JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Here, we present detailed protocols for solid-state amide hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry (ssHDX-MS) and solid-state photolytic labeling mass spectrometry (ssPL-MS) for proteins in solid powders. The methods provide high-resolution information on protein conformation and interactions in the amorphous solid-state, which may be useful in formulation design.

Abstract

أميد الهيدروجين / تبادل الديوتيريوم (ssHDX-MS)، وجنبا إلى سلسلة العلامات التحلل الضوئي (SSPL-MS)، يليه التحليل الطيفي الشامل يمكن أن يكون قيما للتميز تركيبات مجفف بالتجميد من العلاجات البروتين. وضع العلامات تليها الهضم بروتين مناسب يسمح للبنية البروتين والتفاعلات ليتم تعيينها لقرار على مستوى الببتيد. منذ البروتين واستقرت العناصر الهيكلية من خلال شبكة من الروابط الكيميائية من سلاسل الرئيسية والجانبية سلاسل من الأحماض الأمينية، ووضع العلامات محدد من الذرات في بقايا الأحماض الأمينية يوفر نظرة ثاقبة هيكل والتشكل من البروتين. وعلى النقيض من الأساليب الروتينية تستخدم لدراسة البروتينات في المواد الصلبة مجفف بالتجميد (على سبيل المثال، FTIR)، ssHDX-MS وSSPL-MS توفير المعلومات الكمية وللموقع المحدد. مدى التأسيس الديوتيريوم والمعلمات الحركية يمكن أن تكون ذات صلة بسرعة وببطء تبادل حمامات الأميد (سريع N، N بطيئة)، ويعكس بشكل مباشر على درجةري للطي البروتين وهيكل في تركيبات مجفف بالتجميد. وضع العلامات الضوئي مستقر لا يخضع العودة الصرف، وميزة على ssHDX-MS. هنا، ونحن نقدم بروتوكولات وإجراءات تفصيلية لكلا ssHDX-MS وSSPL-MS، وذلك باستخدام الميوجلوبين (ميغابايت)، وبروتين نموذج في تركيبات مجفف بالتجميد تحتوي إما طرهالوز أو السوربيتول.

Introduction

الأدوية البروتينية هي أسرع القطاعات نموا في صناعة المستحضرات الصيدلانية الحيوية وتوفر علاجات جديدة واعدة لعلاج أمراض مستعصية في السابق، بما في ذلك اضطرابات هرمونية، وأمراض السرطان وأمراض المناعة الذاتية 1. في عام 2012، وصلت في السوق العالمي biotherapeutics 138000000000 $، ومن المتوقع أن تصل إلى 179000000000 $ بحلول عام 2018 2. البروتينات هي أكبر وأكثر هشاشة من المخدرات جزيء صغير التقليدية وهكذا هي أكثر عرضة لأنواع عديدة من التدهور 3. لضمان ملائمة الجرف الحياة والاستقرار، وغالبا ما يتم وضعها الأدوية البروتينية مثل مجفف بالتجميد (أي تجميد المجفف) مساحيق الصلبة. ومع ذلك، قد بروتين لا يزال يخضع التدهور في الحالة الصلبة، وخاصة إذا لم يتم الحفاظ على هيكلها الأصلي خلال 4،5 عملية تجفيد. ضمان تم الاحتفاظ هذا الهيكل غير ممكنا إلا إذا كانت هناك طرق التحليل التي يمكن تحقيق البروتين التشكل في دولة متينة مع sufficienر القرار.

NMR الطيفي 6 و البلورات بالأشعة السينية 7 هي الأساليب عالية الدقة تستخدم عادة لتقييم بنية البروتين في حل والمواد الصلبة البلورية 8. ونظرا لطبيعة سواغ وطرق المعالجة المستخدمة، تركيبات البروتين مجفف بالتجميد وعادة ما تكون غير متبلور بدلا من 9 البلورية. عدم وجود التجانس والنظام المجهري يجعل التقنيات المذكورة أعلاه غير عملي للبروتينات في المواد الصلبة غير متبلور. تحويل فورييه الطيفي بالأشعة تحت الحمراء (FTIR) 10، 11 رامان الطيفي والقريب الطيفي بالأشعة تحت الحمراء (الجرد) 12 وقد استخدمت بانتظام من قبل الصناعة الصيدلانية البيولوجية للمقارنة البروتين هيكل الثانوي في مساحيق مجفف بالتجميد إلى أن من هيكل للدولة حل الأصلي. ومع ذلك، وهذه الأساليب هي دقة منخفضة ويمكن أن توفر معلومات عن التغيرات العالمية في هيكل الثانوي فقط. توصيف الهيكلي الحالة الصلبة باستخدام FTIRوقد أظهرت إما ضعيفة أو فقيرة 13،14 15 العلاقة مع استقرار التخزين على المدى الطويل. هذه القيود تسلط الضوء على الحاجة إلى أساليب مناسبة عالية الدقة لتحديد الاضطرابات الهيكلية البروتين في الحالة الصلبة.

وقد برزت العلامات الكيميائية إلى جانب التحلل البروتيني والتحليل الطيفي الشامل باعتبارها نهجا قويا لمراقبة بنية البروتين والتفاعلات الجزيئية في محلول مائي. في تطوير المستحضرات الصيدلانية، وقد استخدمت HDX-MS لرسم خرائط حاتمة في ضد مستضد التفاعلات 16،17، لرسم خريطة التفاعلات مستقبلات المخدرات 18، لرصد آثار التعديلات بعد متعدية على التشكل من المخدرات البروتين 19، وللمقارنة تباين دفعة إلى دفعة في تطوير البدائل الحيوية 20. وبالمثل، استخدمت بروابط photoactivatable لتحديد أهداف المخدرات وتحديد تقارب ملزمة وخصوصية التفاعلات المخدرات مستقبلات 21،22. إلى البريدXTEND تطبيق هذه الأساليب لتركيبات مجفف بالتجميد، وقد وضعت مجموعتنا الحالة الصلبة الطيف الصرف الديوتريوم الهيدروجين كتلة (ssHDX-MS)، والحالة الصلبة قياس الطيف الضوئي وضع العلامات الجماعية (SSPL-MS) لدراسة التشكل البروتين والتفاعلات سواغ في عينات مجفف بالتجميد مع ارتفاع القرار.

في كل ssHDX-MS وSSPL-MS، يسمى البروتين تحت ظروف التفاعل المثالية في المواد الصلبة مجفف بالتجميد، ومن ثم يتم إعادة تشكيل العينات وتحليلها بواسطة مطياف الكتلة مع أو بدون هضم بروتين. يوفر ssHDX-MS معلومات عن التعرض الرئيسي لبخار الديوتيريوم السلسلة، في حين يوفر SSPL-MS المعلومات عن البيئة من السلاسل الجانبية (الشكل 1). طريقتين بالتالي يمكن أن توفر معلومات تكميلية حول التشكل البروتين في الحالة الصلبة. هنا، ونحن نقدم بروتوكول عام لدراسة البروتينات في المواد الصلبة باستخدام مجفف بالتجميد ssHDX-MS وSSPL-MS (الشكل 2)، وذلك باستخدام ميجا بايت كمابروتين نموذج. نقدم لك مجموعة من قدرة طريقتين للتمييز الاختلافات في التركيبات مع اثنين من سواغ مختلفة.

figure-introduction-3862
الشكل 1: ssHDX وSSPL بنية البروتين الإجراء في المواد الصلبة مجفف بالتجميد من خلال آليات وضع العلامات المختلفة (A) في HDX، وأميد العمود الفقري الهيدروجين التبادل مع الديوتيريوم بوصفها وظيفة من بنية البروتين وD 2 O للمعاقين. في الحالة الصلبة، ومعدل ومدى التبادل الديوتيريوم تعتمد على مستوى D 2 O الامتصاص، والتنقل من البروتين (تتكشف وrefolding الأحداث) وطبيعة سواغ الحالية في المصفوفة الصلبة. (ب) في PL، الأشعة فوق البنفسجية في 365 نانومتر يبدأ تشكيل carbene رد الفعل وسيطة من مجموعة وظيفية diazirine من pLeu ويتم إدراجها غير تحديدا في أي السندات XH (X = أي ذرة)، أو إعلاندائرة التنمية الاقتصادية عبر = C السندات C في جوارها المباشر. في الحالة الصلبة، ومعدل ومدى وضع العلامات تعتمد على التركيز المحلي من وكيل وضع العلامات، والوقت التشعيع، بنية البروتينات وطبيعة سواغ الحالية في المصفوفة الصلبة. وحات A و B تظهر أقصى وضع العلامات النظرية التي يمكن أن تحدث في العمود الفقري وجنبا إلى سلاسل على التوالي في البروتين.

figure-introduction-5009
الشكل 2: عرض تخطيطي الحالة الصلبة HDX-MS (A) وPL-MS (B) للبروتين في صياغة مجفف بالتجميد.

