Тестирование на Запах дискриминации и привыкания у мышей

Резюме

This manuscript describes a protocol to examine the olfactory system of rodents. The olfactory habituation/dishabituation test will allow investigators to determine whether a mouse habituates to a repeatedly presented odor and whether the mouse demonstrates dishabituation when presented a novel odor.

Аннотация

This video demonstrates a technique to establish the presence of a normally functioning olfactory system in a mouse. The test helps determine whether the mouse can discriminate between non-social odors and social odors, whether the mouse habituates to a repeatedly presented odor, and whether the mouse demonstrates dishabituation when presented with a novel odor. Since many social behavior tests measure the experimental animal’s response to a familiar or novel mouse, false positives can be avoided by establishing that the animals can detect and discriminate between social odors. There are similar considerations in learning tests such as fear conditioning that use odor to create a novel environment or olfactory cues as an associative stimulus. Deficits in the olfactory system would impair the ability to distinguish between contexts and to form an association with an olfactory cue during fear conditioning.

In the odor habitation/dishabituation test, the mouse is repeatedly presented with several odors. Each odor is presented three times for two minutes. The investigator records the sniffing time directed towards the odor as the measurement of olfactory responsiveness. A typical mouse shows a decrease in response to the odor over repeated presentations (habituation). The experimenter then presents a novel odor that elicits increased sniffing towards the new odor (dishabituation). After repeated presentation of the novel odor the animal again shows habituation. This protocol involves the presentation of water, two or more non-social odors, and two social odors. In addition to reducing experimental confounds, this test can provide information on the function of the olfactory systems of new knockout, knock-in, and conditional knockout mouse lines.

Введение

Мыши зависит от обоняния для навигации новых условиях, находя еду, для признания других лиц, и сексуальное поведение ^1-3. Важно, что следователи установить, является ли экспериментальные животные имеют функционирования обоняние, перед введением поведенческие тесты, которые включают еду, социальное взаимодействие, или какие-либо запахи, предназначенные для получения ответа от мыши. Аносмия или неспособность различать запахи, может привести к ложных срабатываний или негативов в самых разнообразных поведенческих парадигм, так способность мышь, чтобы обнаруживать и различать запахи должны быть установлены прежде, чем другие типы поведенческих тестов выполняются.

Обонятельная тест привыкание / dishabituation был впервые описан в 1980-х годах ^4. Тест был адаптирован для использования у мышей Drs. Му Ян и Жаклин Кроули ^5. Это простой и недорогой тест, который позволяет следователю ЭСТАБлиш, что мышь может обнаружить и различать запахи. В дополнение к тестированию обоняние, этот тест позволяет следователю наблюдать общее поведение мыши и должно быть сделано в начале режима тестирования. Качественные наблюдения, касающиеся передвижения мышки, признаки беспокойства, уровень активности, и ответ на социальные запахов в сравнении пищевых запахов может сигнализировать новые области, в которых тестирование может быть выполнена.

В этом тесте, ватные тампоны окунают в различных запахов представлены в мыши три раза подряд. С каждым повторным презентации запаха, мыши привыкают к ватным тампоном, тратить меньше времени на исследование его с каждым последующим представлением. Когда новый запах представлены, dishabituation происходит, и типичный мыши будут тратить больше времени на исследование тампон, указывая, что он может различать между текущим и предыдущим запахов ^5. Этот тест вводят одной мыши в то время, и включает в себя 45 мин соотвПериод limation затем 45 мин испытания.

Хотя этот тест легко проводить его можно использовать, чтобы исследовать сложные вопросы о системе мышь обонятельной. Другие интересные испытания обоняния, такие как тест погребенного пищевой, просто установить наличие или отсутствие обоняния. Тем не менее, тест обонятельные дискриминации и привыкание позволяет следователем, чтобы определить, что мышь не только имеет способность обнаруживать запахи, но может различать разные запахи. Структура привыкание и dishabituation был использован, чтобы установить, что новые мутанты могут различать запахи ^6,7. В удивительном исследовании, Fadool и его коллеги использовали сложные смеси запахов, чтобы показать, что у мышей с ген-направленной делецией Kv1.3 канала "супер smellers", которые могут различать очень похожие запахи лучше, чем у нормальных мышей ^8.

При рассмотрении новой модели мыши нокаутом полезно establisч Наличие нормального поведения для основных сенсорных задач. Когда это сделано в начале режима тестирования, дискриминации и запах тест привыкание дает следователь возможность наблюдать какие-либо необычные поведения. Эти наблюдения могут предотвратить ложные положительные или отрицательные результаты в последующих испытаний, которые относятся к недостоверным характеристики мутанта. Как исследователи продолжают исследовать социальное поведение необходимость проверки основной обонятельной функции становится все более важным. Помимо изучения обоняния в мутантных линий, этот тест может быть использован для решения конкретных вопросов, таких как конкретно, увеличивает ли фармакологическое лечение реакцию животного на раздражители социальных запаха или если их увеличивается ответ на все раздражители запах.

протокол

Взрослый самец мыши, используемые в следующем эксперименте были получены и размещены на Бейлор университета при температуре окружающей среды 22 ° C, с 14 ч света и 10 часов темного (с 20:00 до 6:00 ч) суточного цикла. Мыши были даны вволю доступ к пище и воде. Все процедуры в мышей были в соответствии с Национальными Институтами Здоровья Руководства по уходу и использованию лабораторных животных и протокола животных был одобрен Бейлор университета уходу и использованию животных комитета. Мыши были проверены в конце утренней / после полудня. Для всех процедур ниже следователя должны носить перчатки для устранения запахов и предотвращения загрязнения.

1. Подготовка Номера для социальных Запахи

1. Подготовка свежих несоциальными запахи каждый день тестирования.
   Примечание: следователь должен использовать перчатки, чтобы подготовить запахи.
   1. Заполните 3 центрифужные пробирки с 10 мл воды каждый раз.
   2. Внесите 100 мкл экстракта банана в 15 мл и #160; коническую трубку и 100 мкл экстракта миндаля во второй 15 мл коническую трубку для 1: 100 разбавления.
      Примечание: В третьем трубки 15 мл будет содержать только воду.

2. Подготовка социальных Запахи

1. Подготовьте свежие запахи социальных утренним тестирования будет происходить. Получить социальных запахи из двух клеток, которые не были очищены в течение по крайней мере трех дней, и содержат одинаковое число мышей. Получить социальных запахи из мышей того же пола, что и испытуемого.
   Примечание: Они должны быть сохранены при комнатной температуре и должны быть использованы в течение 4-6 ч, чтобы поддерживать сильную и последовательную запах.
   1. Определите, сколько социальная запах ватные тампоны должны быть созданы: каждая мышь проходит испытания будут представлены три мазков из социальной запаха 1, и три из социальной запаха 2.
   2. Подготовка социальных запахи, вытирая ватный тампон в зигзагообразно по дну грязной клетке. Стряхните излишки кроватях цепляясь к кончику.
   3. Храните тампоны в больших стеклянных банках с крышками или в стаканах, покрытых парафином. Назначить один контейнер для социальной запахом 1 и второй для запах социальной 2.
2. Поддерживать исходные клетки запах пределами экспериментальной комнате тестирования.

3. Акклиматизация в Test Mouse

1. Наденьте перчатки и весят мышь, чтобы быть проверены и поместить в отдельную клетку с чистой проволоки крышкой сверху и бутылку воды удаляется.
2. Разрешить мыши, чтобы привыкнуть к новой клетке в течение 45 мин в комнате, кроме комнату тестирования. Убедитесь, что нет никаких необычных запахов или звуков в комнате.
3. Как тестирование занимает около 45 мин, шатаются раз акклиматизационных поставив следующий мышь, чтобы быть проверены в чистую клетку, чтобы акклиматизироваться право перед тестированием текущей мыши.

4. Подготовка тестирования номер

1. Поместите свежие ватные тампоны, лабораторное ленту, бутылки, содержащие тампоны социальных запах, трубы из пна-социальной запахи, микропипетка, два таймера, и отходов бутылка с крышкой в ​​комнату тестирования.
2. Убедитесь, что тестирование комнате достаточно свободной от запахов, громких звуков, и яркий свет. Не носите душистые одеколоны и лосьоны.
   Примечание: наблюдатель не должен быть жевательной резинки или конфеты в период тестирования и должны попытаться ограничить их воздействие на сильный запах продуктов.

5. Порядок Тестирование

1. Принесите приспособиться мышь в клетке в комнату тестирования и поместите в клетку на прилавке на высоте, что удобно для просмотра сидя.
2. Представьте каждый запаха 3 раза подряд в течение 2 мин каждый раз. Используйте порядок представления, что можно найти в таблице 1.
   1. Внесите 50 мкл одоранта в аромат для тестирования на кончике ватный тампон и повторно-CAP источник запаха. Поднимите верхнюю часть проволоки клетке и вставьте запаха, деревянный конец тампона в отверстие бутылки воды, Пушинг длина до с нижней стороны провода к вершине. Старайтесь не прикасаться кончиком хлопка к чему, в том числе пальцев, так что загрязнение запах избегать.
   2. Продолжайте рисовать тампон через отверстие бутылки воды примерно до 1 дюйм в конце хлопка не свисает в клетку. Прикрепите деревянную конец тампона к стороне клетки с использованием лаборатории ленту.
      Примечание: Будьте осторожны, чтобы не позволить крышка отступить на клетку, в результате чего громкий шум, который бы нарушить тест мыши.
   3. Сразу начала отсчета времени в течение 2 мин. Используйте один таймер тайм 2 мин презентацию. Запишите общее время, затрачиваемое нюхать запах во время 2 мин судебного разбирательства. Граф поведение нюхают животного с помощью отдельного секундомер. Активный фырканье определяется при нос животного ориентирована на кончике хлопка с его носа ~ 2 см или ближе к кончику.
   4. После завершения каждого испытания, поднять крышку провода и снимите ватным тампоном, потянув его вниз через ООНderside крышки (это позволяет избежать загрязнения запах, предотвращая кончик хлопок от прикосновения провода). Печать использованный тампон в 500 мл бутыли с отходами.
   5. Подготовка и вставьте следующий тампон и начать синхронизацию. Разрешить примерно 1 мин между каждым том следственном интервала. Продолжайте, пока каждый аромат не был представлен три раза подряд, в течение 2 мин каждый раз.
3. После того, как мышь завершила все испытания, очистить бутылку отходов, содержащих использованные ватные тампоны в мусорное ведро за пределами испытательной камере. Вернуться мышь, чтобы его клетку.

6. Анализ

1. Анализ данных для каждой группы условии запах, используя двусторонний ANOVA с последующим Newman-Кеулса или аналогичный тест постфактум, чтобы определить, значительное привыкание (менее времени нюхать последовательных же запахи), и dishabitutation (более нюхает новый запах времени).

Результаты

Следуя протоколу, описанному, результаты были записаны с использованием десяти взрослых (постнатальный день 90-120) самцов мышей C57BL / 6J и восемь мужчин FvB смешанного фона штамма (50-70-й постнатальный день). Тестирование проводилось с помощью одного исследователя над нескольких дней. Каждая ...

Обсуждение

Результаты, представленные в настоящем документе, являются оптимальными для мышей. Мыши демонстрируют сильный ответ на нового запаха, а затем быстро привыкают. Одним из ключевых шагов в этом методе является подготовка запахов. Следователь должен проявлять большую осторожность, чтобы ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse cage	Allentown	Standard mouse cage
Wire lid	Allentown	BCU Mouse WBL 2500
Bedding	Harlan	7090 Sani-Chips
Cotton swabs	VWR	89031-270	6” wooden handle
Banana extract	McCormick
Almond extract	McCormick
Laboratory tape	VWR	89098-062
Stop watch	VWR	62374-000
Nitrile gloves	VWR	82026
Timing device	VWR	61161-350
15 ml conical tubes	VWR	89003-294
2 L beakers	Pyrex	1003
Parafilm	Parafilm	PM-992	4” x 250’
1 L bottle with cap	VWR	89000-240