Testes para Odor Discriminação e habituação em ratos

Resumo

This manuscript describes a protocol to examine the olfactory system of rodents. The olfactory habituation/dishabituation test will allow investigators to determine whether a mouse habituates to a repeatedly presented odor and whether the mouse demonstrates dishabituation when presented a novel odor.

Resumo

This video demonstrates a technique to establish the presence of a normally functioning olfactory system in a mouse. The test helps determine whether the mouse can discriminate between non-social odors and social odors, whether the mouse habituates to a repeatedly presented odor, and whether the mouse demonstrates dishabituation when presented with a novel odor. Since many social behavior tests measure the experimental animal’s response to a familiar or novel mouse, false positives can be avoided by establishing that the animals can detect and discriminate between social odors. There are similar considerations in learning tests such as fear conditioning that use odor to create a novel environment or olfactory cues as an associative stimulus. Deficits in the olfactory system would impair the ability to distinguish between contexts and to form an association with an olfactory cue during fear conditioning.

In the odor habitation/dishabituation test, the mouse is repeatedly presented with several odors. Each odor is presented three times for two minutes. The investigator records the sniffing time directed towards the odor as the measurement of olfactory responsiveness. A typical mouse shows a decrease in response to the odor over repeated presentations (habituation). The experimenter then presents a novel odor that elicits increased sniffing towards the new odor (dishabituation). After repeated presentation of the novel odor the animal again shows habituation. This protocol involves the presentation of water, two or more non-social odors, and two social odors. In addition to reducing experimental confounds, this test can provide information on the function of the olfactory systems of new knockout, knock-in, and conditional knockout mouse lines.

Introdução

Ratos são dependentes olfato para navegar novos ambientes, encontrar comida, para o reconhecimento de outras pessoas, e comportamento sexual ^1-3. É essencial que os investigadores determinar se ou não os animais experimentais têm um sentido de cheiro funcionamento antes de administrar testes comportamentais que envolvem a comida, a interacção social, ou quaisquer odores destinados a induzir uma resposta a partir do ratinho. A anosmia ou a incapacidade de distinguir entre diferentes odores, poderia resultar em falsos positivos ou negativos em uma ampla variedade de paradigmas de comportamento, de modo a capacidade de um rato para detectar e distinguir os odores deve ser estabelecida antes de outros tipos de testes comportamentais são efectuadas.

O teste de habituação / dishabituation olfativo foi descrita pela primeira vez na década de 1980 ^4. O ensaio foi adaptado para utilização em ratinhos pelos Drs. Mu Yang e Jacqueline Crawley ^5. Este é um teste simples e barato, que permite ao investigador ESTABlish que um rato pode detectar e diferenciar entre odores. Além de testar olfacto, este teste permite ao investigador observar o comportamento geral do rato e deve ser feita no início de um regime de testes. Observações qualitativas sobre a locomoção do rato, sinais de ansiedade, nível de atividade, e resposta a odores sociais contra os odores dos alimentos pode sinalizar novas áreas em que os testes poderiam ser realizados.

Neste teste, compressas de algodão embebido em vários odores são apresentados a um mouse três vezes em uma fileira. Com cada apresentação repetida de um odor, o rato vai habituar ao cotonete, gastando menos tempo investigando-o com cada apresentação subsequente. Quando um novo odor é apresentado, dishabituation ocorre, e um mouse típico vai gastar mais tempo a investigar o cotonete, indicando que ele pode discriminar entre os actuais e anteriores odores ^5. Este teste é administrado a um rato de cada vez e inclui um 45 min acclimation período seguido de 45 minutos de teste.

Embora este teste é fácil de transportar para fora, pode ser utilizado para investigar perguntas sofisticadas sobre o sistema olfactivo do rato. Outros testes populares de olfacto, tais como o teste de alimentos enterrado, simplesmente determinar a presença ou ausência de anosmia. No entanto, o teste de discriminação e habituação olfactiva permite ao investigador para determinar que um mouse não só tem a capacidade de detectar odores, mas pode discriminar entre diferentes odores. O padrão de habituação e dishabituation foi usado para estabelecer novos mutantes que podem discriminar entre os odores ^6,7. Em um estudo surpreendente, Fadool e seus colegas usaram misturas complexas de odores para mostrar que os ratos com supressão segmentadas gene do canal Kv1.3 são "super smellers" que podem discriminar odores muito similares melhor do que ratos normais ^8.

Ao examinar um novo modelo de nocaute do mouse é útil Establish na presença de um comportamento normal para tarefas sensoriais básicos. Quando feito no início de um regime de testes, a discriminação odor e teste de habituação dá um investigador a oportunidade de observar quaisquer comportamentos incomuns. Estas observações podem evitar resultados falsos positivos ou negativos em testes posteriores que são atribuíveis ao confundindo características do mutante. Como os investigadores continuam a investigar o comportamento social a necessidade de verificar a função olfativa básico torna-se cada vez mais importante. Além de examinar o olfato em linhas mutantes, este teste pode ser usado para tratar de questões específicas, como se um tratamento farmacológico aumenta especificamente a resposta de um animal a estímulos odor sociais ou se os seus aumentos de resposta a todos os estímulos odor.

Protocolo

Os ratos machos adultos utilizados na experiência seguinte foram gerados e alojado na Universidade de Baylor a uma temperatura ambiente de 22 ° C, com uma luz de 14 h e 10 h escuro (20:00-06:00 h) ciclo diurno. Os ratos tiveram acesso ad libitum a comida e água. Todos os procedimentos para os ratos estavam em conformidade com os Institutos Nacionais de Saúde Diretrizes para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório eo protocolo animal foi aprovado pela Universidade de Baylor Animal Care e do Comitê Use. Os ratinhos foram testados no final da manhã / tarde. Para todos os procedimentos abaixo o pesquisador deve usar luvas para eliminar odores e evitar a contaminação.

1. Preparação de Odores não-sociais

1. Prepare odores não sociais frescos cada dia de testes.
   Nota: O investigador deve usar luvas para preparar os odores.
   1. Encha três tubos de centrífuga com 10 ml de água cada.
   2. Pipetar 100 mL de extrato de banana em um 15 ml & #160; tubo cónico e 100 ul de extracto de amêndoa para um segundo tubo de 15 ml de uma diluição de 1: 100.
      Nota: O terceiro tubo de 15 ml conterá somente água.

2. Preparação de Odores Sociais

1. Prepare odores sociais frescos na manhã de testes irá ocorrer. Obter odores sociais de duas gaiolas que não tenham sido limpos durante pelo menos três dias, e contêm um número igual de ratinhos. Obter odores sociais de ratos do mesmo sexo como o sujeito de teste.
   Nota: Estes estão a ser armazenados a temperatura ambiente e deve ser usada dentro de 4-6 horas para manter o odor forte e consistente.
   1. Determine quantas odor sociais cotonetes precisam ser criados: cada rato que está sendo testado será apresentado com três swabs de odor Social 1, e três de odor sociais 2.
   2. Prepare odores sociais limpando um cotonete de uma forma em zigue-zague através da parte inferior de uma gaiola suja. Sacudir qualquer excesso cama agarrado à ponta.
   3. Loja swabs em grandes frascos de vidro com tampas ou em copos cobertos com parafilme. Designar um recipiente para um odor sociais e um segundo para o odor sociais 2.
2. Manter gaiolas de origem odor fora da sala de ensaio experimental.

3. A aclimatação do mouse Teste

1. Calçar luvas e pesar o mouse para ser testado e coloque individualmente em uma gaiola limpa com uma tampa de arame em cima e garrafa de água removida.
2. Permitir que o mouse para se aclimatar à nova gaiola por 45 min em uma sala diferente de sala de ensaios. Certifique-se de que não existem odores ou ruídos no quarto.
3. Como teste leva cerca de 45 min, escalonar os tempos de aclimatação, colocando a próxima mouse para ser testado em uma gaiola limpa para se aclimatar à direita antes de testar o mouse atual.

4. Preparação da sala de teste

1. Coloque compressas de algodão frescos, fita de laboratório, os frascos contendo swabs odor sociais, os tubos de nsobre-sociais odores, uma micropipeta, dois temporizadores, e um frasco de resíduos com uma tampa na sala de testes.
2. Certifique-se de que a sala de ensaios é razoavelmente livre de odores, ruídos altos e luz brilhante. Não use perfumes ou loções perfumadas.
   Nota: O observador não deve ser mascar chicletes ou balas durante o período de testes e deve tentar limitar a sua exposição a fortes alimentos de odor.

5. Procedimento de Teste

1. Traga o mouse aclimatados em sua gaiola na sala de ensaio e colocar a gaiola em cima do balcão, a uma altura que seja confortável para visualização enquanto estiver sentado.
2. Apresente cada odor 3 vezes em uma fila para 2 min cada vez. Utilizar a ordem de apresentação que pode ser encontrada na Tabela 1.
   1. Pipetar 50 ul de odorante no perfume a ser testado para a ponta da mecha de algodão e volte a fechar a fonte de odor. Levante a parte superior da gaiola de arame e insira a extremidade sem cheiro, de madeira do swab na abertura da garrafa de água, empurrandog o comprimento através do lado de baixo do fio para o topo. Evite tocar a ponta de algodão para nada, incluindo dedos, de modo que a contaminação odor é evitado.
   2. Continue a puxar o cotonete com a abertura da garrafa de água até cerca de 1 polegada do fim algodão trava para baixo na gaiola. Apor o fim da haste de madeira para o lado da gaiola usando fita laboratório.
      Nota: Tenha cuidado para não deixar a tampa cair de volta para a jaula, fazendo um ruído alto que iria perturbar o mouse teste.
   3. Começar imediatamente temporização para 2 min. Use um temporizador para cronometrar o 2 min de apresentação. Grave o tempo acumulado gasto cheirando o odor durante 2 min julgamento. Contagem comportamento sniffing do animal usando um cronômetro separado. Sniffing ativo é definido quando o nariz do animal é orientada para a ponta de algodão com seu nariz ~ 2 centímetros ou mais perto da ponta.
   4. Após a conclusão de cada julgamento, levantar a tampa do fio e retire o cotonete, puxando-a para baixo através da ONUderside da tampa (o que evita a contaminação de odores, impedindo que a ponta de algodão de tocar o fio). Selar o swab usado em uma garrafa de 500 ml de resíduos.
   5. Preparar e inserir o próximo swab e começar a cronometragem. Permitir que cerca de 1 min entre cada intervalo inter-julgamento. Continue até que cada perfume tem sido apresentado três vezes seguidas, durante 2 minutos de cada vez.
3. Uma vez que o rato tenha completado todos os ensaios, esvaziar o frasco de resíduos contendo as cotonetes utilizadas em uma lata de lixo do lado de fora da sala de teste. Devolver o mouse para sua gaiola.

6. Análise

1. Analisar os dados para cada grupo por condição odor usando ANOVA two-way seguido por Newman-Keuls ou um teste similar post hoc para determinar habituação significativa (menos tempo farejando sucessivas mesmos cheiros), e dishabitutation (mais tempo farejando um novo cheiro).

Resultados

Seguindo o protocolo descrito, os resultados foram registados utilizando dez adultos (dia pós-natal 90-120) ratos machos C57BL / 6J e oito macho estirpe FVB mista-fundo (dia pós-natal 50-70). O teste foi realizado por um único investigador ao longo de vários dias. Cada ponto nos gráficos representa a média de tempo gasto a investigar um odor.

Quando o cotonete embebido em água é introduzido pela primeira vez, os ratos gastar uma grande quantidade de tempo a investigar este romance ob...

Discussão

Os resultados apresentados neste artigo são ideais para camundongos. Os ratinhos demonstram uma forte resposta a um odor de novo, em seguida, rapidamente habituar. Um dos passos chave no presente método é a preparação dos odores. O investigador deve tomar muito cuidado para isolar os odores um do outro para evitar a contaminação. Outro aspecto importante é a apresentação do cotonete. O investigador precisa solucionar a melhor localização da ponta de algodão para que o rato pode investigar a ponta, mas não ...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
Mouse cage	Allentown	Standard mouse cage
Wire lid	Allentown	BCU Mouse WBL 2500
Bedding	Harlan	7090 Sani-Chips
Cotton swabs	VWR	89031-270	6” wooden handle
Banana extract	McCormick
Almond extract	McCormick
Laboratory tape	VWR	89098-062
Stop watch	VWR	62374-000
Nitrile gloves	VWR	82026
Timing device	VWR	61161-350
15 ml conical tubes	VWR	89003-294
2 L beakers	Pyrex	1003
Parafilm	Parafilm	PM-992	4” x 250’
1 L bottle with cap	VWR	89000-240