Protocol

التحضير 1. عينة وتجفيد

  1. Dialyze حجم المطلوب من ميغابايت حل الأوراق المالية ضد عازلة مناسبة وفلتر من خلال 0.22 ميكرون تصفية العقيمة.
  2. إعداد حجم المطلوب من سواغ والصور يسين (حمض L-2-الأمينية-4،4-عزي-pentanoic، pLeu) حلول الأسهم في عازلة مناسبة. تصفية حلول الأوراق المالية من خلال تصفية العقيمة 0.22 ميكرون.
  3. إعداد الصياغات كما هو مبين في الجدول 1 باستخدام حلول المخزون من البروتين، سواغ، pLeu، والعازلة.
  4. مرشح عينات من خلال تصفية العقيمة 0.22 ميكرون لإزالة أي جزيئات تشكلت في خطوة 1.3. ملء العينات بشكل منفصل 0.2 مل في قوارير الزجاج 2 مل. استخدام قوارير الزجاج التي تتسم بالشفافية للأشعة فوق البنفسجية (365 نانومتر) الضوء من أجل تفعيل pLeu في الدراسات SSPL-MS.
  5. قارورة الحمل في مجفاد والشروع تجفيد من خلال تصميم دورة تجفيد المناسبة.
    1. هنا، وتجميد العينات عند -40 درجة مئوية، تليهاقبل التجفيف الأولي بموجب فراغ (70 mTorr) في -35 درجة مئوية لمدة 12 ساعة وتجفيف الثانوي عند 25 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. البعض دورات تجفيد وطرق التجفيف (على سبيل المثال، التجفيف بالرش) يمكن أن تستخدم أيضا.
  6. الردم قارورة تحتوي على عينات مجفف بالتجميد مع النيتروجين قبل السد.
تركيبات تكوين (ملغ / مل) قبل تجفيد
ميغابايت طرهالوز السوربيتول pLeu ج البوتاسيوم والفوسفات، ودرجة الحموضة 7.4
MBT ل 1.7 3.4 - - 0.4
MBS ل 1.7 - 3.4 - 0.4
MBT + pLeu ب 1.7 3.4 - 14.3 × 10 -3 إلى 1.43 0.4
MBS + pLeu ب 1.7 - 3.4 14.3 × 10 -3 إلى 1.43 0.4

الجدول 1:... تكوين تركيبات ميغابايت مجفف بالتجميد من الصيغ المستخدمة لدراسة ssHDX-MS صياغات بالأبيض المستخدمة في الدراسة SSPL-MS ج L-2-الأمينية-4،4-azipentanoic حامض أو الصور يسين (pLeu). pLeu في خمسة تركيزات مختلفة (14.3 × 10 -3 إلى 1.43 ملغ / مل) الموافق 1x أخرى، 10X، 20X، 50X 100X وقريب الزائدة المولي لميغابايت تم مجفف بالتجميد التعاون مع الدبابة وMBS الصيغ.

2. ssHDX-MS للبروتين سليمة

  1. إضافة كمية تشبع (~ 440 ز) من K 2 CO 3-200 مل من D 2 O previouslذ وضعت في حجرة أقل من مجفف. ختم مجفف محكمة الغلق والسماح لها لكي تتوازن في 5 ° C حتى الرطوبة النسبية مستقرة (RH) من ~ يتم التوصل إلى 43٪. ويمكن الحصول على قيم RH الأخرى ذات الاهتمام باختيار مختلفة محاليل ملحية مشبعة 23،24.
  2. الشروع في ردود الفعل ssHDX عن طريق وضع قارورة لم يسبق لهم اللعب التي تحتوي على البروتين مجفف بالتجميد في المقصورة العليا من مجفف. ختم مجفف الهواء ضيق واحتضان عند 5 ° C للسماح HDX أن يحدث (الشكل 2A).
  3. جمع عينات ssHDX في أوقات مختلفة في ثلاث نسخ. لتركيبات ميجا بايت، وجمع العينات عند تسع نقاط الوقت 1، 2، 4، 8، 16، 32، 56، 92 و 144 ساعة.
  4. سقف قارورة مباشرة بعد الانسحاب من مجفف وإخماد التفاعلات التي كتبها flash تجميد قارورة في النيتروجين السائل. متجر قارورة في -80 درجة مئوية حتى التحليل الطيفي الشامل.
  5. تحليل العينات باستخدام عالية الدقة السائل اللوني الشامل spectrom مناسبةetry (LC-MS) الأسلوب. تصميم أو شراء نظام LC المبردة مناسبة للحد من الخلف الصرف خلال تحليل العينة. استخدام الإعداد للوحدة العمود التبريد وطريقة LC-MS ذكرت سابقا 25.
    ملاحظة: بما أن معدل أميد الصرف بروتون يعتمد على درجة الحموضة ودرجة الحرارة، ويمكن deuterons وأدرجت في البروتين تبادل مع الحاضر الهيدروجين في الطور المتحرك ("تبادل الخلفي")، مما تسبب في فقدان المعلومات. على الرغم من أن درجة الحموضة الحمضية (درجة الحموضة 2.5) من العازلة إخماد والمذيبات HPLC يمكن التقليل العودة الصرف إلى حد كبير، مما يقلل من درجة حرارة (≤0 ° C) عن طريق نظام العمود التبريد مناسبة يمكن أن تزيد من حماية البروتين من الخلف الصرف .
  6. ربط حلقة العينة وفخ البروتين لصمام يتحكم في عملية تحلية وشطف تلقائيا. معايرة مطياف الكتلة عن طريق حقن TOF تركيز منخفض ضبط المزيج في مطياف الكتلة في نطاق م / ض من 200-3،200. ويجمدليس مطلوبا من العمود البيبسين والعمود التحليلي لتحليل البروتين سليمة.
  7. ضبط درجة الحرارة في النظام المبردة ل≤0 ° C وانتظر النظام لتصل إلى درجة حرارة التشغيل المستقر لل~ 0 ° C.
  8. نقل بسرعة عينات من -80 ° C إلى النيتروجين السائل للتحليل الطيفي الشامل. باستخدام ملقط، سحب بعناية كل قارورة من النيتروجين السائل وإعادة العينة عن طريق إضافة كمية محددة من الجليد عازلة إخماد الباردة التي تحتوي على حمض الفورميك بنسبة 0.2٪ (FA) (الرقم الهيدروجيني 2.5) و 5٪ الميثانول في الماء لالقارورة.
  9. برمجة HPLC مناسبة وطريقة قياس الطيف الكتلي باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة. لتركيبات ميغابايت، زادت عينة تحلية تحتوي على 20 بمول ميغابايت في فخ بروتين 1.7 دقيقة مع 5٪ الأسيتونتريل، 95٪ ماء وحمض الفورميك بنسبة 0.1٪ (FA)، وأزل باستخدام التدرج إلى 80٪ الأسيتونتريل، 20٪ ماء و 0.1 ٪ FA في 3.3 دقيقة. جمع أطياف الشامل على م / ض نطاق 200-3،200.
  10. لتحديد كتلة سليمةالبروتين، والحصول على البيانات لعينة undeuterated البروتين (أي البروتين لا تخضع لssHDX) في محلول مائي باستخدام أسلوب الخطوة 2.9.
  11. الحصول على الجماهير من عينات undeuterated وبالديوتيريوم بواسطة deconvoluting أطياف الخام باستخدام برمجيات تحليل البيانات. هنا، تعيين نطاق الكتلة إلى 15،000-18،000 دا، وقرار الكتلة إلى 1.0 دا، وارتفاع الذروة إلى 90٪ لحساب كتلة ميجا بايت.
  12. احسب عدد deuterons وأدرجت في حالها البروتين (هنا، ميغابايت) من خلال طرح كتلة البروتين undeuterated من كتلة البروتين بالديوتيريوم في كل نقطة زمنية الصرف.
  13. حساب في المئة الديوتيريوم امتصاص نسبة إلى الحد الأقصى النظري باستخدام المعادلة التالية (المعادلة 1)
    figure-protocol-6996
    حيث إجمالي عدد الأميدات تبديل = إجمالي عدد الأحماض الأمينية - عدد من المخلفات البرولين - 2 ("2" حسابات N-مجموعة محطة الأمينية وأميد الهيدروجين التي تخضع السريع لتبادل الخلفي).
  14. احتواء البيانات الحركية ssHDX باستخدام المعادلة الأسية مناسبة. معادلة biexponential (المعادلة 2) عادة ما يكون أبسط التي توفر تناسب معقول للبيانات ssHDX. في هذه الدراسة، على الدبابة وMBS، احتواء البيانات إلى نموذج biexponential الذي يعين deuterons وإلى "سريع" و "بطيء" تبادل حمامات.
    figure-protocol-7598
    حيث N سريعة وبطيئة N هي عدد من الأميدات تبديل في "سريع" و "بطيء" تبادل حمامات، على التوالي، وك سريعة وبطيئة ك هي الثوابت معدل الدرجة الأولى المرتبطة حمامات اثنين.

