. The goal of our protocol is to obtain multipotent, dedifferentiated fat cells from human mature adipocytes.

Abstract

Mature adipocytes have been shown to reverse their phenotype into fibroblast-like cells in vitro through a technique called ceiling culture. Mature adipocytes can also be isolated from fresh adipose tissue for depot-specific characterization of their function and metabolic properties. Here, we describe a well-established protocol to isolate mature adipocytes from adipose tissues using collagenase digestion, and subsequent steps to perform ceiling cultures. Briefly, adipose tissues are incubated in a Krebs-Ringer-Henseleit buffer containing collagenase to disrupt tissue matrix. Floating mature adipocytes are collected on the top surface of the buffer. Mature cells are plated in a T25-flask completely filled with media and incubated upside down for a week. An alternative 6-well plate culture approach allows the characterization of adipocytes undergoing dedifferentiation. Adipocyte morphology drastically changes over time of culture. Immunofluorescence can be easily performed on slides cultivated in 6-well plates as demonstrated by FABP4 immunofluorescence staining. FABP4 protein is present in mature adipocytes but down-regulated through dedifferentiation of fat cells. Mature adipocyte dedifferentiation may represent a new avenue for cell therapy and tissue engineering.

Introduction

In vitro dedifferentiation of mature adipocytes is achieved through a technique called ceiling culture¹. Because of their natural tendency to float in aqueous solutions, isolated mature adipocytes adhere to the surface of an inverted flask fully filled with culture medium. Over a few days, cells modify their spherical morphology and become fibroblast-like cells. The resulting cells, called dedifferentiated fat (DFAT) cells, are multipotent². Research articles on adipocyte dedifferentiation, especially on human cells, are limited. However, they have already provided interesting information regarding multipotency, cell phenotype and replicative capacity of DFAT cells². Mature adipocytes originating from various fat compartments have been successfully dedifferentiated including those originating from human visceral and subcutaneous adipose tissues^2-4. In addition to these depots, Kishimoto and collaborators sampled adipose tissue from the buccal fat pads and dedifferentiated adipocytes into DFAT cells⁵. Matsumoto and collaborators successfully generated subcutaneous DFAT cells from patients covering a wide range of ages, and the majority of cells had a high proliferative rate and less than 6% of senescence even after 10 passages in culture².

DFAT cells have been successfully re-differentiated into several lineages, including adipogenic, osteogenic, chondrogenic and neurogenic lineages^2,3,6. These cells express several embryonic stem cell markers such as Nanog and the four identified pluripotent factors Oct4, c-myc, Klf4 and Sox2³. They also express markers specific to each of the three germ layers⁷. In addition, DFAT cells are similar to Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells (BM-derived MSC) based on their epigenetic signature³. Exploiting the stem cell capacity of DFAT cells, many groups have investigated their potential to treat or improve various diseases^8,9. Improvements of pathologic conditions, such as infracted cardiac tissue, spinal cord injury and urethral sphincter dysfunction, have been observed with DFAT cell injections in rat models of disease^10-12.

In addition to the stem cell properties of DFAT cells, they may represent a new cellular model for adipocyte physiology studies. The 3T3-L1 cell line is often used for this purpose as these cells differentiate into adherent, lipid-storing adipocytes under adipogenic stimulation¹³. However, these cells originate from mouse embryo tissue¹³. Also, depot-specificity cannot be investigated with this model and it may not fully reflect human adipocyte physiology¹⁴. Other laboratories work with isolated adipose cells from murine fat depots, but fat distribution is not dimorphic in mice and anatomical configuration of the rodent's abdominal cavity prevents from extrapolating directly to humans¹⁵. In order to study adipocytes in the context of the physiopathology of human obesity, consideration of body fat distribution and fat depot-specific differences has become essential¹⁶. Some limitations of primary preadipocyte cultures, including cell quantities obtained from adipose tissue biopsy samples and their senescence after a few passages in culture, created the need for alternate models. Perrini and collaborators investigated depot-specificity in gene expression of DFAT cells originating from visceral and subcutaneous fat and compared them to adipose-derived stem cells (ASC) from the same fat depot. They demonstrated that differences in gene expression and function where mainly found between depots than between cell types, suggesting that DFAT cells are physiologically close to ASC from the same depot. DFAT cells may represent an interesting alternative to available models for studies on fat distribution in the pathophysiology of human obesity. Moreover, ceiling culture is a promising method to obtain adult stem cells for tissue engineering purposes.

Here, we describe collagenase digestion, a widely-used technique to isolate mature adipocytes from the subcutaneous and/or visceral fat samples¹⁷, and the subsequent steps to perform ceiling culture and dedifferentiate these cells into multipotent, fibroblast-like cells.

