JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Abstract

مرحلة التطور الجنيني المبكر بدءا من البيضة الملقحة خلية واحدة يمر انقسام الخلايا السريع والتشكل، ويتميز شكليا لما قبل كروي، كروي، والقلب، ونسف فلقة مراحل. هذا التطور التدريجي تحت تنظيم محكم من شبكة الجزيئية المعقدة. حصاد الأجنة المبكرة كافية في مرحلة مماثلة من التنمية ضروري لتحقيق التنظيم الخلوي والجزيئي للمرحلة التطور الجنيني المبكر. هذه ليست واضحة منذ مرحلة التطور الجنيني المبكر يخضع التشكل السريع في فترة قصيرة على سبيل المثال 8 أيام لMedicago truncatula للوصول إلى مرحلة فلقة في وقت مبكر. هنا، نعالج هذه القضية من خلال النهجين. أول واحد بتأسيس الربط بين تطور الجنين وجراب التشكل في مساعدة تشير إلى مرحلة من مراحل الجنين اقحي. ويستند هذا بشكل خاص على عدد من اللوالب جراب والتنمية في العمود الفقري. وسيلة بديلة لتكمل في الجسم الحي الصورةtudies هو عن طريق إإكسبلنتس أوراق زراعة لإنتاج الأجنة الجسمية. يتضمن المتوسطة تركيبة هرمون غير عادي - وأوكسين (حمض 1-naphthaleneacetic)، وهو سيتوكينين (6 benzylaminopurine)، حمض التسقيط وحمض الجبريليك. مراحل مختلفة يمكن تمييزها المتزايد من الكالس دون تشريح.

Introduction

البقول هي ثالث أكبر عائلة من النباتات العليا مع ما يقرب من 20000 الأنواع والفيصلة القرنية (أو الفصيلة البقولية) الأسرة هي الثانية للحبوب في المساحة المحصودة والإنتاج الإجمالي 1. فول الصويا هو ثالث أكبر المحاصيل المزروعة. توفر البقوليات حوالي ثلث البروتين وثلث من الزيت النباتي للاستهلاك البشري 2. البقوليات مع قدرتها تحديد N 2 تسهم أيضا في النظم الزراعية المستدامة. Medicago truncatula، مثل فول الصويا، ومخازن البروتين والزيت في النبتات من البذور والبقوليات هو نموذج الوراثي والجيني مع الموارد الوراثية والجينوم كبيرة 3،4. في حين M. وقد مكن truncatula التقدم في فهم-البقوليات البكتريا العصوية تكافل 4 فقد استخدمت على نحو متزايد لدراسة البيولوجيا بذور البقول 5-7 والتخلق 8،9. تم نبات الأرابيدوبسيس مرحلة التطور الجنيني درس على نطاق واسع 10،11 كنها طسا غير البقوليات وتفاصيل مرحلة التطور الجنيني ليست متطابقة إلى Medicago 8،10. التطور الجنيني اقحي في M. truncatula ديها ميزات مثيرة للاهتمام، مع الغدة النخامية متعددة الخلايا المميزة، وهي suspensor endoployploid ونقل الخلية القاعدية 8.

يستخدم مرحلة التطور الجنيني الجسدية (SE) عادة لتجديد النباتات 12. في نموذج البقوليات M. truncatula، خط البذور Jemalong 2HA (2HA) تم تطويره من الوالد Jemalong أن يكون ارتفاع معدلات التطور الجنيني الجسدية 13. وقد تم مؤخرا زيادة عدد الأجنة المنتجة بشكل جوهري بإضافة كل من حمض الجبريليك (GA) وحمض التسقيط (ABA) إلى متوسطة عريقة 14. في هذه الحالة GA والعمل ABA تآزر، وهو أمر غير معتاد نظرا لأن GA وABA عادة ما تتصرف بعدوانية 14. الأجنة المنتجة من الكالس تتطور على السطح الذي يسمح مرحلة التطور الجنيني يتم تحديدها بسهولة بصرياذ وتحصد بسهولة. وجود بالقرب من خطوط إسوي التي تخلقي (2HA) وغير تخلقي (Jemalong) يسهل التحقيق في مرحلة التطور الجنيني الجسدية وجود كل المجراة في أنظمة المختبر يوفر إمكانيات التجريبية المختلفة.