3. ssHDX-MS للبروتين الببتيد في مستوى

  1. أداء ssHDX باتباع الخطوات 2،1-2،8، مع إجراء التعديلات التالية في الخطوة 2.6. ربط العقيد البيبسين يجمدUMN والعمود التحليلي للصمام كما ذكرت سابقا 25 واستبدال في فخ البروتين المتصلة صمام مع فخ الببتيد. معايرة مطياف الكتلة من خلال وضع كتلة لتوجيه الاتهام نسبة تتراوح ما بين 100 إلى 1،700.
    ملاحظة: أثناء الخطوة إعادة (الخطوة 2.8)، يمكن إدراج وكيل الحد من وكيل وتغيير طبيعة في المخزن المؤقت إخماد لتسهيل البيبسين هضم البروتينات مع السندات ثاني كبريتيد (على سبيل المثال، والأجسام المضادة وحيدة النسيلة).
  2. برمجة وHPLC المناسب وطريقة قياس الطيف الكتلي باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة. لتركيبات ميغابايت، هضم عينات تحتوي على 20 بمول ميجا بايت على الانترنت مع 0.1٪ FA، فخ وتحلية الببتيدات ل1.7 دقيقة مع 10٪ الأسيتونتريل، 90٪ ماء و 0.1٪ FA في فخ الببتيد. أزل الشظايا على العمود التحليلي مع زيادة التدرج إلى 60٪ الأسيتونتريل، 40٪ ماء و 0.1٪ FA في 4.0 دقيقة. الحصول على أطياف الشامل على م / ض نطاق 100-1،700.
  3. التعرف على أجزاء الجهاز الهضمي عن طريق تحليل MS / MS لعينة بروتين undeuterated. استخدام البرمجيات قياس الطيف الكتلي للمقارنة الجماهير التجريبية من أيونات الببتيد شظية للجماهير توقع من شظايا الببتيد في قاعدة بيانات مخصصة. تعيين كتلة قطع نقطة (على سبيل المثال 10 جزء في المليون) لتحديد الجماهير مع الخطأ منخفضة. لالببتيدات الملائمة، وإعداد قائمة تتألف من (ط) تسلسل الببتيد، (ب) ولاية تهمة، و (iii) الوقت الاحتفاظ.
  4. استخدام قائمة إنشاؤها في الخطوة 3.3 إلى الخريطة وتحديد متوسط ​​عدد deuterons وأدرجت لكل البيبسين هضم جزء. ويمكن تحقيق ذلك من خلال توظيف مناسبة HDX-MS برامج تحليل بيانات 24.
  5. لحساب امتصاص الديوتيريوم في المئة ولاحتواء البيانات الحركية ssHDX لكل من شظايا الهضمية، اتبع الخطوات 2.13 و 2.14. في هذه الدراسة، HDX البيانات الحركية لكل من ستة البيبسين غير زائدة عن الحاجة هضم أجزاء من تم تركيب الدبابة وMBS الصيغ إلى نموذج جمعية biexponential (المعادلة 2).

4. SSPL-MS للبرو سليمةالبروتين

  1. لبدء رد فعل التوسيم الضوئي، والتبديل الأول على crosslinker الأشعة فوق البنفسجية، والسماح للمصابيح في عملية الاحماء لمدة 5 دقائق. تأكد من تجهيز مصدر للأشعة فوق البنفسجية مع مصابيح من الطول الموجي 365 نانومتر لتفعيل مجموعة من diazirine pLeu.
    تنبيه: أبدا فتح باب crosslinker الأشعة فوق البنفسجية عندما المصابيح جرا. حماية العينين والجلد من التعرض لضوء الأشعة فوق البنفسجية إذا لم يتم وضع مصدر من الباب الزجاجي للأشعة فوق البنفسجية واقية.
  2. إيقاف تشغيل crosslinker الأشعة فوق البنفسجية قبل فتح الباب. مرة واحدة يتم تشغيل المصابيح قبالة، إرفع قبعة قارورة تحتوي على صياغة مجفف بالتجميد ووضعها داخل غرفة crosslinker الأشعة فوق البنفسجية كما هو مبين في الشكل 2B. أشرق العينات مع ضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 40 دقيقة.
  3. إجراء تجارب السيطرة باتباع الخطوة 4،1-4،3 ل(ط) عينات مجفف بالتجميد دون pLeu و (ثانيا) عينات مجفف بالتجميد مع pLeu تشكيلها في الماء.
  4. كاب وتخزين قوارير في -20 درجة مئوية حتى التحليل الطيفي الشامل.
  5. Reconstitيوت العينات الصلبة عن طريق إضافة حجم مناسب من الطيف الصف الماء المقطر الشامل لجلب التركيز إلى 2 ميكرومتر.
  6. لبدء تحليل عينة، اتبع الخطوات 2.6 و 2.9.
    ملاحظة: منذ ظهر الصرف ليست قضية مع وضع العلامات التساهمية، SSPL-MS لا يتطلب نظام خاص LC المبردة.
  7. لتحديد الكتلة الأصلية للبروتين، والحصول على بيانات لعينة البروتين الذي لم يتعرض للSSPL باتباع الخطوة 2.9. الحصول على الجماهير من العينات غير المسماة وصفت من قبل deconvoluting أطياف الخام كما هو موضح في الخطوة 2.11.
  8. احسب عدد pLeu أدرجت باستخدام الصيغة التالية:
    figure-protocol-12077
    حيث M L هو كتلة من البروتين المسمى، M N هو كتلة من البروتين الأصلي و 115 هو متوسط ​​كتلة (دا) إضافة إلى البروتين الأصلي بعد واحد pLeu التأسيس. لاحظ أن رد فعل التوسيم يحدث مع الخسارة (ه) من N 2 (28 دا). كتلة monoisotopic من pLeu هي 143.07.
  9. حساب النسب المئوية للسكان البروتين مع أعداد مختلفة من الملصقات باستخدام مرتفعات الذروة من الاستشرابية أيون المستخرج.
    figure-protocol-12610
    حيث "ط" يدل على عدد من التسميات، PH ط يدل على ارتفاع ذروة المسمى بروتين L i و PH ش يدل على ارتفاع الذروة من البروتين الخالي من الملصقات كما لوحظ من قبل مطياف الكتلة.

