اختبار لرائحة التمييز والتعويد في الفئران

Summary

This manuscript describes a protocol to examine the olfactory system of rodents. The olfactory habituation/dishabituation test will allow investigators to determine whether a mouse habituates to a repeatedly presented odor and whether the mouse demonstrates dishabituation when presented a novel odor.

Abstract

This video demonstrates a technique to establish the presence of a normally functioning olfactory system in a mouse. The test helps determine whether the mouse can discriminate between non-social odors and social odors, whether the mouse habituates to a repeatedly presented odor, and whether the mouse demonstrates dishabituation when presented with a novel odor. Since many social behavior tests measure the experimental animal’s response to a familiar or novel mouse, false positives can be avoided by establishing that the animals can detect and discriminate between social odors. There are similar considerations in learning tests such as fear conditioning that use odor to create a novel environment or olfactory cues as an associative stimulus. Deficits in the olfactory system would impair the ability to distinguish between contexts and to form an association with an olfactory cue during fear conditioning.

In the odor habitation/dishabituation test, the mouse is repeatedly presented with several odors. Each odor is presented three times for two minutes. The investigator records the sniffing time directed towards the odor as the measurement of olfactory responsiveness. A typical mouse shows a decrease in response to the odor over repeated presentations (habituation). The experimenter then presents a novel odor that elicits increased sniffing towards the new odor (dishabituation). After repeated presentation of the novel odor the animal again shows habituation. This protocol involves the presentation of water, two or more non-social odors, and two social odors. In addition to reducing experimental confounds, this test can provide information on the function of the olfactory systems of new knockout, knock-in, and conditional knockout mouse lines.

Introduction

الفئران هي التي تعتمد على حاسة الشم لتبحر بيئات جديدة، وإيجاد الطعام، للاعتراف أفراد آخرين، والسلوك الجنسي ^1-3. فمن الضروري أن المحققين تحديد ما إذا أم لا حيوانات التجارب لديهم شعور سير رائحة قبل إدارة الاختبارات السلوكية التي تشمل المواد الغذائية والتفاعل الاجتماعي، أو أي الروائح تهدف للحصول على رد من الماوس. الشم أو عدم القدرة على التمييز بين الروائح المختلفة، يمكن أن يؤدي إلى ايجابيات كاذبة أو السلبيات في طائفة واسعة من النماذج السلوكية، لذلك ينبغي إنشاء قدرة الماوس على اكتشاف وتمييز الروائح قبل أن يتم إجراء أنواع أخرى من الاختبارات السلوكية.

وكان أول وصف حاسة الشم اختبار التعود / إزالة التعود في 1980s ^4. وقد تم تكييف الاختبار لاستخدامها في الفئران عن طريق الدكاترة. مو يانغ وجاكلين كراولي ^5. هذا اختبار بسيط وغير مكلف الذي يسمح للمحقق تهتblish أن الفأر يمكن الكشف عن والتفريق بين الروائح. بالإضافة إلى اختبار الشم، وهذا الاختبار يسمح للمحقق لمراقبة السلوك العام للفأرة وينبغي أن يتم في نظام الاختبار في وقت مبكر. ملاحظات نوعية على صعيد الحركة الماوس، وعلامات القلق، ومستوى النشاط، وردا على الروائح الاجتماعية مقابل الروائح الغذائية قد يشير المجالات الجديدة التي يمكن إجراء الاختبار تنفيذها.

في هذا الاختبار، يتم تقديم قطعة قطن مغموسة في مختلف الروائح لماوس ثلاث مرات على التوالي. مع كل عرض المتكرر للرائحة، والماوس روض إلى قطعة من القطن، وإنفاق وقت أقل التحقيق مع كل عرض لاحق. عند عرض رائحة جديدة، يحدث إزالة التعود، وسوف ماوس نموذجي قضاء المزيد من الوقت في التحقيق المسحة، مشيرا إلى أنه يمكن التمييز بين الروائح الحالية والسابقة ^5. ويدير هذا الاختبار لفأر واحد في وقت واحد، وتشمل لجنة التنسيق الإدارية 45 دقيقةفترة معدن limation تليها 45 دقيقة من التجارب.

على الرغم من أن هذا الاختبار هو من السهل القيام بها يمكن استخدامها لتحقيق الأسئلة متطورة حول نظام الماوس حاسة الشم. اختبارات شعبية أخرى من الشم، مثل اختبار المواد الغذائية دفن، ببساطة تحديد وجود أو عدم وجود الشم. ومع ذلك، فإن التمييز والتعود حاسة الشم الاختبار يسمح للمحقق لتحديد أن الفأر ليس فقط لديه القدرة على اكتشاف الروائح ولكن يمكن التمييز بين الروائح المختلفة. وقد استخدم هذا النمط من التعود وإزالة التعود لإثبات أن طفرات جديدة يمكن التمييز بين الروائح ^6،7. في دراسة مثيرة للدهشة، وتستخدم Fadool وزملاؤه مخاليط معقدة من الروائح تبين أن الفئران مع حذف استهداف الجين من قناة Kv1.3 هي "smellers السوبر" التي يمكن أن تميز الروائح مشابهة جدا أفضل من الفئران العادية ^8.

عند النظر في نموذج الماوس خروج المغلوب جديد من المفيد أن تأسيس العهدح وجود السلوك العادي للمهام الحسية الأساسية. عند الانتهاء في وقت مبكر في نظام الاختبار، وتمييز رائحة واختبار التعود يعطي محقق الفرصة لمراقبة أي سلوكيات غريبة. يمكن لهذه الملاحظات يمنع نتائج إيجابية أو سلبية كاذبة في التجارب اللاحقة التي يمكن أن تنسب إلى التباس خصائص متحولة. وبينما يستمر الباحثون إلى السلوك الاجتماعي الحاجة للتحقق من وظيفة حاسة الشم الأساسية يصبح ذات أهمية متزايدة. بالإضافة إلى دراسة الشم في خطوط متحولة، وهذا الاختبار يمكن أن تستخدم لمعالجة مسائل محددة مثل ما إذا كان العلاج الدوائي يزيد خصيصا استجابة الحيوان للمؤثرات رائحة الاجتماعية أو في حالة زيادة استجابتها لجميع المحفزات رائحة.

Protocol

وقد ولدت الفئران الذكور البالغين المستخدمة في التجربة التالية ويضم في جامعة بايلور في درجة الحرارة المحيطة 22 ° C، مع ضوء 14 ساعة و 10 ساعة الظلام (20:00 حتي 06:00 ساعة) دورة نهاري. أعطيت الفئران الإعلان بالمال وبالشهرة أيضا الحصول على الغذاء والماء. وكانت جميع الإجراءات للفئران في الامتثال مع المعاهد الوطنية للصحة المبادئ التوجيهية لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية وبروتوكول الحيوان وافقت عليه جامعة بايلور رعاية الحيوان واللجنة الاستخدام. تم اختبار الفئران في وقت متأخر من صباح / بعد الظهر. لجميع الإجراءات أدناه المحقق يجب ارتداء قفازات للقضاء على الروائح ومنع التلوث.

1. إعداد الروائح غير الاجتماعية

1. إعداد الروائح غير الاجتماعية الطازجة كل يوم من الاختبار.
   ملاحظة: المحقق يجب استخدام قفازات لإعداد الروائح.
   1. ملء 3 أنابيب الطرد المركزي مع 10 مل من الماء لكل منهما.
   2. ماصة 100 ميكرولتر من استخراج الموز إلى 15 مل & #160؛ أنبوب مخروطي و 100 ميكرولتر من استخراج اللوز في الثانية 15 مل أنبوب مخروطي ل1: 100 التخفيف.
      ملاحظة: سوف الثالث أنبوب 15 مل تحتوي على الماء فقط.

2. إعداد الروائح الاجتماعية

1. إعداد الروائح الاجتماعية الطازجة على اختبار الصباح سوف تحدث. الحصول على الروائح الاجتماعية من اثنين من الأقفاص التي لم يتم تنظيفها لمدة ثلاثة أيام على الأقل ويحتوي على عدد متساو من الفئران. الحصول على الروائح الاجتماعية من الفئران من نفس الجنس كاختبار الموضوع.
   ملاحظة: هذه هي ليتم تخزينها في RT وينبغي أن تستخدم في غضون 4-6 ساعة للحفاظ على رائحة قوية وثابتة.
   1. تحديد عدد رائحة الاجتماعية مسحات القطن تحتاج إلى إنشاء: سيتم تقديم كل فأر يجري اختبارها مع ثلاث مسحات من رائحة الاجتماعية 1، وثلاثة من رائحة الاجتماعية 2.
   2. إعداد الروائح الاجتماعية من خلال مسح مسحة القطن بطريقة متعرج عبر الجزء السفلي من القفص القذرة. تخلص من أي فراش الزائد التشبث الحافة.
   3. متجر مسحات في عبوات زجاجية كبيرة مع أغطية الأكواب أو في تغطيتها مع parafilm. تعيين حاوية واحدة لرائحة الاجتماعية (1) والثانية لرائحة الاجتماعية 2.
2. الحفاظ على أقفاص مصدر الرائحة خارج قاعة الاختبار التجريبية.

3. التأقلم للماوس اختبار

1. وضعت على قفازات وتزن الماوس لفحصها ووضع على حدة في قفص نظيفة مع غطاء الأسلاك على رأس وزجاجة مياه إزالتها.
2. السماح الماوس ليتأقلم إلى قفص جديد لمدة 45 دقيقة في غرفة أخرى غير غرفة الاختبار. ضمان عدم وجود أي روائح غير عادية أو ضوضاء في الغرفة.
3. كما الاختبار يستغرق حوالي 45 دقيقة، وارباك مرات التأقلم عن طريق وضع الماوس المقبل لفحصها في قفص نظيفة للتأقلم الحق قبل اختبار الماوس الحالي.

4. إعداد غرفة الاختبار

1. وضع مسحة جديدة من القطن، الشريط المختبر، والزجاجات التي تحتوي على مسحات رائحة الاجتماعية، وأنابيب نعلى اساس الاجتماعية الروائح، وmicropipette، واثنين من أجهزة ضبط الوقت، وزجاجة النفايات مع غطاء في قاعة الاختبار.
2. تأكد من أن غرفة الاختبار مجانية معقول من الروائح، والضوضاء الصاخبة، والضوء الساطع. لا ترتدي كولونيا معطرة أو المستحضرات.
   ملاحظة: يجب أن لا يكون المراقب العلكة أو الحلوى خلال فترة الاختبار، وينبغي محاولة للحد من تعرضهم للأطعمة رائحة قوية.

5. اختبار الإجراءات

1. جلب الماوس تأقلم في قفصه إلى غرفة الاختبار ووضع القفص على العداد في الارتفاع الذي هو مريح للعرض أثناء الجلوس.
2. تقديم كل رائحة 3 مرات على التوالي لمدة 2 دقيقة في كل مرة. استخدام النظام العرض التي يمكن العثور عليها في الجدول رقم 1.
   1. ماصة 50 ميكرولتر من الرائحة في رائحة لفحصها إلى غيض من مسحة القطن وإعادة الغطاء مصدر الرائحة. رفع الجزء العلوي من سلك القفص وإدراج نسكينتيد، نهاية خشبية للمسحة في افتتاح زجاجة المياه، pushinز طول طريق من الجانب السفلي من السلك إلى الأعلى. تجنب لمس طرف القطن إلى أي شيء، بما في ذلك الأصابع، وذلك لتجنب التلوث رائحة.
   2. الاستمرار في رسم مسحة من خلال فتح زجاجة الماء حتى حوالي 1 بوصة من نهاية القطن يتدلى إلى القفص. يضعوا نهاية خشبية من مسحة إلى جانب القفص باستخدام الشريط المختبر.
      ملاحظة: يجب الحرص على عدم ترك غطاء تقع مرة أخرى إلى القفص، مما تسبب ضوضاء الصاخبة التي من شأنها أن تعكر صفو اختبار الماوس.
   3. تبدأ على الفور توقيت لمدة 2 دقيقة. استخدام توقيت واحد لآخر عرض 2 دقيقة. تسجيل الوقت التراكمي قضى شم رائحة أثناء المحاكمة 2 دقيقة. عد السلوك استنشاق الحيوان باستخدام مراقبة وقف منفصلة. ويعرف استنشاق نشط عندما توجه أنف الحيوان نحو الطرف القطن مع لالأنف ~ 2 سم أو أقرب إلى الحافة.
   4. بعد الانتهاء من كل محاكمة، ورفع غطاء الأسلاك وإزالة قطعة من القطن عن طريق سحبها إلى الأسفل من خلال الأمم المتحدةderside من غطاء (هذا يتجنب التلوث رائحة عن طريق منع غيض من القطن لمس الأسلاك). ختم مسحة المستخدمة في زجاجة النفايات 500 مل.
   5. إعداد وإدراج مسحة القادمة والبدء في التوقيت. السماح حوالي 1 دقيقة بين كل فاصل زمني بين المحاكمة. تستمر حتى تم عرض كل رائحة ثلاث مرات على التوالي، لمدة 2 دقيقة في كل مرة.
3. وبمجرد الانتهاء من جميع المحاكمات الماوس، إفراغ زجاجة من النفايات التي تحتوي على مسحات القطن المستخدمة في سلة المهملات خارج الغرفة الاختبار. عودة الماوس إلى قفص وطنه.

تحليل 6.

1. تحليل البيانات لكل مجموعة في حالة رائحة باستخدام اثنين من طريقة المتبعة ANOVA التي كتبها نيومان Keuls أو اختبار مماثل آخر مخصص لتحديد التعود كبير (أقل وقت استنشاق نفس الروائح متتالية)، وdishabitutation (المزيد من الوقت استنشاق رائحة جديدة).

النتائج

بعد بروتوكول صفها، وقد سجلت النتائج باستخدام عشرة الكبار (يوم بعد الولادة 90-120) من الذكور C57BL / 6J الفئران وثمانية من الذكور FVB سلالة مختلطة الخلفية (يوم بعد الولادة 50-70). وأجري الاختبار من قبل محقق واحد أكثر من عدة أيام. كل نقطة على الرسوم البيانية تمثل متوسط ​​الوقت الذ?...

Discussion

النتائج الواردة في هذه الورقة هي الأمثل بالنسبة للفئران. الفئران تظهر استجابة قوية لرائحة جديدة، ثم روض بسرعة. واحدة من الخطوات الرئيسية في هذه الطريقة هو إعداد الروائح. يحتاج المحقق إلى رعاية كبيرة لعزل الروائح عن بعضها البعض لمنع التلوث. جانبا رئيسيا آخر هو عرض من ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse cage	Allentown	Standard mouse cage
Wire lid	Allentown	BCU Mouse WBL 2500
Bedding	Harlan	7090 Sani-Chips
Cotton swabs	VWR	89031-270	6” wooden handle
Banana extract	McCormick
Almond extract	McCormick
Laboratory tape	VWR	89098-062
Stop watch	VWR	62374-000
Nitrile gloves	VWR	82026
Timing device	VWR	61161-350
15 ml conical tubes	VWR	89003-294
2 L beakers	Pyrex	1003
Parafilm	Parafilm	PM-992	4” x 250’
1 L bottle with cap	VWR	89000-240