فهم الآليات الخلوية والجزيئية لتطور الجنين هو ضروري لبذور التفاهم وتطوير المصنع. في البقوليات، كما هو الحال في الفلقتين أخرى، فمن النبتات من الجنين الذي تخزين المنتجات التي تستخدم لتغذية الإنسان. مرحلة التطور الجنيني المبكر ينطوي على انقسام الخلايا السريع والصحيح الجنين الزخرفة. في بعد حوالي 8 أيام الإخصاب، M. truncatula الجنين تصل إلى مراحل فلقة في وقت مبكر. لا يتم الإشارة إلى الخصائص المورفولوجية بالضبط قبل أيام بعد الإخصاب في ظروف البيوت الزجاجية. وهكذا، وهو نهج موحد فعال للإشارة إلى مرحلة الأجنة النامية قيمة في دراسة regul الجينيأوجه من أوائل مرحلة التطور الجنيني اقحي.

في هذه الورقة، ونحن نقدم اثنين من بروتوكولات موحدة لجمع الأجنة النامية للدراسات البيولوجية للمرحلة التطور الجنيني في نموذج البقول M. truncatula. أول واحد هو جمع الأجنة اقحي من خلال ربط التطور الجنيني وجراب التشكل في حين أن الثانية هي مرحلة التطور الجنيني الجسدية عبر إإكسبلنتس أوراق زراعة لتوفير أعداد كبيرة الجنين الوصول إليها بسهولة.

Protocol

1. اقحي تطور الجنين

  1. المواد النباتية
    1. زراعة Medicago truncatula النوع البري Jemalong أو إسوي القريب لها، وإعادة التركيب الوراثي للغاية generable Jemalong 2HA 13 (المعروف باسم 2HA) في البيوت الزجاجية مع الضوئية 14 ساعة و 23 ° C / 19 ° C درجة الحرارة اليوم / ليلة.
      1. بيرس سطح غلاف البذرة (مع وجود 23 G إبرة) قبل بذر البذور بحيث يتم السماح للمياه لدخول البذور ونقع في الماء طوال الليل. إضافة كمية كافية من الماء لتغطية كامل البذور.
      2. زرع بذور 3 في كل 15 سم وعاء القطر (ما مجموعه 10 قدور) في خليط بوتينغ (الخشنة الرمل، البيرلايت، جوز الهند الجفت (1: 1: 1)، بالإضافة إلى 5 غرام من Osmocote قياسي بالضبط: بطيئة الافراج الأسمدة) ونقل إلى البيوت الزجاجية. الإبقاء على أصح الشتلات بعد الإنبات حتى لا يكون هناك 1 مصنع في وعاء وتحيط بها تعريشة لمصنع ينبع في الصعود.
  2. حاضن الحصاد
    1. جمع القرون من ثنوع ILD Jemalong أو 2HA للحصول على مراحل الجنين في وقت مبكر المناسبة كما وصفت لأول مرة 9.
      ملاحظة: يتم عرض المراحل جراب مختلفة في الشكل 1 وتظهر مراحل الجنين المقابلة في الشكل 2.
    2. تحقق المراحل جراب مختلفة عند الحصاد باستخدام معايير حسب الجدول 1. قياس الوقت المنقضي من مرحلة 6 للمساعدة في مراحل منفصلة 6 و 7 (الجدول 2).
  3. تشريح البويضات من القرون والتحقق من مرحلة الجنين
    1. عزل البويضات من القرون باستخدام ملقط غرامة حدها أو مجهر تشريح ستيريو وملقط حسب الضرورة. إذا لزم الأمر في مرحلة الجنين يمكن التحقق بسرعة باستخدام مركب المجهر القياسي (الشكل 3B).
    2. استعد المعدلة حل هوير التي تحتوي على 7.5 غرام الصمغ العربي، و 100 غرام الكلورال هيدرات، 5 مل الجلسرين، 60 مل منزوع الأيونات الماء المقطر. حل عن طريق التحريك لمدة 3-5 ساعة أو طوال الليل.
    3. لمزيد من صقلد المجهر مسح البويضات تشريح في حل 15،16 تعديل هوير و. اختيار بعناية حتى البويضات سليمة والمكان في حجم صغير من حل هوير و(ما يكفي لتغطية بويضة) في درجة حرارة الغرفة حتى واضح.
    4. عرض العينات مع تدخل الفرق النقيض (DIC) البصريات. التقاط الصور يؤته على كاميرا رقمية 9 (الشكل 2).
    5. الحصول على البويضات الأكثر موحدة من المنطقة الوسطى من جراب وتتراكم العدد المطلوب. يتم عرض مثال في الشكل 3A. جمع البويضات على الجليد وتخزينها في درجة الحرارة المطلوبة (الأحماض -80 درجة مئوية لمدة النووية) لمزيد من التحليل.
      ملاحظة: لمزيد من التفاصيل على تحليل المقاطع النسيجية، انتقال المجهر الإلكتروني، والتهجين في الموقع يرجى الاطلاع على الأوراق 8،9.