5. SSPL-MS للبروتين على مستوى الببتيد

  1. أداء SSPL باتباع الخطوات 4،1-4،4.
  2. لتحليل مستوى الببتيد، إعادة تشكيل العينات الصلبة في بيكربونات الأمونيوم عازلة (100 ملي، ودرجة الحموضة 8.0).
  3. بعد إعادة، مزيج الحل البروتين المسمى مع التربسين في 10: 1 نسبة المولي من البروتين لالتربسين واحتضان عند 60 درجة مئوية لمدة 16 ساعة.
  4. إخماد رد فعل بإضافة 0.1٪ FAفي الماء لعينة لانتاج التركيز النهائي إلى 2 ميكرومتر البروتين.
  5. ربط عينة حلقة، فخ الببتيد والعمود التحليلي للصمام مرتبطة بنظام HPLC.
  6. برمجة HPLC مناسبة وطريقة قياس الطيف الكتلي باستخدام برنامج حاسوبي لمراقبة. لتركيبات ميجا بايت، وضخ 20 بمول من البروتين المهضوم في العينة حلقة، وتحلية الببتيدات في فخ الببتيد مقابل 1.5 دقيقة مع 5٪ الأسيتونتريل، 95٪ ماء و 0.1٪ FA، تليها شطف في العمود التحليلي مع التدرج زيادة إلى 55٪ الأسيتونتريل، 45٪ ماء و 0.1٪ FA في 22 دقيقة. جمع أطياف الشامل على م / ض نطاق 100-1،700.
  7. إعداد قائمة الكتلة النظرية لالببتيد pLeu adducts باستخدام أداة على الانترنت مثل إكسباسي 26 مع أعداد pLeu المحسوبة سابقا من تحليل البروتين سليمة. تشمل على الأقل 4 غاب الانشقاقات. لاحظ أن رد فعل التوسيم يحدث مع فقدان N 2. ولذلك، فإن كتلة الببتيد pLeu ناتج إضافة = كتلة محاولة غير المسماةالببتيد ptic + ن (كتلة pLeu) - ن (كتلة N 2)، حيث "n" هو عدد pLeu يدمج.
    ملاحظة: إذا أظهر التحليل كتلة من البروتين سليمة تصل إلى ثلاثة السكان وصفت من البروتين، والنظر في ما يصل الى ثلاث تسميات pLeu الممكنة في الببتيد. لالببتيد مع كتلة من 1،000 دا، فإن كتلة النظرية من الببتيد pLeu ناتج إضافة مع 1 pLeu التأسيس أن يكون 1،000 + 1 (143) - 1 (28) = 1،115 دا. وبالمثل، فإن الجماهير النظرية من الببتيد pLeu adducts مع 2 pLeu، 3 pLeu، وما إلى ذلك سيكون 1،230 دا، دا 1،345، الخ، على التوالي.
  8. استخدام برامج التحليل الشامل لتتناسب مع قائمة الكتلة النظرية إنشاؤها في الخطوة 5.7 مع الجماهير لوحظ تجريبيا. تعيين كتلة قطع نقطة (على سبيل المثال، 50 جزء في المليون) لتحديد الجماهير مع الخطأ منخفضة.
  9. لالببتيدات الملائمة، وتحديد دمج العدد الفعلي للpLeu باستخدام الصيغة ضمن الخطوة 4.8 (المعادلة 3)، حيث M L M N وهي جماهير المسمىوالببتيد الأصلي، على التوالي.

النتائج

هنا، وقد استخدمت ssHDX-MS وSSPL-MS إلى دراسة تأثير سواغ على التشكل والحالة الصلبة تفاعلات تشكيلات ميغابايت مجفف بالتجميد. ونظرا لتركيزات البروتين وسواغ المستخدمة في هذه الدراسة في الجدول 1. ممثل النتائج من ssHDX-MS وSSPL-MS تحليل ميجا بايت مجفف بالتجميد الحصول عليها عن طريق اتباع يتم عرض البروتوكولات المذكورة أعلاه.

امتصاص الديوتيريوم في مستوى البروتين سليمة

ssHDX-MS قادر على التمييز بين التركيبات ميجا بايت على مستوى سليمة. أظهر أطياف الشامل deconvoluted من ميغابايت سليمة التالية 144 ساعة من ssHDX من MBS صياغة زيادة امتصاص الديوتيريوم من صياغة الدبابة (الشكل 3A). في المتوسط، وأظهرت MBS أكبر 46٪ امتصاص الديوتيريوم من الدبابة (الجدول 2).

figure-results-1022
الشكل 3: ssHDX-MS لميغابايت سليمة: (A) Deconvoluted الأطياف كتلة ميغابايت سليمة بالديوتيريوم من الصيغ الدبابة (خط الصلبة) وMBS (خط متقطع) بعد 144 ساعة من ssHDX. يظهر الطيف الشامل deconvoluted من ميغابايت سليمة undeuterated أيضا (الخط المنقط). (B) حركية ssHDX لميغابايت سليمة في تركيبات الدبابة (خط الصلبة) وMBS (خط متقطع). تم تركيبها على مدار الساعة من ssHDX إلى معادلة لمدة المرحلة جمعية الأسي باستخدام الرسم البياني الوسادة بريزم البرمجيات الإصدار 5 (ن = 3، ± SD).

حركية بالديوتريوم لMBS سليمة والدبابة متشابهة في نقاط زمنية مبكرة (1-4 ساعة)، ولكن MBS أظهرت زيادة التبادل الديوتيريوم مع الزيادة في الوقت المناسب (8-144 ساعة) (الشكل 3B). وهذا يشير إلى أهمية اختيار نقطة زمنية أطول لssHDX في انخفاض RH ودرجة الحرارة الظروف. أيضا، والامتصاص والانتشار 2 O عملية D قد تؤثر على معدل ssHDX في بو الوقت مبكر[إينتس]. وقد أظهرت دراساتنا السابقة أن الامتصاص الرطوبة في ssHDX اكتمال في فترة من ساعة، ولها مساهمة الحد الأدنى لتبادل حركية وراء هذا الوقت. وبالتالي فإن معدل وحظ ومدى الصرف ليست مجرد تدابير D 2 O الادمصاص 27،28. وأشرطة الخطأ صغيرة في الشكل 3B، مشيرا إلى الانحرافات المعيارية من ثلاث عينات ssHDX-MS مستقلة، وتبين أن التجربة هي استنساخه للغاية.

الديوتيريوم امتصاص (٪) ب N سريعة ج ك ج سريعة N بطيئة ج ك بطيئة ج
MBT ل 15.9 ± 0.5 13.1 (0.8) 0.43 (0.03) 11.0 (0.9) 0.019 (0.001)
MBS ل 23.2 ± 0.5 15.4 (0.7) 0.49 (0.04) 19.2 (0.6) 0.024 (0.002)
نسبة التغيير د 46٪ 18٪ 14٪ 75٪ 26٪

الجدول 2: تدابير الكمية من امتصاص الديوتيريوم في الدراسات ssHDX من الصيغ ميجا بايت) أ (انظر الجدول رقم 1 لتكوين ب نسبة الديوتيريوم امتصاص نسبة إلى الحد الأقصى النظري من قبل ميغابايت سليمة بعد 144 ساعة من HDX في 5 ° C، 43٪ RH (ن = 3. ، يعني ± SD). ج المعلمات التي تحددها الانحدار غير الخطية من البيانات الحركية ssHDX-MS. تم تركيب دوام الصرف الديوتيريوم لحالها ميجا بايت إلى نموذج جمعية biexponential (ؤ 2). القيم بين قوسين هي الأخطاء المعيارية من المعلمات الانحدار. د وكان التغيير في المئة في القياسات CALCUL كما ated 100 × [(القيمة من MBS - القيمة من MBT) / (قيمة من MBT)].

