마우스에서 냄새 차별과 요법 이니에 대한 테스트

요약

This manuscript describes a protocol to examine the olfactory system of rodents. The olfactory habituation/dishabituation test will allow investigators to determine whether a mouse habituates to a repeatedly presented odor and whether the mouse demonstrates dishabituation when presented a novel odor.

초록

This video demonstrates a technique to establish the presence of a normally functioning olfactory system in a mouse. The test helps determine whether the mouse can discriminate between non-social odors and social odors, whether the mouse habituates to a repeatedly presented odor, and whether the mouse demonstrates dishabituation when presented with a novel odor. Since many social behavior tests measure the experimental animal’s response to a familiar or novel mouse, false positives can be avoided by establishing that the animals can detect and discriminate between social odors. There are similar considerations in learning tests such as fear conditioning that use odor to create a novel environment or olfactory cues as an associative stimulus. Deficits in the olfactory system would impair the ability to distinguish between contexts and to form an association with an olfactory cue during fear conditioning.

In the odor habitation/dishabituation test, the mouse is repeatedly presented with several odors. Each odor is presented three times for two minutes. The investigator records the sniffing time directed towards the odor as the measurement of olfactory responsiveness. A typical mouse shows a decrease in response to the odor over repeated presentations (habituation). The experimenter then presents a novel odor that elicits increased sniffing towards the new odor (dishabituation). After repeated presentation of the novel odor the animal again shows habituation. This protocol involves the presentation of water, two or more non-social odors, and two social odors. In addition to reducing experimental confounds, this test can provide information on the function of the olfactory systems of new knockout, knock-in, and conditional knockout mouse lines.

서문

마우스는 다른 개인을 인식하는, 음식을 찾는 새로운 환경을 탐색하기위한 후각에 의존하고, 성적 행동 ^1-3. 그것은 연구자가 실험 동물 음식, 사회적 상호 작용, 또는 마우스의 응답을 유도하기위한 어떤 냄새를 포함하는 행동 테스트를 투여하기 전에 냄새가 작동하는 감각을 가지고 있는지 여부를 설정하는 것이 중요하다. 후각 상실증 또는 무능력 행동 패러다임 다양한 가양 음화 초래할 수있는 다른 냄새 구별하기 때문에 행동 검사의 다른 유형이 수행되기 전에 검출하고 악취를 구별하는 마우스의 능력은 확립되어야한다.

후각 습관화 / dishabituation 시험 제 1980 ^4에 기재 하였다. 시험은 박사에 의해 마우스에서 사용되도록되어왔다. 뮤 양 및 재클린 크롤리 ^5. 이 조사는 ESTA 할 수있는 간단하고 저렴한 검사입니다마우스를 감지하고 냄새를 구별 할 수 blish. 후각 테스트뿐만 아니라,이 테스트는 조사자 마우스의 일반적인 동작을 관찰하고 초기 테스트 요법으로 수행 할 수있게한다. 질적 마우스의 운동에 대한 관찰, 불안의 징후, 활동 수준, 음식 냄새 대 사회 냄새에 반응 테스트를 수행 할 수있는 새로운 영역을 신호 수 있습니다.

이 시험에서, 다양한 냄새에 침지 면봉 행 마우스에 세 번 제공된다. 냄새의 각 반복 프레 젠 테이션으로, 마우스는 각 후속 프리젠 테이션을 조사 적은 시간을 보내고, 면봉에 길들 것이다. 새로운 냄새가 제공되면 dishabituation가 발생하고, 전형적인 마우스는 현재 및 이전 ⁽⁵⁾ 냄새를 구별 할 수 있음을 나타내는, 면봉을 조사 시간을 보낼 것이다. 이 시험은 한번에 하나의 마우스에 투여하고 45 분 ACC를 포함limation 기간은 시험을 45 분으로 하였다.

이 테스트를 수행하기 쉽지만 그것은 마우스 후각 시스템에 대한 정교한 질문을 조사하는데 사용될 수있다. 이러한 매립 식품 시험 후각 등의 다른 대중적인 테스트는 단순히 후각 상실증의 유무를 확립한다. 그러나 후각 차별과 습관화 검사는 수사관이 마우스는 냄새를 감지 할 수 있지만, 다른 냄새를 구별 할 수있는 능력을 가지고뿐만 아니라 것을 확인할 수 있습니다. 습관화 및 dishabituation의 패턴은 새로운 돌연변이 ^-6,7- 냄새를 구별 할 수 있음을 확립하는데 사용되어왔다. 놀라운 연구에서, Fadool 연구진은 정상 마우스 ^(8)보다 매우 유사한 냄새를 구별 할 수 있습니다 "슈퍼 smellers을"Kv1.3 채널의 유전자 타겟 삭제와 그 쥐를하고 있습니다 보여 냄새의 복잡한 혼합물을 사용했다.

새로운 녹아웃 마우스 모델을 검토 할 때 그것은 establis하는 데 유용합니다시간 기본 감각 작업에 대한 정상적인 동작의 존재. 테스트식이 요법 초기에 완료되면, 냄새 차별과 습관화 검사는 수사관에게 이상한 행동을 관찰 할 수있는 기회를 제공합니다. 이러한 관찰은 돌연변이의 특성을 교란하기 때문입니다 이후 테스트에서 거짓 긍정적이거나 부정적인 결과를 방지 할 수있다. 연구자들은 사회적 행동을 기본 후각 기능을 검증 할 필요성을 조사하기 위해 지속적으로 점점 더 중요 해지고있다. 돌연변이 라인 후각 검사 이외에도,이 시험은 모든 냄새 자극에 대한 약리학 적 치료가 특히 사회적 냄새 자극에 대한 동물의 반응을 증가 여부 등 또는 그들의 응답이 향상되는지 구체적인 질문을 해결하기 위해 사용될 수있다.

프로토콜

다음 실험에 사용 된 성인 남성 쥐가 생성되어 어두운 14 시간 조명 및 10 시간 (20시부터 6시까지 시간) 낮의주기, 22 ° C의 주변 온도에서 베일러 대학에서 보관 하였다. 마우스는 음식과 물에 대한 광고 무제한 액세스 권한을 부여했다. 마우스에 대한 모든 절차는 베일러 대학 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인 된 실험실 동물의 관리 및 사용과 동물의 프로토콜에 대한 건강 가이드의 국립 연구소에 부합했다. 마우스는 늦은 아침 / 오후 일찍 시험 하였다. 연구자 아래의 모든 절차는 냄새를 제거하고 오염을 방지하기 위해 장갑을 착용해야합니다.

비 사회적 냄새 1. 준비

1. 신선한 비 사회적 냄새를 테스트의 매일을 준비합니다.
   주 : 조사는 냄새를 준비하기 위해 장갑을 사용해야합니다.
   1. 물 각각 10 ㎖로 3 원심 분리기 튜브를 입력합니다.
   2. 15 ml의 & #에 바나나 추출물의 피펫 100 μL(160), 원뿔 튜브와 1 초 15 ML 원뿔 튜브에 아몬드 추출물 100 ㎕ : 100 희석.
      참고 : 제 15 ML 튜브는 물을 포함 할 것이다.

사회 냄새 2. 준비

1. 발생합니다 아침 시험에 신선한 사회적 냄새를 준비합니다. 적어도 3 일에 대한 청소와 마우스의 동일한 번호가 포함되지 않은 두 개의 케이지에서 사회 냄새를 얻습니다. 테스트 피사체와 같은 성별의 생쥐에서 사회적 냄새를 얻습니다.
   주 :이 RT에 저장되는 강한 냄새 일관성을 유지하기 위해 4-6 시간 이내에 사용하여야한다.
   1. 면봉이 필요로하는 사회적 냄새가 생성하는 방법에 대해 많은 결정 : 테스트중인 각 마우스는 사회 냄새 2에서 사회 냄새 1, 3의 세 면봉으로 표시됩니다.
   2. 더러운 케이지의 하단에 지그재그 방식으로 면봉을 닦아 사회 냄새를 준비합니다. 팁에 집착 초과 침구를 흔들어.
   3. 뚜껑 또는 파라 필름으로 덮여 비커에 큰 유리 항아리에 보관 면봉. 한 사회 냄새 1 컨테이너 및 사회 냄새 2 번째를 지정합니다.
2. 실험 테스트 룸의 외부 냄새 소스 새장을 유지한다.

테스트 마우스 3. 적응도

1. 장갑을 착용하고 테스트 할 마우스의 무게 위에 와이어 뚜껑 제거 물 병 깨끗한 케이지에 개별적으로 배치합니다.
2. 마우스가 테스트 룸이 아닌 다른 방에서 45 분 동안 새 케이지에 적응하도록 허용합니다. 방에는 이상한 냄새 나 소음이 없는지 확인합니다.
3. 테스트는 약 45 분 소요로, 현재의 마우스를 테스트하기 전에 권리를 적응 깨끗한 케이지에 테스트 할 다음 마우스를 바꾸어 적응 시간을 비틀.

테스트 룸 4. 준비

1. 신선한 면봉, 실험실 테이프, 사회 냄새 면봉이 들어있는 병, N의 튜브를 배치온 사회 냄새, 마이크로 피펫, 두 타이머 및 시험 방에 뚜껑이있는 폐기물 병.
2. 테스트 룸 냄새, 시끄러운 소리, 밝은 빛의 합리적 없는지 확인합니다. 향수 오드 콜로 뉴 또는 로션을 착용하지 마십시오.
   참고 : 관찰자는 테스트 기간 동안 껌이나 사탕을 씹는 안 강한 냄새 식품에 노출을 제한하는 시도해야합니다.

5. 시험 절차

1. 시험 방으로 새장에 적응 마우스를 가져오고 앉아있는 동안 볼 편안한 높이에 카운터에 새장을 배치합니다.
2. 2 분 동안 각 행의 각 냄새 3 회 제시. 표 1에서 발견 될 수있는 프리젠 테이션을 위해 사용한다.
   1. 피펫 향기에 부 취제의 50 μL은 면봉의 끝 부분에 테스트 냄새 소스를 캡 다시합니다. 뱃짱, 새장 와이어 상단을 들어 올려 물 병 구멍에 면봉의 무향, 나무 끝​​을 삽입G 가기 와이어의 아래쪽에서를 통해 길이. 그 냄새의 오염이 방지되도록, 손가락을 포함하여 아무것도에면의 끝 부분을 만지지 마십시오.
   2. 면 끝의 약 1 인치 케이지로 아래로 중단 될 때까지 물 병 구멍에 면봉을 끌기 위해 계속합니다. 실험실 테이프를 사용하여 케이지의 측면에 면봉의 나무 끝​​을 붙입니다.
      참고 : 뚜껑을 다시 케이지 위에 떨어지지 않도록주의, 테스트 마우스를 방해 할 큰 소음을 유발.
   3. 즉시 2 분 동안 타이밍을 시작합니다. 2 분의 프리젠 테이션 시간이 하나의 타이머를 사용합니다. 2 분 재판 중에 냄새를 킁킁 소요 된 누적 시간을 기록한다. 별도 스톱워치를 사용하여 동물의 행동을 스니핑 개수. 동물의 코는 코 ~ 2cm 또는 팁에 가까운과면 팁을 지향 할 때 활성 스니핑가 정의됩니다.
   4. 각각의 시험의 종료 후, 와이어 리드를 올리고 UN 통해 아래쪽으로 당겨 면봉 삭제뚜껑 derside (이 와이어를 접촉하는면 팁을 방지하여 악취 오염을 피한다). 500 ml의 폐기물 병에 사용 된 면봉을 밀봉.
   5. 준비하고 다음 면봉을 삽입하고 타이밍을 시작합니다. 각 간 시험 간격 사이에 약 1 분을 허용합니다. 각각의 향기가 2 분마다 시간, 3 회 연속으로 제공되었다까지 계속한다.
3. 마우스가 모든 시험을 완료하면, 할 수있는 외부 시험의 객실에 쓰레기통에 사용 된 면봉을 포함하는 폐기물 병을 비 웁니다. 홈 케이지에 마우스를 돌려줍니다.

6. 분석

1. 분산 분석은 뉴먼 - Keuls 다음 양방향 또는 중요한 습관화를 결정하는 유사한 포스트 특별 시험 (연속 같은 냄새 스니핑 적은 시간), 및 dishabitutation (더 많은 시간 새로운 냄새를 킁킁)를 사용하여 냄새의 조건에 따라 각 그룹에 대한 데이터를 분석 할 수 있습니다.

결과

기술 된 프로토콜에 따라, 결과는 열 성인 (출생 후 하루 90-120) 남성 C57BL / 6J 마우스와 팔 남성 FVB 혼합 배경 변형 (출생 후 하루 50 ~ 70)를 사용하여 기록 하였다. 테스트는 여러 날에 걸쳐 하나의 연구자에 의해 수행되었다. 그래프의 각 점은 냄새를 조사 소요되는 평균 시간을 나타냅니다.

물에 침지 면봉이 처음에 도입되는 경우에는,이 마우스는 새로운 물체 (: 처음 세 데이?...

토론

이 문서에서 제공되는 결과는 마우스에 최적입니다. 마우스는 새로운 냄새에 강한 반응을 보여, 신속하게 길들. 이 방법의 주요 단계 중 하나는 악취의 제조이다. 조사는 오염을 방지하기 위해 서로 냄새를 분리하기 위해 상당한주의를 기울 필요가있다. 또 다른 중요한 측면은 면봉의 표현이다. 마우스가 팁을 조사 할 수 있지만, 끝에 찢어지지 않도록 조사는면 팁의 최적의 위치 문제를 해결해야...

자료

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse cage	Allentown	Standard mouse cage
Wire lid	Allentown	BCU Mouse WBL 2500
Bedding	Harlan	7090 Sani-Chips
Cotton swabs	VWR	89031-270	6” wooden handle
Banana extract	McCormick
Almond extract	McCormick
Laboratory tape	VWR	89098-062
Stop watch	VWR	62374-000
Nitrile gloves	VWR	82026
Timing device	VWR	61161-350
15 ml conical tubes	VWR	89003-294
2 L beakers	Pyrex	1003
Parafilm	Parafilm	PM-992	4” x 250’
1 L bottle with cap	VWR	89000-240