2. الجسدية تطور الجنين في المختبر

  1. استخدام M. truncatula الصنف رقبعة قادرة على تشكيل بسهولة الأجنة في الثقافة. لهذا البروتوكول لإإكسبلنتس ورقة استخدام النباتات 2HA 13،17 تكون 2-4 أشهر من العمر.
  2. اتخاذ منشورات من أحدث ورقة ثلاثية الأوراق تقريبا توسعت بشكل كامل من جذع التطويل.
  3. الحفاظ على أوراق ثلاثية الأوراق على رطبة ورقة المناشف في وعاء الثقافة لتجنب الجفاف.
    ملاحظة: مرة واحدة ويتم حصاد الأوراق ثلاثية الأوراق التي يحتاجونها لاستخدامها بأقل قدر من التأخير.
  4. إعداد مستنبت
    1. استخدام P4 10: المتوسط ​​5 في أجار (0.8٪ ث:: V) 4: 1 في 9 سم أطباق بتري.
      ملاحظة: P4 10: 4: 5: 1 المتوسطة يتكون من المتوسط ​​P4 القاعدية 18 بالإضافة إلى 10 ميكرومتر حمض 1-naphthaleneacetic (NAA)، 4 ميكرومتر 6-benzylaminopurine (BAP)، 1 ميكرومتر حمض التسقيط (ABA) و 5 ميكرومتر الجبرليك حمض (GA). استخدام GA + ABA يسرع تشكيل الجنين ويسبب زيادات حقيقية في الجنين الرقم 14.
    2. تشكل المتوسطة القاعدية P4 في 1 L؛ تتكون من أملاح الكبرى (جعل calciuم بشكل منفصل)، وأملاح بسيطة والفيتامينات (الجدول 3)، والحديد بالكلاب (الماكياج بشكل منفصل)، casamino الأحماض (الكازين حلامة)، 30 غرام السكروز، 8 غ أجار.
    3. حلول تخزين المخزون من أملاح الكبرى والكالسيوم والأحماض casamino والأملاح والفيتامينات طفيفة في -20 درجة مئوية في قسامات مناسبة. تخزين الحديد بالكلاب في 4 ° C.
    4. تشكل الحديد بالكلاب (200X) عن طريق إذابة 7.44 غرام من نا 2 EDTA • 2H 2 O في حوالي 900 مل من الماء المقطر منزوع الأيونات مع التحريك، ثم جعل الحل ل98-99 ° C مع إضافة 1.853 غرام من FeSO 4 • 7H 2 O. أخيرا جعل ما يصل الى 1 L عندما تذوب المكونات. متجر في العنبر زجاجات في 4 درجات مئوية الملونة.
    5. تشكل بصل متوسطة P4 مع حلول الأوراق المالية كما في الجدول رقم (4). والهرمونات في المتوسط ​​هي 10 ميكرومتر NAA، 4 ميكرومتر BAP، 1 ميكرومتر ABA، 5 ميكرومتر GA (انظر الجدول 4 ومواد محددة الجدول). إضافة NAAوBAP قبل التعقيم وإضافة ABA وGA بعد التعقيم والتبريد إلى حوالي 55 درجة مئوية، وذلك باستخدام التعقيم مرشح مع مرشح 0.22 ميكرون تعلق على حقنة. مزيج جيد من قبل يحوم طيف.
    6. ضبط وسائل الإعلام لدرجة الحموضة 5.8 مع 1 M KOH قبل التعقيم. الأوتوكلاف على درجة حرارة 121 مئوية لمدة 20 دقيقة.
    7. بعد التعقيم إضافة عامل تصفية تعقيمها ABA وGA، وتصب حوالي 25 مل من وسائل الاعلام الى معقمة 9 سم أطباق بتري في غطاء تدفق الصفحي أو مجلس الوزراء واقية. بارد، والسماح للأجار مع مجموعة الغطاء. ثم وضعت على غطاء والتأكد من عدم وجود المكثفات على الغطاء. التسمية كما هو مطلوب وتخزينها في 4 ° C (في صندوق من الورق المقوى لمنع غطاء المكثفات).
  5. تعقيم ورقة الأنسجة
    1. العمل في غطاء تدفق الصفحي تعقيم الأشعة فوق البنفسجية أو مجلس الوزراء واقية.