يتم إعطاء المعلمات الانحدار (سريع N، N بطيئة، ك سريعة وبطيئة ك) لحركية امتصاص الديوتيريوم للMBT وMBS في الجدول 2. على الرغم من أن N القيم سريعة وبطيئة N هي أكبر للMBS من الدبابة، والاختلافات في N بطيئة كانت قيم أكبر من الاختلافات في القيم N سريعة. على وجه التحديد، وقيمة سريعة N هي 18٪ فقط أكبر في MBS من في الدبابة، في حين أن قيمة بطيئة N هي 75٪ أكبر في MBS من في الدبابة. وهذا يوحي بأن N القيم بطيئة أصغر في الدبابة قد يكون راجعا إلى زيادة نسبة الاحتفاظ بنية ميجا بايت أو حماية الفئات أميد التي كتبها سواغ التي تتعرض لD 2 O في MBS. ومع ذلك، لا يفهم بوضوح آليات مفصلة. الثوابت معدل (K سريعة وبطيئة ك) لكل من الصيغ متشابهة جدا.

معشوقة = "jove_content"> امتصاص الديوتيريوم على مستوى الببتيد

وبعد البيبسين الهضم، تم تحديد ما مجموعه 52 الببتيدات. واستخدمت ست شظايا غير زائدة عن الحاجة المقابلة إلى 100٪ من تسلسل ميجا بايت لتحليل ذكرت هنا. يمكن الحصول على معلومات إضافية باستخدام شظايا متداخلة، كما ذكرت من قبل مجموعتنا سابقا 24. تم احتساب امتصاص الديوتيريوم في المئة لكل الببتيد والنتائج من 144 عينات ساعة تآمر (الشكل 4A). وأظهرت حركية HDX لشظايا الهضمية ستة السلوك biexponential (الشكل 4B)، بما يتفق مع مجموعات سكانية فرعية من الهيدروجين الأميد تمر الصرف "سريع" و "بطيء".

figure-results-5654
الشكل 4: ssHDX-MS لميغابايت على مستوى الببتيد: (A) امتصاص نسبة الديوتيريوم لمدة 6 غير redu-شظايا الهضمية ndant من ميغابايت في تركيبات الدبابة (الرمادي) وMBS (أبيض) بعد 144 ساعة من HDX. حركية (B) ssHDX لمدة ستة أجزاء الهضمية غير زائدة من ميغابايت في تركيبات الدبابة (خط الصلبة) وMBS (خط متقطع). تم تركيبها على مدار الساعة من ssHDX إلى معادلة لمدة المرحلة جمعية الأسي باستخدام الرسم البياني الوسادة بريزم البرمجيات الإصدار 5 (ن = 3، ± SD).

وتعرض المعلمات الانحدار لالببتيدات nonredundant في الشكل 5. والثوابت معدل المجهزة لشظايا الببتيد ليست هي متوسط ​​معدل ثابت للالأميدات الفردية، والثوابت معدل احظ لشظايا الهضمية لا يمكن أن تكون ذات صلة خطيا لتلك للبروتين سليمة. وكانت N القيم سريعة لمعظم أجزاء الهضمية (باستثناء جزء 56-69) في تركيبات MBS أكبر قليلا من تلك التي في الدبابة (الشكل 5A). وبالمثل، أظهر قيم k السريعة عموما اختلاف بسيط بين formulatioنانوثانية وفي مناطق مختلفة من جزيء ميجا بايت (الشكل 5B). ومع ذلك، فإن N القيم بطيئة بطيئة وك لMBS هي أكبر بكثير في جميع أجزاء من لMBT (الشكل 5C و5D). قد يعكس الزيادة الكبيرة في N ك بطيئة وبطيئة للMBS المزيد من التنقل من مجموعات أميد في "بطيئة" تبادل حمامات.

figure-results-7153
الشكل 5: معلمات الحركية ssHDX لميغابايت الببتيدات الهضمية: N بسرعة (A)، (ك) سريع (B)، N بطيئة (C) و K بطيئة (D) القيم التي تم الحصول عليها من الانحدار غير الخطية من البيانات الحركية ssHDX-MS لمدة ستة الببتيدات الهضمية غير زائدة من ميغابايت في تركيبات الدبابة (الرمادي) وMBS ( أبيض) (ن = 3، ± SE).

وضع العلامات الضوئي في مستوى البروتين سليمة

ميغابايت المشع في وجود فائض 20x وpLeu شكلت متعددة MB-pLeu adducts، والكشف عنها من قبل LC-MS (الشكل 6A). أطياف deconvoluted لMBT المشع لمدة 40 دقيقة مع 20x وأظهرت pLeu تصل إلى 3 تسميات مع إضافة +115، +230 +345 ودا لكتلة ميجا بايت غير المسماة. MBS المشع بالمثل مع 20x وأظهر pLeu أقل امتصاص pLeu على مستوى سليمة، مع ما يصل الى 2 السكان المسمى الكشف عنها من قبل LC-MS.

figure-results-8359
الشكل 6: SSPL-MS لميغابايت سليمة: (A) Deconvoluted أطياف الكتلة لMBT (خط الصلبة) وMBS (خط متقطع) المسمى مع 20x والفائض (5٪ ث / ث) pLeu. ويظهر Deconvoluted الطيف الشامل للالأصلي ميغابايت (MB مجفف بالتجميد والمشع في غياب pLeu) كما خط منقط. U يدل على السكان من البروتين الذي لا يزال ليس لها علامة بعد التشعيع. ويمثل السكان من البروتين يحمل 1 و 2 و 3 بطاقات pLeu كما 1L، 2L و3L على التوالي. حركية (B) SSPL-MS لميغابايت سليمة في تركيبات الدبابة (الدوائر المغلقة) وMBS (دوائر مفتوحة) كدالة للتركيز pLeu. تم المشع جميع العينات لمدة 40 دقيقة. أشرطة الخطأ تقع ضمن حرف. (C) حركية SSPL-MS لميغابايت سليمة في تركيبات الدبابة (الدوائر المغلقة) وMBS (دوائر مفتوحة) مجفف بالتجميد والمشع في وجود 100X الزائد pLeu (20.7٪ ث / ث) بوصفها وظيفة من الزمن التشعيع. أشرطة الخطأ تقع ضمن حرف.

في الدراسات الحركية، زادت في المئة من البروتين المسمى أضعافا مضاعفة لكل من الدبابة وMBS مع زيادة الوقت التشعيع (الشكل 6B). أظهر MBS أقل امتصاص pLeu من الدبابة في كل مرة التشعيع. وبدا كل من الصيغ للوصول إلى الهضبة في 40 دقيقة. وهكذا، يمكن دراسة الحركية أن يكون لنا eful لتحديد مدة التشعيع اللازمة للحصول على تفعيل pLeu كاملة. وقد درس أيضا حركية وضع العلامات بوصفها وظيفة من تركيز pLeu (الشكل 6C). زادت في المئة من البروتين المسمى مع تركيز pLeu لكل من الدبابة وMBS. ومع ذلك، في 20.7٪ ث / ث pLeu، أظهرت الدبابة انخفاض في pLeu امتصاص. قد يكون هذا بسبب استبعاد pLeu من سطح البروتين في ارتفاع تركيز pLeu. وبالتالي، ينبغي إجراء دراسة مع تركيز pLeu متفاوتة لتحديد تركيز pLeu المناسب الذي يسمح لوضع العلامات كافية عبر سطح البروتين دون إقصاء السطح. في هذه الدراسة، تم اختيار 20x والزائد pLeu لمزيد من الدراسات على مستوى الببتيد.

