Test per Odore Discriminazione e assuefazione nei topi

Riepilogo

This manuscript describes a protocol to examine the olfactory system of rodents. The olfactory habituation/dishabituation test will allow investigators to determine whether a mouse habituates to a repeatedly presented odor and whether the mouse demonstrates dishabituation when presented a novel odor.

Abstract

This video demonstrates a technique to establish the presence of a normally functioning olfactory system in a mouse. The test helps determine whether the mouse can discriminate between non-social odors and social odors, whether the mouse habituates to a repeatedly presented odor, and whether the mouse demonstrates dishabituation when presented with a novel odor. Since many social behavior tests measure the experimental animal’s response to a familiar or novel mouse, false positives can be avoided by establishing that the animals can detect and discriminate between social odors. There are similar considerations in learning tests such as fear conditioning that use odor to create a novel environment or olfactory cues as an associative stimulus. Deficits in the olfactory system would impair the ability to distinguish between contexts and to form an association with an olfactory cue during fear conditioning.

In the odor habitation/dishabituation test, the mouse is repeatedly presented with several odors. Each odor is presented three times for two minutes. The investigator records the sniffing time directed towards the odor as the measurement of olfactory responsiveness. A typical mouse shows a decrease in response to the odor over repeated presentations (habituation). The experimenter then presents a novel odor that elicits increased sniffing towards the new odor (dishabituation). After repeated presentation of the novel odor the animal again shows habituation. This protocol involves the presentation of water, two or more non-social odors, and two social odors. In addition to reducing experimental confounds, this test can provide information on the function of the olfactory systems of new knockout, knock-in, and conditional knockout mouse lines.

Introduzione

I topi sono dipendenti olfatto per la navigazione nuovi ambienti, trovare cibo, per riconoscere gli altri individui, e il comportamento sessuale ^1-3. È essenziale che gli investigatori stabilire se animali da esperimento hanno un senso dell'olfatto funzionamento prima di somministrare test comportamentali che coinvolgono il cibo, interazione sociale, o eventuali odori destinati a provocare una risposta dal mouse. Anosmia o l'incapacità di distinguere tra diversi odori, potrebbe causare falsi positivi o negativi in ​​una vasta gamma di paradigmi comportamentali, quindi la capacità di un mouse per rilevare e distinguere gli odori devono essere stabiliti prima che vengano eseguiti altri tipi di test comportamentali.

Il test assuefazione / Dishabituation olfattivo è stato descritto nel 1980 ^4. Il test è stato adattato per l'uso nei topi da DRS. Mu Yang e Jacqueline Crawley ^5. Questo è un test semplice ed economico che permette al ricercatore di estáblish che un mouse in grado di rilevare e distinguere tra gli odori. Oltre ai test olfattivo, questo test permette al ricercatore di osservare il comportamento generale del mouse e dovrebbe avvenire precocemente in un regime di test. Osservazioni qualitative riguardanti la locomozione del topo, segni di ansia, livello di attività, e la risposta agli odori sociali contro gli odori degli alimenti possono segnalare nuovi settori in cui il test potrebbe essere effettuata.

In questo test, tamponi di cotone immerso in vari odori sono presentati a un mouse per tre volte consecutive. Con ogni presentazione ripetuta di un odore, il mouse abituarsi al tampone di cotone, spendendo meno tempo indagando con ogni presentazione successiva. Quando un nuovo odore è presentata, Dishabituation si verifica, e un tipico mouse trascorrere più tempo indagando il tampone, indicando che può discriminare tra gli odori attuali e precedenti ^5. Questa prova viene somministrato a un topo alla volta e comprende un 45 min accperiodo limation seguita da 45 minuti di prove.

Anche se questo test è di facile esecuzione può essere usato per studiare domande sofisticate sul sistema del mouse olfattivo. Altri test popolari dell'olfatto, come il test di cibo sepolto, semplicemente stabilire la presenza o l'assenza di anosmia. Tuttavia, la discriminazione e assuefazione prova olfattiva permette al ricercatore di determinare che un mouse ha non solo la capacità di rilevare gli odori ma può discriminare tra differenti odori. Il modello di assuefazione e Dishabituation è stato utilizzato per stabilire che i nuovi mutanti possono discriminare tra odori ^6,7. In uno studio sorprendente, Fadool e colleghi hanno usato miscele complesse di odori per dimostrare che i topi con delezione del gene targeting del canale Kv1.3 sono "super smellers" che possono discriminare gli odori molto simili meglio di topi normali ^8.

Nell'esaminare un nuovo modello di topo knockout è utile establish presenza di un comportamento normale per compiti sensoriali di base. Una volta fatto presto in un regime di test, la discriminazione odore e prova assuefazione dà un investigatore la possibilità di osservare eventuali comportamenti insoliti. Queste osservazioni potrebbero prevenire risultati falsi positivi o negativi in ​​prove successive che sono attribuibili a confondere caratteristiche del mutante. Come i ricercatori continuano a studiare il comportamento sociale la necessità di verificare la funzione olfattiva di base diventa sempre più importante. Oltre a esaminare l'olfatto in linee mutanti, questo test può essere utilizzato per affrontare questioni specifiche, come se un trattamento farmacologico specifico aumenta la risposta di un animale a stimoli sociali odore o se i loro aumenti di risposta a tutti gli stimoli odore.

Protocollo

I topi maschi adulti utilizzati per la seguente esperimento sono stati generati e ospitati presso la Baylor University ad una temperatura ambiente di 22 ° C, con una luce 14 ore e 10 ore scuro (20:00-6:00 h) ciclo diurno. I topi sono stati dati ad libitum l'accesso al cibo e all'acqua. Tutte le procedure per i topi erano in conformità con il National Institutes of linee guida sanitarie per la cura e l'uso di animali da laboratorio e il protocollo di origine animale è stato approvato dal Baylor University Animal Care and Use Committee. I topi sono stati testati nella tarda mattinata / primo pomeriggio. Per tutte le procedure sotto l'investigatore deve indossare i guanti per eliminare gli odori e prevenire la contaminazione.

1. Preparazione di odori Non-sociali

1. Preparare gli odori non sociali freschi ogni giorno di test.
   Nota: L'investigatore dovrebbe usare i guanti per preparare gli odori.
   1. Riempire 3 tubi da centrifuga con 10 ml di acqua ciascuno.
   2. Dispensare 100 ml di estratto di banana in un 15 ml & #160; tubo conico e 100 ml di estratto di mandorle in un secondo tubo da 15 ml di una diluizione 1: 100.
      Nota: Il terzo tubo 15 ml contiene solo acqua.

2. Preparazione di odori sociali

1. Preparare gli odori sociali fresche sul avverrà il test mattina. Ottenere odori sociali da due gabbie che non sono stati puliti per almeno tre giorni e contengono numeri uguali di topi. Ottenere odori sociali da topi dello stesso sesso come cavia.
   Nota: questi devono essere conservati a temperatura ambiente e deve essere utilizzato entro 4-6 ore per mantenere l'odore forte e coerente.
   1. Determinare quanti odore sociale tamponi di cotone devono essere creati: ogni topo in fase di test si presenterà con tre tamponi da odori sociali 1, e tre da odori sociali 2.
   2. Preparare gli odori sociali strofinando un tampone di cotone in un zig-zag attraverso il fondo di una gabbia sporca. Scrollarsi di dosso qualsiasi biancheria da letto in eccesso aggrappato alla punta.
   3. Conservare tamponi in grandi vasi di vetro con coperchi o in bicchieri coperto con parafilm. Designare un contenitore per l'odore sociale 1 e un secondo per l'odore sociali 2.
2. Mantenere gabbie fonte dell'odore al di fuori della sala prove sperimentali.

3. acclimatazione del mouse test

1. Indossare guanti e pesare il mouse per essere testato e posizionare singolarmente in una gabbia pulita con un coperchio filo sulla parte superiore e la bottiglia d'acqua rimossa.
2. Lasciare che il mouse si adatti alla nuova gabbia per 45 minuti in una stanza diversa da quella sala prove. Verificare che non vi siano odori insoliti o rumori nella stanza.
3. Come test dura circa 45 minuti, scaglionare i tempi di acclimatazione mettendo il prossimo mouse per essere testato in una gabbia pulita di acclimatare destra prima di testare il mouse corrente.

4. Preparazione della camera Testing

1. Posizionare tamponi freschi di cotone, nastro di laboratorio, le bottiglie contenenti tamponi odore sociali, i tubi di non-sociali odori, una micropipetta, due timer, e una bottiglia di rifiuti con un coperchio in sala prove.
2. Assicurarsi che la sala prove è ragionevolmente privo di odori, rumori forti, e la luce brillante. Non indossare colonia profumate o lozioni.
   Nota: L'osservatore non deve essere gomme da masticare o caramelle durante il periodo di prova e dovrebbe cercare di limitare la loro esposizione a forti alimenti odori.

5. Procedura di test

1. Portare il mouse acclimatati nella sua gabbia nella stanza di prova e posizionare la gabbia sul banco ad una altezza che è comodo per la visualizzazione da seduti.
2. Presentare ogni odore 3 volte di fila per 2 minuti ogni volta. Utilizzare l'ordine di presentazione che si può trovare nella tabella 1.
   1. Pipettare 50 ml di odorizzante nel profumo, da sottoporre alla punta del tampone di cotone e tappare la fonte dell'odore. Sollevare la parte superiore del filo della gabbia e inserire il inodore, fine di legno del tampone nell'apertura bottiglia d'acqua, pushing lunghezza attraverso dalla parte inferiore del filo verso l'alto. Evitare di toccare la punta di cotone per qualsiasi cosa, anche le dita, in modo che la contaminazione odore è evitata.
   2. Continuare a disegnare il tampone attraverso l'apertura della bottiglia di acqua fino a circa 1 pollice di fine cotone pende nella gabbia. Fissare la fine di legno del tampone a lato della gabbia con del nastro laboratorio.
      Nota: Fare attenzione a non lasciare che il coperchio ricadere sulla gabbia, provocando un forte rumore che possa disturbare il mouse test.
   3. Iniziare immediatamente la sincronizzazione per 2 min. Utilizzare uno timer per cronometrare il 2 min presentazione. Registrare il tempo totale trascorso ad annusare l'odore durante il processo 2 min. Contare il comportamento sniffing dell'animale utilizzando un cronometro separato. Sniffing attivo viene definita quando il naso dell'animale è orientata verso la punta di cotone con il suo naso ~ 2 cm più vicino alla punta.
   4. Dopo il completamento di ogni prova, sollevare il coperchio filo e rimuovere il tampone di cotone tirandolo verso il basso attraverso l'ONUderside del coperchio (questo evita la contaminazione odore impedendo la punta di cotone di toccare il filo). Sigillare il tampone utilizzato in bottiglia rifiuti una da 500 ml.
   5. Preparare e inserire il successivo tampone e iniziare il cronometraggio. Lasciare circa 1 minuto tra ogni intervallo inter-trial. Continuare fino a quando ogni profumo è stato presentato per tre volte di fila, per 2 minuti ogni volta.
3. Una volta che il mouse ha completato tutte le prove, svuotare il flacone rifiuti contenenti i tamponi di cotone usati in un cestino al di fuori della sala prove. Ritorna il mouse per sua gabbia casa.

6. Analisi

1. Analizzare i dati per ogni gruppo per condizione odore utilizzando due ANOVA seguito da Newman-Keuls o un test simile post hoc per determinare significativi assuefazione (meno tempo sniffing stessi odori successivi), e dishabitutation (più tempo annusando un odore nuovo).

Risultati

Seguendo il protocollo descritto, i risultati sono stati registrati usando dieci adulti (giorno postnatale 90-120) maschi C57BL / 6J e otto FVB misto sfondo ceppo maschio (giorno postnatale 50-70). Il test è stato effettuato da un singolo operatore su più giorni. Ogni punto sui grafici rappresenta il tempo medio trascorso investigare un odore.

Quando viene introdotto il tampone di cotone imbevuto di acqua, i topi trascorrono gran parte del tempo a studiare questo nuovo oggetto (Fig...

Discussione

I risultati forniti nel presente documento sono ottimali per i topi. I topi dimostrano una forte risposta ad un romanzo odore, quindi abituare rapidamente. Una delle fasi principali di questo metodo è la preparazione degli odori. L'investigatore deve fare molta attenzione per isolare gli odori gli uni dagli altri per evitare contaminazioni. Un altro aspetto fondamentale è la presentazione del tampone di cotone. L'investigatore deve risolvere la migliore posizione della punta di cotone in modo che il mouse può...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse cage	Allentown	Standard mouse cage
Wire lid	Allentown	BCU Mouse WBL 2500
Bedding	Harlan	7090 Sani-Chips
Cotton swabs	VWR	89031-270	6” wooden handle
Banana extract	McCormick
Almond extract	McCormick
Laboratory tape	VWR	89098-062
Stop watch	VWR	62374-000
Nitrile gloves	VWR	82026
Timing device	VWR	61161-350
15 ml conical tubes	VWR	89003-294
2 L beakers	Pyrex	1003
Parafilm	Parafilm	PM-992	4” x 250’
1 L bottle with cap	VWR	89000-240