    2. مكان يترك في الكرة شبكة من الشاي المساعد على التحلل الربيع تعقيمها قبل.
    3. تزج المساعد على التحلل الشاي تحتوي على أوراق في 70٪ (ت: ت) الايثانول في طريق مسدودوعاء البنية لمدة 30 ثانية.
      ملاحظة: للاستخدام في جميع الخطوات في هذا الإجراء 250 مل المسمار غطاء الأواني الثقافة البولي التي يتم تعقيمها.
    4. استنزاف ومن ثم نقل وتزج الأنسجة ورقة في 1: 8 (ت: ت) التبييض المخفف (0.5٪ الكلور) لمدة 10 دقيقة. دوامة بلطف من وقت لآخر.
    5. استنزاف التبييض ونقل المساعد على التحلل الشاي في وعاء الثقافة التي تحتوي على الماء المقطر منزوع الأيونات معقمة. دوامة بلطف واستنزاف المياه الزائدة. كرر واحدة لمزيد من الوقت مع وعاء ثقافة جديدة من الماء المقطر منزوع الأيونات معقمة.
    6. إزالة الأوراق من الشاي المساعد على التحلل مع ملقط معقم لوعاء ثقافة جديدة من الماء المقطر منزوع الأيونات معقمة. المسمار على الغطاء العقيمة وشطف التي كتبها قلب ويحوم. ترك الأوراق تطفو على الماء المعقم حتى على استعداد لإعداد إإكسبلنتس.
  6. إعداد وتصفيح إإكسبلنتس
    1. باستخدام تقنيات معقمة، وتقليم منشورات تعقيم الفردية من الحافة مع مشرط، وقطع مستطيل المتبقية إلى اثنين أو عبتيه ه إإكسبلنتس مستطيلة الشكل (10/8 س 3-5 ملم) مع منتصف الوريد في وسط كل يزدرع (الشكل 5A).
      ملاحظة: حجم يزدرع مهم جدا في بدء callusing الأول. تنفيذ قطع على الجفن المعقمة من حاويات المواد الغذائية لاتولى.
    2. لوحة 6 إإكسبلنتس على توطد أجار مستنبت في 9 سم القطر أطباق بتري (الشكل 5B). لوحة لل explants الجانب مجافي المحور وصولا الى الحفاظ على التوجه أوراق المعتاد.
    3. ختم أطباق بتري مع parafilm (الشكل 5C) امتدت حول الطبق. النسيج هي الآن جاهزة للحضانة.
  7. الأنسجة الحضانة
    1. احتضان لوحات في الظلام عند 28 درجة مئوية في درجة حرارة الغرفة التي تسيطر عليها الحكومة أو النمو طوال الفترة الثقافة.
      ملاحظة: سيتم إإكسبلنتس بدء فقد التمايز، الخضوع لانقسام الخلايا وانتشارها (تكوين الكالس) ومرحلة التطور الجنيني (التمايز).
    2. ثقافة فرعية في expla التفريقاليلة بعد 3 أسابيع إلى متوسطة جديدة. في هذه ثقافة فرعية نقل يزدرع كله باستخدام معقم غير القابل للصدأ ملعقة الصلب وملقط، في غطاء تدفق الصفحي أو مجلس الوزراء واقية. كما يحدث callusing والكالس يتجاوز حجم أكبر واحد في الشكل 5C، ونقل 50٪ من الكالس الفردية عندما subculturing إلى متوسطة جديدة.
    3. مراقبة الأجنة الأولى في حوالي 4 أسابيع. في حين أن هناك درجة من التزامن، وجمع مراحل الجنين المختلفة على مدى فترة حضانة 4-8 أسبوع (الشكل 6A، B). جمع تحت المجهر تشريح وعملية وفقا لأهداف تجريبية.
    4. ثقافة فرعية كل 3 أسابيع وإزالة الأجنة بشكل دوري بحيث إإكسبلنتس سوف تستمر في إنتاج الأجنة لمدة 3 أشهر.