انخفض عموما وضع العلامات لاحظ لMBS تشير الفقراء جنبا إلى سلسلة الوصول إلى مصفوفة تحتوي على pLeu. وهذا يتفق مع تغيير متعلق بتكوين في وجود السوربيتول الذي يؤدي إلى انخفاض العلامات.

المحتوى "> وضع العلامات التحلل الضوئي على مستوى الببتيد

وبناء على دراسات وضع العلامات البروتين سليمة، وقد تم اختيار 20x والزائد pLeu لمقارنة الدبابة وMBS على مستوى الببتيد. تم هضمها عينات المسمى مع التربسين وتحليلها بواسطة LC-MS. تم الكشف عن ما مجموعه 40 الببتيدات الموافق 100٪ من تسلسل ميجا بايت لMBT وMBS العينات. في بعض الحالات، قد توفر الهضم زيتية تغطية محدودة تسلسل البروتين إذا وصفت اليس و / أو الارجنتين المخلفات بشكل كبير. لتحسين التغطية تسلسل، وهي مزيج من التربسين كيموتربسين ويمكن أن تستخدم لهضم البروتين المسمى.

figure-results-11143
الرقم 7: SSPL-MS لميغابايت على مستوى الببتيد: كارتون تمثيل ميجا بايت المسمى مع 20x والزائد pLeu (5٪ ث / ث) في وجود طرهالوز (A) والسوربيتول (B). تم هضم البروتين المسمى مع trypsiن والببتيدات وصفت تم تعيينها إلى التركيب البلوري للميجا بايت (PDB ID 1WLA). يتم تلوين المناطق وصفت وغير المسماة أرجواني والأخضر، على التوالي.

SSPL-MS مع الهضم التربسين يوفر معلومات نوعية حول الببتيدات وصفها. ونظرا للسكان وصفت مختلف على مستوى سليمة، وآلية منحل من وضع العلامات pLeu والاختلافات في الكفاءة التأين من الببتيدات وصفت وغير المسماة، فإنه من الصعب الحصول على المقاييس الكمية لSSPL-MS بعد الهضم. ومع ذلك، يمكن للمعلومات نوعية لا تزال توفر نظرة ثاقبة البروتين التغييرات متعلق بتكوين على مستوى الببتيد. في هذه الدراسة، وأظهرت كل من الدبابة وMBS تركيبات pLeu امتصاص في معظم أنحاء سطح البروتين. بالمقارنة مع MBS، شظايا الببتيد 32-42، 134-139 و146-153 من الدبابة وأظهرت العلامات pLeu (الشكل 7). وهذا يوحي بأن يتعرض الجانب سلاسل من هذه الأحماض الأمينية لpLeu، حيث أن اللوالب في هذه رجونانوثانية سليمة في المصفوفة الدبابة. في المقابل، والحماية من العلامات pLeu في المصفوفة MBS تتفق مع الاضطرابات الهيكلية في هذه المناطق.

وبشكل عام، تشير النتائج من ssHDX-MS وSSPL-MS أن أساليب يمكن أن توفر معلومات تكميلية عالية الدقة على مستوى الببتيد حول العمود الفقري (ssHDX-MS)، وجنبا إلى سلسلة (SSPL-MS) التعرض وسواغ الآثار في تركيبات البروتين مجفف بالتجميد .

Discussion

وأشارت العديد من الدراسات إلى أن البيئة المحلية في عينات مجفف بالتجميد يؤثر تدهور البروتين 5،29،30. ومع ذلك، إقامة علاقة مباشرة بين بنية البروتين والاستقرار في الحالة الصلبة لم يكن ممكنا بسبب عدم وجود طرق تحليلية عالية الدقة. تطبيق أساليب عالية الدقة القائمة مثل HDX وPL لمساحيق مجفف بالتجميد يتطلب تعديل بروتوكولات حل وتفسير البيانات دقيق. وقد تم اعتماد HDX-MS وPL-MS تباعا لمراقبة التشكل البروتين في الحالة الصلبة. النتائج قدمت هنا وفي أماكن أخرى 27،28،31-33 أثبتت قدرة هذه الأساليب لمراقبة البروتين التشكل مع ارتفاع القرار في البيئة الصلبة. على الرغم من الخطوات الحاسمة في تحليل البيانات لا تختلف من وضع العلامات في حل 34-36، يطلب من الاعتبارات الهامة أثناء الإعداد التجريبية وتفسير البيانات عن كيماوية الحالة الصلبةوضع العلامات كال.

يجب أن يستند اختيار كاشف وضع العلامات على حجم وآلية وضع العلامات. صغر حجم الديوتيريوم يسمح العمود الفقري الببتيد التي تبحث بسهولة، في حين أن حجم أكبر نسبيا من pLeu يحد وضع العلامات للجانب سلاسل. كلا ssHDX وSSPL لا تظهر أي تفضيل لأي من الأحماض الأمينية، بحيث وضع العلامات يعتمد فقط على العمود الفقري وجنبا إلى سلسلة التعرض لالمصفوفة. للتحقيق بشكل فعال التشكل البروتين في الحالة الصلبة، والعوامل الخارجية التي تؤثر على عملية وضع العلامات يجب أن تسيطر عليها بعناية. المبلغ الإجمالي والتوزيع المكاني للوكيل وضع العلامات في المواد الصلبة مجفف بالتجميد يختلف عن المحاليل المائية.

في ssHDX، ومقدار D 2 O في المصفوفة الصلبة قد تؤثر على معدل البروتين تتكشف (أو الجزئي تتكشف)، refolding، وتبادل الديوتيريوم. ليست هذه هي الحال مع حل HDX، والتي يتم تخفيف العينة البروتين عادة مع حجم وافرة من D 2 O.فحص دقيق للآثار الماء على معدل ssHDX يمكن أن تبلغ اختيار الظروف RH مثالية. للسيطرة على معدل الامتصاص الرطوبة وتجنب انهيار المسحوق في التركيبات التي تحتوي على سواغ استرطابي (مثل السكروز وطرهالوز)، ssHDX يمكن القيام بها في ظل ظروف المبردة (2-8 درجة مئوية). دراستنا السابقة بشأن آثار الماء أظهرت معدل ومدى التبادل زادت مع زيادة في نسبة الرطوبة، كما هو متوقع. في الكثير من عملنا، وهي RH المتوسط ​​من 43٪ في 5 ° C وقد ثبت أن تكون مثالية للتمييز الصيغ في فترة زمنية معقولة 24. وعادة ما يتم اجراء التفاعل حتى يتم التوصل إلى الهضبة. وهذا يضمن أن الامتصاص الرطوبة ونشرها في صلب لا تسيطر على معدل HDX. استخدام أحجام العينات الصلبة صغيرة مع حجم ما قبل تجفيد من ≤2 مل يساعد أيضا على ضمان الامتصاص بخار D 2 O اكتمال أساسا في الفترة الصرف في وقت مبكر. يوفر الرغم ssHDX-MSمعلومات كمية عن التشكل من البروتين في الحالة الصلبة، وهناك شروط معينة، حيث تفسير البيانات لا يمكن أن يستند كليا على دراسة ssHDX وحدها. ومن الممكن أن امتصاص الديوتيريوم انخفضت لوحظ في عينة (بالمقارنة مع السيطرة) قد يكون راجعا إلى زيادة نسبة الاحتفاظ بنية البروتين أو كمية كبيرة من المجاميع البروتين الموجودة في العينة. في مثل هذه الحالة، وتفسير البيانات ssHDX يتطلب النتائج من وسائل تكميلية أخرى. وقد لوحظ توسيع الذروة في أطياف الشامل بالديوتيريوم لعدة تركيبات ميغابايت 27،28. وهذا يمكن أن يكون راجعا إلى عوامل مختلفة مثل وجود السكان البروتين تكشفت جزئيا، والتباين المكاني في العينة، أو التدرجات المكانية في تركيز D 2 O. ومع ذلك، لم تتميز هذه العوامل في ssHDX-MS وتحتاج إلى مزيد من التحقيق.