Protocol

הצהרת אתיקה: הפרויקט אושר על ידי ועדת האתיקה של מחקר IUCPQ לפני גיוס חולה. לצורך המאמר / הווידאו הזה, שהשגנו רקמות מ2 חולים: 1) מטופל זכר 62 שנים ישנות עם BMI של 50.7 קילוגרם / מ ² ו- 2) מטופלת בת 35 עם BMI של 57 קילוגרם / M ^2. ניתן לעשות ניסויים עם שני תאי השומן, אך היו מוגבלים לתא אחד שומן לצורך זה וידאו. היבטים טכניים של הווידאו בוצעו עם מטופל 1 וimmunofluorescence FABP4 בוצע בתאי dedifferentiated מחולה 2.

עיבוד 1. לדוגמא

1. שאל מנתחים לאסוף רקמת שומן מתאי השומן תת עורי וomental בעת הניתוח בריאטרי לפרוסקופי.
2. במהירות להביא דוגמאות שומן למעבדה בRT ולעבד באופן מיידי.
3. בצע עיכול במעבדה, באווירה שאינה סטרילי.תאי סופו של דבר הועברו לחדר התרבות וטיפחו בתנאים סטריליים. כדי למנוע זיהום, להכין חיץ KRH עם מים מזוקקים וfiltrated ומעקב על ידי סינון (מסנן 0.22μM) לפני העיכול. צינורות לנקות ביסודיות עם העברה לפני אתנול במכסת מנוע תרבית תאים לבקבוק והכנת צלחת.
4. הנח רקמת שומן במנה משוקללת מראש ומשקל שיא. תקן את חתיכה קטנה של כל דגימת רקמה (סנטימטר פחות מ 1 ²⁾ ב 10% חיץ פורמלין ב RT לפחות 24 שעות לפני הטבעת פרפין. השתמש בדוגמה זו הגלומה לניסויי אימונוהיסטוכימיה (טכניקה לא מוצגת).
5. מניחים חתיכה בצינור 50 מ"ל ובזק-הקפאה בחנקן נוזלי אחרת לפני האחסון ב -80 ° C למחקרים נוספים ברקמות שומן שלמות (למשל, ביטוי גנים - טכניקה לא מוצג).

2. Collagenase עיכול

1. מניחים את פיסת רקמת שומן שנותרה במיליליטר tu 50להיות לעיכול.
2. הוסף 4 מיליליטר של KRH-WB בתוספת collagenase (350 U / ml) לגרם של מדגם בצינור העיכול.
3. ברר ברקמת שומן במספריים.
4. מניחים השעיה רקמת שומן טחון שייקרה, 37 ° C, 90 מקסימום סל"ד, לדגירה של 45 דקות (שעה 1 המרבית).

3. טיהור של תאי שומן וPreadipocytes

1. יוצקים את הפתרון השקוף עם כמה נתחי השומן באמצעות ניילון 400 מיקרומטר רשת לתוך כוס פלסטיק.
2. עם פינצטה, לשפשף את הכנת התא ברשת הניילון ולשטוף עם 5 מיליליטר של KRH-WB.
3. בעדינות להעביר את ההשעיה תא filtrated לתוך צינור 50 מיליליטר עם צינורות פלסטיק בזה ומזרק 60cc המצורף בקצה הצינור.
4. בואו ההשעיה עם adipocytes הבוגרת עומדת על כ 10 דקות, שמאפשרת לתאים כדי להגיע לחלק העליון של המאגר על ידי ציפה.
5. לאט לאט לשאוב החיץ בחלק התחתון של הצינור באמצעות syrin 60ccיניקת ge.
6. להוסיף 20 מיליליטר של KRH-WB לשטוף. חזור מצעד 3.4 ל -2 שוטף נוסף.
7. לאסוף את החיץ להביא את ההשעיה adipocyte לנפח סופי של 5 או 10 מיליליטר, בהתאם לכמות תאים. להמשיך עם שלבים בסעיף 5.
8. לשחזר את חלק סטרומה וכלי דם למאגר שנאסף עם מזרק 60cc ידי צנטריפוגה (3,000 סל"ד, RT, 5 דקות) לתרבית תאים עיקריות נוספת אם תרצה בכך (טכניקה לא מוצגת).

ספירת תאים 4. למבוגרים adipocyte

1. טען 10 μl של ההשעיה adipocyte מזועזעת בעדינות בתא ספירה (haemocytometer). לבצע ספירת תאים ארבע פעמים.
2. לחשב מספר התאים בוגרים מבודדים.

5. מבוגרים adipocyte Dedifferentiation לT-25 Flask

1. מלא בקבוק תרבות ² רקמה 25 סנטימטרים עד ¾ מההיקף עם / F12-20% בסרום עגל DMEM.
2. , על פי ספירת תאים לשפוך 500,000 תאים בוגרים לתוך הבקבוק.
3. למלא את הבקבוק באמצעות צינור 50 מ"ל עם מדיום לחלוטין ולהסיר בועות רבות ככל האפשר.
4. לדפוק את כובע unvented על הבקבוק.
5. נקה את הבקבוק עם אתנול לפני דגירה, כדי למנוע זיהום.
6. דגירה הבקבוק הפוך במשך שבוע מבלי לגעת בו כדי למנוע תנועה בתרבות שעלולה לשבש את הדבקות סלולרית.
7. לפני היפוך הבקבוק ב 7 ימים של תרבות ההפוכה, בעדינות לתפעל את הבקבוק ולהסיר את כל המדיום בבקבוק על ידי שאיפה, הימנעות תנועות פתאומיות.
8. להוסיף 12 מיליליטר של סרום עגל% DMEM-F12-20 ולטפח תאים עם טכניקות סטנדרטיים. כובע מסונן, פרק ניתן להוסיף לבקבוק.

6. למבוגרים adipocyte Dedifferentiation לתוך צלחת 6-גם

1. מניחים coverslip על החלק התחתון של כל טוב של 6-גם צלחת
2. הוסף "תותב פלסטיק ½ על גבי כל coverslip.
3. מלא בארות עם 8 מיליליטר של 20% בינוניים עגל סרום-DMEM.
4. שים coverslip על כל תותב פלסטיק.
5. הכנס קצה pipet בין השקופיות והצינור להזרמת תאים שמתחת לסליידר (50,000 תאים לכל טוב).
6. דגירה צלחות בתרבית תאי חממה סטנדרטית על 37 מעלות צלזיוס עם 5% CO ₂ במשך שבוע.
7. coverslip ההפוך עם תאים מצורפים לכל תרבות היטב המכיל 2 מיליליטר של תקשורת בתוספת 20% בסרום עגל ולהמשיך.
8. השתמש coverslip עם התאים עוברים dedifferentiation למספר מטרות כוללים immunofluorescence (טכניקה לא מוצגת).

תוצאות

שינויים מורפולוגיים גדולים נוצרים להתבגר adipocytes במהלך dedifferentiation (איור 1). כפי שניתן לראות באיור 2, תאים עוברים dedifferentiation הוכתמו נוגדן אנטי FABP4 לניתוח הקרינה. תאים עם מורפולוגיה עגולה הביעו חלבון FABP4 בעוד רוב התאים כמו פיברובלסטים-לא. לאחר dedifferentiation, יכו...

Discussion

Dedifferentiation של תאי שומן בוגרים עם טכניקת תרבות התקרה היא גישה חדשה להשגת תאי גזע שומן ממדגם קטן של רקמת שומן מקומית. בהתבסס על הניסיון שלנו ושל אחרים ^2, גרם אחד של רקמה מספיקה לצלחת בקבוק ² 25 סנטימטר ולהשיג אוכלוסייה של תאי DFAT שהומוגניות הודגמה על ידי Poloni ומשת?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Bovine serum albumine	Sigma	A7906
Adenosine	Sigma	A4036
Ascorbic acid	Sigma	A0278
NaCl			Any brand can be used
KCl			Any brand can be used
CaCl2			Any brand can be used
MgCl2			Any brand can be used
KH2PO4			Any brand can be used
HEPES			Any brand can be used
Glucose			Any brand can be used
Type I collagenase	Worthington Biochemical Corp	LS-004196
DMEM/F-12, HEPES, no phenol red	Gibco-Life Technologies	11039-021	Add to medium : 20% calf serum, gentamicin (50µg/ml) and fungizone (2.5µg/ml)
Calf Serum, iron supplemented, from formula-fed calves	Sigma	C8056-500ml
1/2 In plastic bushing	Iberville	2704-CP	SKU:1000120918 (Home Depot)
Liquid nitrogen	Linde
Formalin soluton, neutral buffered, 10%	SIGMA	HT501128
Sterile tweezers
Sterile scissors
60cc syringes	BD Syringe
Plastic tubing
Krebs-Ringer-Henseleit stock buffer (KRH)			Prepare stock buffer as following: 25mM HEPES pH7.6, 125mM NaCl, 3.73mM KCl, 5mM CaCl2.2H2O, 2.5mM MgCl2.6H2O, 1mM K2HPO4. Adjust pH to 7.4.
Krebs-Ringer-Henseleit-Working Buffer (KRH-WB)			Add the following components freshly to KRH buffer: 4% bovine serum albumin, 5mM glucose, 0.1µM adenosine, 560 µM ascorbic acid
KRH-WB supplemented with Type I collagenase			Add 350U/ml of Type I collagenase
T25 unvented cap tissue culture flask	Sarsted or other brand
6-well tissue culture plate	BD Falcon or other brand
Microscope cover glass 22x22	Fisherbrand	12-542-B
Sterile beakers