النتائج

وتظهر لمرحلة التطور الجنيني مختلف الهياكل جراب اقحي المقابلة لمراحل الجنين المختلفة في الشكل 1A - F بينما أظهرت مراحل الجنين المختلفة في الشكل 2A - F. عن طريق اختيار القرون في نفس المرحلة، وعينات من البويضات التي هي موحدة تماما ويمكن ...

Discussion

والبروتوكولات المذكورة هي نسبيا على التوالي إلى الأمام وتسمح بالتحقيق في مرحلة التطور الجنيني البقول مع كل خلية المعاصرة والتقنيات الجزيئية. نحن ندرك أن هناك مزايا وعيوب كل من المجراة في النهج المختبر. كلا السماح للمزيد من التركيز على مرحلة التطور الجنيني...

Disclosures

The authors declare that they have no competing interests.

Acknowledgements

This research was supported by the Australian Research Council grant CEO348212 and the University of Newcastle. The assistance of Dr. Sam Zhang is acknowledged.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
P4 mediumSigma-AldrichUse Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier
Major salts
Minor salts
Vitamins
AgarBacto Laboratories214010Bacto agar
Plant hormones
1-Naphthaleneacetic acidSigma-AldrichN0640Dissolve in small amount of 1 M NaOH
Abscisic acidSigma-AldrichA1049Dissolve in small amount of 1 M NaOH
6-BenzylaminopurineSigma-AldrichB3274Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl
Gibberellic AcidSigma-AldrichG7645Dissolve in small amount of ethanol
Equipment
Stereo dissecting microscopeLeicaMZFLIIIOr similar
Light microscopeZeissAxiophotOr similar, with suitable optics
Digital cameraZeissAxioCam HRcOr similar
Sterilising leaves
250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lidSARSTEDT75.9922.519Autoclavable