كما SSPL-MS هو جديد نسبيا بالمقارنة مع الطرق الأخرى، والتعلم المستمر من أساسهامن تطبيقاتها والقيود هو مطلوب. في SSPL، ومجفف بالتجميد للصورة عبر رابط مع البروتين. عدم وجود رطوبة يحد من تنقل عناصر داخل المصفوفة الصلبة، والاسترخاء الهيكلي الجزئي التي قد تحدث مع الامتصاص الرطوبة في ssHDX ليس ظاهرة في SSPL. وهذا يحد وضع العلامات في SSPL إلى المنطقة المجاورة مباشرة للالصورة عبر رابط. ولكن، خلافا HDX-MS، MS تحليل / MS من البروتين المسمى تساهميا يمكن أن توفر معلومات هيكلية على مستوى بقايا. منذ وضع العلامات SSPL هو التساهمية ولا رجعة فيه، والعودة لا يحدث التبادل وعينات يمكن إعداد وتحليلها دون القلق من فقدان التسمية. لتسهيل نشر وكيل وضع العلامات وتحسين الكفاءة في وضع العلامات الصلبة المصفوفة، SSPL يمكن أداؤها مع زيادة٪ RH. يمكن أيضا تحسين pLeu امتصاص عن طريق زيادة تركيز وكيل photoreactive. نسبة المولي من البروتين لpLeu يمكن أن تختلف كما تريد. بشكل عام، فائض 100X ضرس pLeu إلى proسوف البروتين ضمان وضع العلامات كاف. ومع ذلك، قد يؤدي ارتفاع تركيز pLeu في فقدان البروتين هيكل العالي في المصفوفة الصلبة. ومن هنا، بالإضافة إلى حركية وضع العلامات وتكوين صياغة ويجب أيضا أن تستند اختيار تركيز pLeu على الحفاظ على السلامة الهيكلية البروتين. كما pLeu تسميات nonselectively XH (حيث X = C، N، O) مجموعة، فمن الممكن أن سواغ مع مواقع العلامات مماثلة يمكن أن تؤثر بشكل كبير على مستوى وضع العلامات البروتين. وبعد أن تتسم تدخل سواغ في توافر pLeu لوضع العلامات البروتين. ومن المعروف أن carbene المتولدة من تفعيل diazirine لا بقايا محددة، لكن تقارير دراسة واحدة التحيز نحو آسيا والمحيط الهادئ وحمض الغلوتاميك 36. في حين انه لامر جيد لمعرفة المزيد عن التفاعلات بقايا محددة، المعلومات الببتيد المستوى هو أيضا مفيدة، ويمكن استخدامها لتصميم سواغ لمنع التعرض المناطق مع ارتفاع مصفوفة في الحالة الصلبة. يوفر SSPL-MS معلومات نوعية مفصلة، ​​ولكنيحتاج البيانات الكمية التي يمكن الحصول عليها وتحتاج إلى مقاييس قوية لتطوير لتحليل الاختلافات صياغة عبر مجموعة متنوعة من أنظمة مجفف بالتجميد.

يمكن استخدام تسمية بقايا محددة جنبا إلى جنب مع تحليل MS / MS مواصلة تعزيز قرار إلى مستوى الأحماض الأمينية. الكواشف وضع العلامات مثل 2،3-butanedione لتسمية الارجنتين، N المشتقات -hydroxysuccinimide لليز وN المشتقات -alkylmaleimide لالسيستئين يمكن استخدامها لرسم خريطة بدقة التفاعلات الجزيئية في مسحوق مجفف بالتجميد. ولكن هذه الكواشف هي التي تعتمد على درجة الحموضة وربما لا تكون ردود الفعل كما تسيطر عليها بشكل جيد كما وصفها الضوئي في الحالة الصلبة. نهج بديل هو دمج للصورة عبر رابط في تسلسل البروتين مع استخدام خطوط الخلايا بعامل نمائي، الطفرات موقع الموجه أو سلسلة جانبية الاشتقاق.

وقد أظهرت لنا ssHDX-MS وSSPL-MS الدراسات السابقة أن وضع العلامات من البروتين يعتمد على طبيعة ومقدار سواغتستخدم 24،27،28،31-33،37،38. ssHDX-MS من ميغابايت شارك مجفف بالتجميد مع غوانيدين هيدروكلوريد (Gdn.HCl) أظهرت زيادة امتصاص الديوتيريوم من ميغابايت شارك مجفف بالتجميد مع المنخفضة الوزن الجزيئي السكريات 32. في دراسة SSPL-MS منفصلة، ​​ميغابايت شارك مجفف بالتجميد مع Gdn.HCl أظهرت قدرا أكبر من الحماية من وضع العلامات الضوئي من ميغابايت مع السكروز 33. وعلاوة على ذلك، والقياسات الكمية من ssHDX-MS قد ترتبط إلى حد كبير مع استقرار البروتين أثناء التخزين على المدى الطويل 28. وتشير هذه الدراسات إلى أن ssHDX أو SSPL من البروتين يعكس مدى الاحتفاظ الهيكلي من البروتين في مسحوق مجفف بالتجميد. ونحن نعتقد أن الإبقاء على هيكل الثانوي في مساحيق مجفف بالتجميد يوفر بيئة مواتية لوضع العلامات سلسلة جنب مع pLeu وحماية أميد الهيدروجين من الصرف الديوتيريوم. ومع ذلك، مقارنة تفصيلية للمحتوى إعلامي من هذه الطرق تحتاج إلى القيام بها في المستقبل. على الرغم من إنشاء فائدة ssHDX-MS وSSPL-MSكأداة فحص صياغة سيتطلب في نهاية المطاف أن يتم تطبيقها على العديد من البروتينات، والنتائج من دراستنا الأخيرة تدعم اعتماد نطاق واسع. مع مزيد من التطوير، ومن المتوقع أن تكون مفيدة على نطاق واسع لوصف تركيبات البروتين الحالة الصلبة في الصناعة الصيدلانية البيولوجية هذه الأساليب.

Disclosures

The authors declare that they have no competing financial interests.

Acknowledgements

The authors gratefully acknowledge financial support from NIH R01 GM085293 (PI: E. M. Topp) and from the College of Pharmacy at Purdue University.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Equine myoglobinSigma-AldrichM0630-5G
D-(+)-Trehalose dihydrateSigma Aldrich#T9531
D-SorbitolSigma Aldrich#240850
L-Photo-leucineThermo Scientific#22610
Potassium phosphate monobasicSigma-Aldrich#P0662
Potassium phosphate dibasicSigma-Aldrich#P3786
Deuterium OxideCambridge Isotope Laboratories#DLM-4-PKAlternate (Cat. No.: 151882, Sigma-Aldrich)
Immobilized pepsinApplied Biosystems#2-3132-00
TrypsinPromega#V511AChymotrypsin (Cat. No.: #V1062, Promega) can be additionally used
Water, Optima LC/MS gradeFisher Chemical#7732-18-5
AcetonitrileSigma-Aldrich#34998
Formic acidThermo Scientific#28905
ESI-TOF CalibrantAgilent Technologies#G1969-85000Highly flammable liquid
Protein microtrapMichrom BioresourcesTR1/25108/03
Peptide microtrapMichrom BioresourcesTR1/25109/02
Analytical columnAgilent TechnologiesZorbax 300SB-C18
Freeze dryerVirTis AdVantage Plus
Stratalinker equipped with five 365 nm lampsStratagene Corp.Stratalinker 2400
HPLCAgilent Technologies1200 series LCRefrigerated LC system for HDX-MS
ESI-qTOF MSAgilent Technologies6520 qTOF
HDExaminer (HDX-MS data analysis software)Sierra Analyticshttp://www.massspec.com/HDExaminer.html

References

  1. Lawrence, S. Billion dollar babies--biotech drugs as blockbusters. Nat. Biotechnol. 25 (4), 380-382 (2007).
  2. . . Global Markets and Manufacturing Technologies for Protein Drugs. , BIO021D (2013).
  3. Lai, M. C., Topp, E. M. Solid-state chemical stability of proteins and peptides. J. Pharm. Sci. 88 (5), 489-500 (1999).
  4. Carpenter, J. F., Pikal, M. J., Chang, B. S., Randolph, T. W. Rational design of stable lyophilized protein formulations: some practical advice. Pharm. Res. 14 (8), 969-975 (1997).
  5. Carpenter, J. F., Chang, B. S., Garzon-Rodriguez, W., Randolph, T. W. Rational design of stable lyophilized protein formulations: theory and practice. Pharm. Biotechnol. 13, 109-133 (2002).
  6. Wüthrich, K. Protein structure determination in solution by NMR spectroscopy. J. Biol. Chem. 265 (36), 22059-22062 (1990).
  7. Ilari, A., Savino, C. Protein structure determination by x-ray crystallography. Methods. Mol. Biol. 452, 63-87 (2008).
  8. Brunger, A. T. X-ray crystallography and NMR reveal complementary views of structure and dynamics. Nat. Struct. Biol. 4, 862-865 (1997).
  9. Yu, L. Amorphous pharmaceutical solids: preparation, characterization and stabilization. Adv Drug. Deliv. Rev. 48 (1), 27-42 (2001).
  10. Manning, M. C. Use of infrared spectroscopy to monitor protein structure and stability. Expert. Rev. Proteomics. 2 (5), 731-743 (2005).
  11. Grohganz, H., Gildemyn, D., Skibsted, E., Flink, J. M., Rantanen, J. Rapid solid-state analysis of freeze-dried protein formulations using NIR and Raman spectroscopies. J. Pharm. Sci. 100 (7), 2871-2875 (2011).
  12. Bai, S., Nayar, R., Carpenter, J. F., Manning, M. C. Noninvasive determination of protein conformation in the solid state using near infrared (NIR) spectroscopy. J. Pharm. Sci. 94 (9), 2030-2038 (2005).
  13. Pikal, M. J., et al. Solid state chemistry of proteins: II. The correlation of storage stability of freeze-dried human growth hormone (hGH) with structure and dynamics in the glassy solid. J. Pharm. Sci. 97 (12), 5106-5121 (2008).
  14. Wang, B., Tchessalov, S., Cicerone, M. T., Warne, N. W., Pikal, M. J. Impact of sucrose level on storage stability of proteins in freeze-dried solids: II. Correlation of aggregation rate with protein structure and molecular mobility. J. Pharm. Sci. 98 (9), 3145-3166 (2009).
  15. Schule, S., Friess, W., Bechtold-Peters, K., Garidel, P. Conformational analysis of protein secondary structure during spray-drying of antibody/mannitol formulations. Eur. J. Pharm. Biopharm. 65 (1), 1-9 (2007).
  16. Baerga-Ortiz, A., Hughes, C. A., Mandell, J. G., Komives, E. A. Epitope mapping of a monoclonal antibody against human thrombin by H/D-exchange mass spectrometry reveals selection of a diverse sequence in a highly conserved protein. Protein. Sci. 11 (6), 1300-1308 (2002).
  17. Coales, S. J., Tuske, S. J., Tomasso, J. C., Hamuro, Y. Epitope mapping by amide hydrogen/deuterium exchange coupled with immobilization of antibody, on-line proteolysis, liquid chromatography and mass spectrometry. Rapid. Commun. Mass. Spectrom. 23 (5), 639-647 (2009).
  18. Pacholarz, K. J., Garlish, R. A., Taylor, R. J., Barran, P. E. Mass spectrometry based tools to investigate protein-ligand interactions for drug discovery. Chem. Soc. Rev. 41 (11), 4335-4355 (2012).
  19. Houde, D., Peng, Y., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. Post-translational modifications differentially affect IgG1 conformation and receptor binding. Mol. Cell. Proteomics. 9 (8), 1716-1728 (2010).
  20. Houde, D., Berkowitz, S. A., Engen, J. R. The utility of hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry in biopharmaceutical comparability studies. J. Pharm. Sci. 100 (6), 2071-2086 (2011).
  21. Dorman, G., Prestwich, G. D. Using photolabile ligands in drug discovery and development. Trends. Biotechnol. 18 (2), 64-77 (2000).
  22. Robinette, D., Neamati, N., Tomer, K. B., Borchers, C. H. Photoaffinity labeling combined with mass spectrometric approaches as a tool for structural proteomics. Expert. Rev. Proteomics. 3 (4), 399-408 (2006).
  23. Greenspan, L. Humidity fixed points of binary saturated aqueous solutions. Journal of Research of the National Bureau of Standards. 81A (1), 8 (1977).
  24. Sophocleous, A. M., Zhang, J., Topp, E. M. Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 1. Exchange mapping. Mol. Pharm. 9 (4), 718-726 (2012).
  25. Keppel, T. R., Jacques, M. E., Young, R. W., Ratzlaff, K. L., Weis, D. D. An efficient and inexpensive refrigerated LC system for H/D exchange mass spectrometry. J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 22 (8), 1472-1476 (2011).
  26. Gasteiger, E., et al. ExPASy: The proteomics server for in-depth protein knowledge and analysis. Nucleic. Acids. Res. 31 (13), 3784-3788 (2003).
  27. Sophocleous, A. M., Topp, E. M. Localized hydration in lyophilized myoglobin by hydrogen-deuterium exchange mass spectrometry. 2. Exchange kinetics. Mol. Pharm. 9 (4), 727-733 (2012).
  28. Moorthy, B. S., Schultz, S. G., Kim, S. G., Topp, E. M. Predicting Protein Aggregation during Storage in Lyophilized Solids Using Solid State Amide Hydrogen/Deuterium Exchange with Mass Spectrometric Analysis (ssHDX-MS). Mol. Pharm. 11 (6), 1869-1879 (2014).
  29. Wang, W. Lyophilization and development of solid protein pharmaceuticals. Int. J. Pharm. 203 (1-2), 1-60 (2000).
  30. Sarciaux, J. M., Mansour, S., Hageman, M. J., Nail, S. L. Effects of buffer composition and processing conditions on aggregation of bovine IgG during freeze-drying. J. Pharm. Sci. 88 (12), 1354-1361 (1999).
  31. Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. Characterizing protein structure in amorphous solids using hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry. Anal. Biochem. 366 (1), 18-28 (2007).
  32. Sinha, S., Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. Protein conformation in amorphous solids by FTIR and by hydrogen/deuterium exchange with mass spectrometry. Biophys. J. 95 (12), 5951-5961 (2008).
  33. Iyer, L. K., Moorthy, B. S., Topp, E. M. Photolytic labeling to probe molecular interactions in lyophilized powders. Mol. Pharm. 10 (12), 4629-4639 (2013).
  34. Hentze, N., Mayer, M. P. Analyzing protein dynamics using hydrogen exchange mass spectrometry. J. Vis. Exp. (81), e50839 (2013).
  35. Kaltashov, I. A., Bobst, C. E., Abzalimov, R. R. H/D exchange and mass spectrometry in the studies of protein conformation and dynamics: is there a need for a top-down approach. Anal. Chem. 81 (19), 7892-7899 (2009).
  36. Jumper, C. C., Schriemer, D. C. Mass spectrometry of laser-initiated carbene reactions for protein topographic analysis. Anal. Chem. 83 (8), 2913-2920 (2011).
  37. Li, Y., Williams, T. D., Topp, E. M. Effects of excipients on protein conformation in lyophilized solids by hydrogen/deuterium exchange mass spectrometry. Pharm. Res. 25 (2), 259-267 (2008).
  38. Li, Y., Williams, T. D., Schowen, R. L., Topp, E. M. Trehalose and calcium exert site-specific effects on calmodulin conformation in amorphous solids. Biotechnol. Bioeng. 97 (6), 1650-1653 (2007).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

98

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved