Las pruebas para detectar olor Discriminación y habituación en ratones

Resumen

This manuscript describes a protocol to examine the olfactory system of rodents. The olfactory habituation/dishabituation test will allow investigators to determine whether a mouse habituates to a repeatedly presented odor and whether the mouse demonstrates dishabituation when presented a novel odor.

Resumen

This video demonstrates a technique to establish the presence of a normally functioning olfactory system in a mouse. The test helps determine whether the mouse can discriminate between non-social odors and social odors, whether the mouse habituates to a repeatedly presented odor, and whether the mouse demonstrates dishabituation when presented with a novel odor. Since many social behavior tests measure the experimental animal’s response to a familiar or novel mouse, false positives can be avoided by establishing that the animals can detect and discriminate between social odors. There are similar considerations in learning tests such as fear conditioning that use odor to create a novel environment or olfactory cues as an associative stimulus. Deficits in the olfactory system would impair the ability to distinguish between contexts and to form an association with an olfactory cue during fear conditioning.

In the odor habitation/dishabituation test, the mouse is repeatedly presented with several odors. Each odor is presented three times for two minutes. The investigator records the sniffing time directed towards the odor as the measurement of olfactory responsiveness. A typical mouse shows a decrease in response to the odor over repeated presentations (habituation). The experimenter then presents a novel odor that elicits increased sniffing towards the new odor (dishabituation). After repeated presentation of the novel odor the animal again shows habituation. This protocol involves the presentation of water, two or more non-social odors, and two social odors. In addition to reducing experimental confounds, this test can provide information on the function of the olfactory systems of new knockout, knock-in, and conditional knockout mouse lines.

Introducción

Los ratones son dependientes de olfato para navegar nuevos entornos, la búsqueda de alimentos, para el reconocimiento de otras personas, y el comportamiento sexual ^1-3. Es esencial que los investigadores determinar si o no los animales experimentales tienen un sentido del olfato funcionamiento antes de la administración de las pruebas de comportamiento que implican la comida, la interacción social, o cualquier olor destinadas a provocar una respuesta desde el ratón. La anosmia o la incapacidad para distinguir entre diferentes olores, podría dar lugar a falsos positivos o negativos en una amplia variedad de paradigmas de comportamiento, por lo que la capacidad de un ratón para detectar y distinguir los olores se deben establecer antes de realizar otros tipos de pruebas de comportamiento.

La prueba de habituación / deshabituación olfativa fue descrita por primera vez en la década de 1980 ^4. La prueba ha sido adaptado para su uso en los ratones por los Dres. Mu Yang y Jacqueline Crawley ^5. Esta es una prueba sencilla y de bajo costo que permite al investigador thisblecer que un ratón puede detectar y diferenciar entre los olores. Además de probar el olfato, esta prueba permite al investigador para observar el comportamiento general del ratón y debe hacerse temprano en un régimen de pruebas. Observaciones cualitativas respecto a la locomoción del ratón, los signos de ansiedad, nivel de actividad, y la respuesta a los olores sociales frente a los olores de los alimentos puede ser señal de nuevas áreas en las que la prueba podría llevarse a cabo.

En esta prueba, hisopos de algodón humedecido en varios olores se presentan a un ratón de tres veces seguidas. Con cada presentación repetida de un olor, el ratón se habitúan a la esponja de algodón, gastando menos tiempo a investigar con cada presentación posterior. Cuando se presenta un nuevo olor, deshabituación ocurre, y un ratón típico pasar más tiempo investigando el hisopo, lo que indica que puede discriminar entre los olores actuales y los anteriores ^5. Esta prueba se administra a un ratón en un momento e incluye un acc 45 minperiodo limation seguido por 45 min de la prueba.

Aunque esta prueba es fácil de llevar a cabo que se puede utilizar para investigar cuestiones sofisticadas sobre el sistema olfativo del ratón. Otras pruebas populares del olfato, como la prueba de alimentos enterrados, simplemente establecer la presencia o ausencia de la anosmia. Sin embargo, la prueba de discriminación y la habituación olfativa permite al investigador determinar que un ratón no sólo tiene la capacidad de detectar olores pero puede discriminar entre diferentes olores. El patrón de habituación y deshabituación se ha utilizado para establecer que los nuevos mutantes pueden discriminar entre los olores ^6,7. En un estudio sorprendente, Fadool y sus colegas utilizaron mezclas complejas de olores para mostrar que los ratones con deleción del gen de orientación del canal Kv1.3 son "súper smellers" que pueden discriminar olores muy similares mejor que los ratones normales ^8.

Al examinar un nuevo modelo de ratón knockout es útil establish la presencia de un comportamiento normal para tareas sensoriales básicos. Cuando se hace temprano en un régimen de pruebas, la discriminación de olores y prueba de habituación da un investigador la oportunidad de observar cualquier comportamiento inusual. Estas observaciones podrían evitar resultados positivos o falsos negativos en las pruebas posteriores que son atribuibles a la confusión características del mutante. Como investigadores continúan investigando el comportamiento social la necesidad de verificar la función olfativa básico será cada vez más importante. Además de examinar el olfato en líneas mutantes, esta prueba se puede utilizar para abordar cuestiones específicas, como si un tratamiento farmacológico aumenta específicamente la respuesta de un animal a los estímulos de olor sociales o si aumenta su respuesta a todos los estímulos de olor.

Protocolo

Los ratones machos adultos utilizados en el experimento siguiente se generaron y se alojaron en la Universidad de Baylor en una temperatura ambiente de 22 ° C, con una luz de 14 horas y 10 horas oscuridad (20:00-6:00 hr) ciclo diurno. Los ratones tuvieron acceso ad libitum a comida y agua. Todos los procedimientos a los ratones estaban en el cumplimiento de los Institutos Nacionales de Salud para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio y el protocolo de animales fue aprobado por la Universidad de Baylor Cuidado de Animales y el empleo Comisión. Los ratones se pusieron a prueba en el final de la mañana / tarde. Para todos los procedimientos a continuación el investigador debe usar guantes para eliminar olores y evitar la contaminación.

1. Preparación de olores no sociales

1. Preparar los olores no sociales frescas cada día de la prueba.
   Nota: El investigador debe utilizar guantes para preparar los olores.
   1. Rellene 3 tubos de centrífuga con 10 ml de agua cada uno.
   2. Pipetear 100 l de extracto de plátano en un 15 ml & #160; tubo cónico y 100 l de extracto de almendra en un segundo tubo cónico de 15 ml para una dilución 1: 100.
      Nota: El tercer tubo 15 ml sólo contendrá agua.

2. Preparación de los olores Sociales

1. Preparar olores sociales frescas en las pruebas de la mañana va a producir. Obtener olores sociales a partir de dos jaulas que no han sido limpiados por lo menos durante tres días, y contener un número igual de ratones. Obtener olores sociales de los ratones del mismo sexo que el sujeto de la prueba.
   Nota: Estos son para ser almacenado a temperatura ambiente y se deben utilizar dentro de 4-6 horas para mantener el olor fuerte y consistente.
   1. Determinar cuántos se va a crear el olor sociales hisopos de algodón necesitan: cada ratón está probando se presentará con tres hisopos de olor sociales 1, y tres de olor sociales 2.
   2. Preparar olores sociales frotando un hisopo de algodón en forma de zigzag a través de la parte inferior de una jaula sucia. Agitar el exceso de ropa de cama de aferrarse a la punta.
   3. Hisopos de las tiendas en grandes frascos de vidrio con tapa o en vasos cubiertos con parafilm. Designar un contenedor para el olor sociales 1 y un segundo para el olor sociales 2.
2. Mantener las jaulas de origen olor fuera de la sala de pruebas experimentales.

3. Aclimatación del ratón de prueba

1. Póngase los guantes y pesar el ratón para ser probado y colocar individualmente en una jaula limpia con una tapa de alambre en la parte superior y la botella de agua eliminada.
2. Deje que el ratón para aclimatarse a la nueva jaula durante 45 minutos en una habitación aparte de la sala de pruebas. Asegúrese de que no hay olores extraños o ruidos en la habitación.
3. Como prueba dura aproximadamente 45 minutos, escalonar los tiempos de aclimatación al poner el ratón junto a ensayar en una jaula limpia para aclimatarse a la derecha antes de probar el ratón actual.

4. Preparación de la sala de pruebas

1. Coloque los hisopos de algodón fresco, cinta de laboratorio, las botellas que contienen hisopos de olores sociales, los tubos de nin sociales olores, una micropipeta, dos temporizadores, y una botella de residuos con una tapa en la sala de pruebas.
2. Asegúrese de que la sala de pruebas está razonablemente libre de olores, ruidos fuertes, y de luz brillante. No use colonias o lociones perfumadas.
   Nota: El observador no debe ser la goma de mascar o caramelos durante el período de pruebas y debe tratar de limitar su exposición a fuertes alimentos de olor.

5. Procedimiento de prueba

1. Traiga el ratón ambientada en su jaula en la sala de pruebas y colocar la jaula en el mostrador a una altura que sea cómoda para su visualización mientras está sentado.
2. Presentar cada olor 3 veces seguidas durante 2 minutos cada vez. Utilice el orden de presentación que se pueden encontrar en la Tabla 1.
   1. Pipeta 50 l de odorizante en el olor a ensayar a la punta del hisopo de algodón y re-cap la fuente de olor. Levante la parte superior de la jaula de alambre e inserte el extremo sin perfume, de madera de la torunda en la abertura de la botella de agua, empujandog la longitud a través de la parte inferior del cable a la parte superior. Evite tocar la punta de algodón para cualquier cosa, incluyendo los dedos, de modo que se evite la contaminación de olores.
   2. Continuar para dibujar el hisopo a través de la abertura de la botella de agua hasta aproximadamente 1 pulgada del extremo de algodón cuelga hacia abajo en la jaula. Colocar el extremo de madera de la torunda hacia un lado de la jaula usando cinta de laboratorio.
      Nota: Tenga cuidado de no dejar caer la tapa de nuevo en la jaula, provocando un fuerte ruido que perturbe el ratón prueba.
   3. Inmediatamente comenzará la sincronización durante 2 min. Use un temporizador para medir el tiempo de la presentación de 2 minutos. Registre el tiempo acumulado pasado oler el olor durante el juicio 2 min. Cuente comportamiento inhalación del animal utilizando un cronómetro separado. Sniffing activo se define cuando la nariz del animal se orienta hacia la punta de algodón con su nariz ~ 2 cm o más cerca de la punta.
   4. Tras la finalización de cada ensayo, levantar la tapa de alambre y retire el hisopo de algodón tirando de él hacia abajo a través de la ONUlado inferior de la tapa (esto evita la contaminación de olores mediante la prevención de la punta de algodón de tocar el cable). Sellar el hisopo utilizado en botella de residuos de 500 ml.
   5. Preparar e insertar la siguiente hisopo y comenzar la sincronización. Deje aproximadamente 1 minuto entre cada intervalo entre ensayos. Continúe hasta que cada aroma se ha presentado tres veces seguidas, durante 2 minutos cada vez.
3. Una vez que el ratón se ha completado todos los ensayos, vaciar la botella de residuos que contienen los hisopos de algodón usados ​​en un bote de basura fuera de la sala de ensayo. Devuelva el ratón a su jaula.

6. Análisis

1. Analizar los datos para cada grupo por condición olor usando ANOVA de dos vías seguido de Newman-Keuls o una prueba post hoc similar para determinar la habituación significativa (menos tiempo olfateando sucesivas mismos olores), y dishabitutation (más tiempo olfateando un nuevo olor).

Resultados

Siguiendo el protocolo descrito, los resultados se registraron utilizando diez adultos (día postnatal 90-120) macho C57BL / 6J y ocho macho cepa FVB mixta de fondo (día postnatal 50-70). La prueba se llevó a cabo por un solo investigador a través de múltiples días. Cada punto en los gráficos representa el tiempo medio dedicado a investigar un olor.

Cuando el hisopo de algodón humedecido en agua se introdujo por primera vez, los ratones pasan una gran cantidad de tiempo investigando e...

Discusión

Los resultados proporcionados en este documento son óptimas para los ratones. Los ratones muestran una fuerte respuesta a un nuevo olor, a continuación, se habitúan rápidamente. Uno de los pasos clave en este método es la preparación de los olores. El investigador tiene que tener mucho cuidado para aislar los olores entre sí para evitar la contaminación. Otro aspecto clave es la presentación de la esponja de algodón. El investigador tiene que solucionar la mejor ubicación de la punta de algodón por lo que el...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse cage	Allentown	Standard mouse cage
Wire lid	Allentown	BCU Mouse WBL 2500
Bedding	Harlan	7090 Sani-Chips
Cotton swabs	VWR	89031-270	6” wooden handle
Banana extract	McCormick
Almond extract	McCormick
Laboratory tape	VWR	89098-062
Stop watch	VWR	62374-000
Nitrile gloves	VWR	82026
Timing device	VWR	61161-350
15 ml conical tubes	VWR	89003-294
2 L beakers	Pyrex	1003
Parafilm	Parafilm	PM-992	4” x 250’
1 L bottle with cap	VWR	89000-240