References

  1. Gepts, P., et al. Legumes as a model plant family. Genomics for food and feed report of the cross-legume advances through genomics conference. Plant Physiol. 137 (4), 1228-1235 (2005).
  2. Graham, P. H., Vance, C. P. Legumes: importance and constraints to greater use. Plant Physiol. 131 (3), 872-877 (2003).
  3. Young, N. D., Udvardi, M. Translating Medicago truncatula genomics to crop legumes. Curr. Opin. Plant Biol. 12 (2), 193-201 (2009).
  4. Young, N. D., et al. The Medicago genome provides insights into the evolution of rhizobial symbioses. Nature. 480 (7378), 520-524 (2011).
  5. Gallardo, K., Le Signor, C., Vandekerckhove, J., Thompson, R. D., Burstin, J. Proteomics of Medicago truncatula seed development establishes the time frame of diverse metabolic processes related to reserve accumulation. Plant Physiol. 133 (2), 664-682 (2003).
  6. Verdier, J., et al. Gene expression profiling of M. truncatula transcription factors identifies putative regulators of grain legume seed filling. Plant Mol. Biol. 67 (6), 567-580 (2008).
  7. Thompson, R., Burstin, J., Gallardo, K. Post-genomic studies of developmental processes in legume seeds. Plant Physiol. 151 (3), 1023-1029 (2009).
  8. Wang, X. -. D., Song, Y., Sheahan, M. B., Garg, M. L., Rose, R. J. From embryo sac to oil and protein bodies: embryo development in the model legume Medicago truncatula. New Phytol. 193 (2), 327-338 (2012).
  9. Kurdyukov, S., Song, Y., Sheahan, M. B., Rose, R. J. Transcriptional regulation of early embryo development in the model legume Medicago truncatula. Plant Cell Rep. 33 (2), 349-362 (2014).
  10. Mansfield, S. G., Briarty, L. G. Early embryogenesis in Arabidopsis thaliana. 2. The developing embryo. Can. J. Botany. 69 (3), 461-476 (1991).
  11. Seefried, W. F., Willman, M. R., Clausen, R. L., Jenik, P. D. Global regulation of embryonic patterning in Arabidopsis by microRNAs. Plant Physiol. 165 (2), 670-687 (2014).
  12. Birnbaum, K. D., Sánchez Alvarado, A. Slicing across kingdoms: regeneration in plants and animals. Cell. 132 (4), 697-710 (2008).
  13. Rose, R. J., Nolan, K. E., Bicego, L. The development of the highly regenerable seed line Jemalong 2HA for transformation of Medicagotruncatula - implications for regenerability via somatic embryogenesis. J. Plant Physiol. 155 (6), 788-791 (1999).
  14. Nolan, K. E., Song, Y., Liao, S., Saeed, N., Zhang, X., Rose, R. J. An unusual ABA and GA synergism increases somatic embryogenesis, facilitates its genetic analysis and improves transformation in Medicago truncatula. PloS ONE. 9 (6), e99908 (2014).
  15. Liu, C. M., Meinke, D. W. The titan mutants of Arabidopsis are disrupted in mitosis and cell cycle control during seed development. Plant J. 16 (1), 21-31 (1998).
  16. Nolan, K. E., Kurdyukov, S., Rose, R. J. Expression of the SOMATIC EMBRYOGENESIS RECEPTOR-LIKE KINASE 1 (SERK1) gene is associated with developmental change in the life cycle of the model legume Medicago truncatula. J. Exp. Bot. 60 (6), 1759-1771 (2009).
  17. Iantcheva, A., Vlahova, M., Atanassov, A., Mathesius, U., et al. Somatic embryogenesis from leaf explants. The Medicago truncatula handbook. , (2006).
  18. Thomas, M. R., Johnson, L. B., White, F. F. Selection of interspecific somatic hybrids of Medicago by using Agrobacterium transformed tissues. Plant Sci. 69 (2), 189-198 (1990).
  19. Ochatt, S. J., Thorpe, T. A., Yeung, E. C. Immature seeds and embryos of Medicago truncatula cultured in vitro. Plant Embryo Culture: Methodsand Protocols, Methods in Molecular Biology. 710, 39-52 (2011).
  20. Mantiri, F. R., Kurdyukov, S., Lohar, D. P., Sharopova, N., Saeed, N. A., Wang, X. D., VandenBosch, K. A., Rose, R. J. The transcription factor MtSERF1 of the ERF subfamily identified by transcriptional profiling is required for somatic embryogenesis induced by auxin plus cytokinin in Medicago truncatula. Plant Physiol. 146 (4), 1622-1636 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

100 Medicago truncatula

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved