Protocoles pour l&#39;obtention Zygotic et embryons somatiques pour l&#39;étude de la réglementation de développement précoce de l&#39;embryon dans la légumineuse modèle<em&gt; Medicago truncatula</em

Résumé

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Résumé

Embryogenèse précoce partir d'un seul zygote cellulaire passe par division cellulaire rapide et de la morphogenèse, et est morphologiquement caractérisée par étapes de pré-globulaire, globulaires, cardiaques, lance-torpilles et cotylédons. Ce développement progressif est sous la stricte réglementation d'un réseau moléculaire complexe. La récolte des embryons précoces suffisantes à un stade de développement similaire est indispensable pour étudier la régulation cellulaire et moléculaire de l'embryogenèse précoce. Cela ne veut pas simple puisque l'embryogenèse précoce subit morphogenèse rapide dans un temps court, par exemple 8 jours pour Medicago truncatula pour atteindre le stade cotylédons tôt. Ici, nous abordons la question par deux approches. Le premier établit un lien entre le développement de l'embryon et pod morphologie en aidant indiquer le stade de l'embryon zygotique. Ceci est en particulier basée sur le nombre de spires et le développement des épines pod. Une autre manière de compléter in vivo ses études est via explants culture de feuilles pour produire des embryons somatiques. Le milieu comprend une combinaison d'hormones inhabituelle - une auxine (acide 1-naphtalène), une cytokinine (6-benzylaminopurine), l'acide abscissique et l'acide gibbérellique. Les différentes étapes peuvent être discernées plus en plus hors du cal sans dissection.

Introduction

Les légumineuses sont la troisième plus grande famille de plantes supérieures avec environ 20.000 espèces et des légumineuses (ou fabacées) de la famille sont en second lieu à céréales de la superficie récoltée et la production totale ^1. Le soja est la troisième plus grande plante cultivée. Les légumineuses à grains fournissent environ un tiers des protéines alimentaires, et un tiers d'huile végétale pour la consommation humaine ^2. Légumineuses avec leur capacité de fixation de N ₂ contribuent également à des systèmes agricoles durables. Medicago truncatula, comme le soja, les magasins protéines et d'huile dans les cotylédons de ses graines et est un modèle de légumineuses génétique et génomique des ressources génétiques et génomiques considérables ^3,4. Alors que M. truncatula a permis des avancées dans la compréhension de la symbiose Rhizobium-légumineuses ⁴ il a été de plus en plus utilisé pour étudier la biologie des semences de légumineuses ^5-7 et de l'embryogenèse ^8,9. Arabidopsis embryogenèse a été largement étudiée ^10,11 mais il isa non-légumineuses et les détails de l'embryogenèse ne sont pas identiques à Medicago ^8,10. Embryogenèse zygotique dans M. truncatula a des caractéristiques intéressantes, avec un hypophyse multicellulaire distinctif, un suspenseur endoployploid et la cellule de transfert de base ^8.

L'embryogenèse somatique (SE) est couramment utilisé pour ¹² régénérer des plantes. Dans le modèle de légumineuse M. truncatula, la ligne de semis Jemalong 2HA (2HA) a été développé à partir du parent Jemalong d'avoir des taux élevés de l'embryogenèse somatique ^13. Le nombre d'embryons produits a récemment été substantiellement augmentée en ajoutant à la fois acide gibbérellique (GA) et de l'acide abscissique (ABA) dans le milieu depuis longtemps établi ^14. Dans ce cas, GA et ABA agissent en synergie, ce qui est inhabituel étant donné que GA et ABA agissent généralement antagoniste ^14. Les embryons produits à partir de cals se développent sur la surface qui permet à l'étape de l'embryogenèse à être facilement déterminée Visually et facilement récolté. Avoir à proximité des lignes isogéniques qui sont embryonnaires (2HA) et non-embryonnaire (Jemalong) facilite l'enquête de l'embryogenèse somatique et ayant à la fois in vivo et in vitro fournit des systèmes de différentes possibilités expérimentales.

Comprendre les mécanismes cellulaires et moléculaires du développement embryonnaire est essentiel pour la compréhension des semences et le développement des plantes. Dans les légumineuses, comme dans les autres dicotylédones, ce sont les cotylédons de l'embryon qui stockent les produits qui sont utilisés pour la nutrition humaine. Embryogenèse précoce implique la division cellulaire rapide, et la structuration de l'embryon correcte. Dans environ 8 jours après la fécondation, l'M. truncatula embryon atteint stades cotylédons début. La caractérisation morphologique est pas exactement indiquée par jours après la fécondation dans des conditions de serre. Ainsi, une approche efficace normalisé pour indiquer le stade de développement des embryons est précieux dans l'étude de la génétique regulation du début de l'embryogenèse zygotique.

Dans cet article, nous proposons deux protocoles normalisés afin de recueillir des embryons en développement pour les études biologiques de l'embryogenèse dans la légumineuse modèle M. truncatula. Le premier est de collecter des embryons zygotiques en associant l'embryogenèse et pod morphologie tandis que le second est l'embryogenèse somatique par culture des explants de feuilles de fournir un grand nombre d'embryons facilement accessibles.

Protocole

1. Zygotic développement de l'embryon

1. matériel végétal
   1. Cultivez l'Medicago truncatula type sauvage Jemalong ou son quasi isogénique, hautement re-générable génotype Jemalong 2HA ¹³ (connu sous le nom 2HA) dans une serre avec une photopériode de 14 h et à 23 ° C / 19 ° C de température jour / nuit.
      1. Pierce la surface de l'enveloppe de la graine (avec une aiguille 23 G) avant les semailles afin que l'eau est autorisé à entrer dans la graine et tremper dans l'eau pendant la nuit. Ajouter suffisamment d'eau pour couvrir entièrement la graine.
      2. Semer 3 graines dans chaque pot de 15 cm de diamètre (total de 10 pots) dans le mélange de rempotage (sable grossier, de la perlite, fibre de coco tourbe (1: 1: 1) plus de 5 g de Osmocote standard exacte: engrais à libération lente) et le transfert à la serre. Conserver le plus sain après la germination des semis de sorte qu'il est de 1 plant par pot et Surround par un treillis pour les tiges des plantes à grimper.
2. Les gousses de récolte
   1. Recueillir les gousses de la wType ILD Jemalong ou 2HA pour obtenir les stades de l'embryon précoce appropriés comme décrit pour la première ^9.
      REMARQUE: Les différentes étapes de pince sont présentés sur la figure 1 et les étapes d'embryons correspondants sont présentés dans la figure 2.
   2. Vérifiez les différentes étapes de gousses à la récolte en utilisant des critères comme l'indique le tableau 1. Mesurer le temps écoulé depuis l'étape 6 pour aider étapes distinctes 6 et 7 (Tableau 2).
3. Dissection ovules de gousses et de vérifier le stade de l'embryon
   1. Isoler ovules de gousses à l'aide de pinces fines seule ou un microscope de dissection stéréo et des pinces si nécessaire. Si nécessaire, le stade de l'embryon peut être rapidement vérifiée à l'aide d'un microscope composé standard (figure 3B).
   2. Préparez-vous modifié la solution de Hoyer contenant 7,5 g de gomme arabique, 100 g d'hydrate de chloral, 5 ml de glycérol, 60 ml d'eau déminéralisée distillée. Dissoudre par agitation pendant 3-5 heures ou toute la nuit.
   3. Pour plus d'affinerd microscopie effacer les ovules disséqués dans une solution ^{de 15,16} de Hoyer modifié. Prenez soigneusement les ovules intacts et les placer dans un petit volume de la solution de Hoyer (assez pour couvrir l'ovule) à température ambiante jusqu'à ce que clair.
   4. Voir les échantillons avec un contraste d'interférence différentiel (DIC) optique. Capturez les images iwth un appareil photo numérique ⁹ (Figure 2).
   5. Obtenir les ovules plus uniformes à partir de la région centrale de la nacelle et accumuler le nombre requis. Un exemple est montré sur la figure 3A. Recueillir les ovules sur glace et conserver à la température requise (acides -80 ° C pour nucléiques) pour une analyse plus approfondie.
      NOTE: Pour plus de détails sur l'analyse de coupes histologiques, microscopie électronique en transmission, et l'hybridation in situ s'il vous plaît voir les documents ^8,9.

2. embryons somatiques développement in vitro

1. Utilisez un M. truncatula cultivar tchapeau est capable de former facilement des embryons en culture. Pour ce protocole pour explants foliaires utiliser des plantes 2HA ^13,17 qui sont vieux 2-4 mois.
2. Prenez des dépliants de la dernière feuille trifoliée près complètement développée d'une tige d'élongation.
3. Gardez les feuilles trifoliées sur du papier humide éponge dans un pot de culture pour éviter la déshydratation.
   NOTE: Une fois que les feuilles trifoliées sont récoltés, ils doivent être utilisés dans un délai minimal.
4. Préparation du milieu de culture
   1. Utiliser le P4 10: 4: 1: 5 en milieu gélose (0,8% p: v) dans des boîtes de Pétri de 9 cm.
      Remarque: le P4 10: 4: 1: 5 milieu est constitué du milieu P4 basal ¹⁸ plus 10 acide uM 1-naphtalène (NAA), 4 uM 6-benzylaminopurine (BAP), 1 uM d'acide abscissique (ABA) et 5 uM gibbérellique l'acide (GA). L'utilisation de GA + ABA accélère la formation de l'embryon et provoque un accroissement substantiel du nombre d'embryons ^14.
   2. Faire remonter la moyenne la base de P4 dans 1 L; constitué de sels majeurs (faire Calcium séparément), des sels et des vitamines mineures (Tableau 3), fer chélaté (maquillage séparément), casaminoacides (hydrolysat de caséine), 30 g de saccharose, 8 g d'agar.
   3. Magasin solutions mères de sels majeurs, calcium, des acides casaminés, des sels et des vitamines mineures à -20 ° C dans des aliquotes convenables. Stockez fer chélaté à 4 ° C.
   4. Faites le fer chélaté (200x) en dissolvant 7,44 g de Na ₂ EDTA • 2H ₂ O dans environ 900 ml d'eau distillée déminéralisée tout en remuant, puis amener la solution à 98-99 ° C tout en ajoutant 1.853 g de FeSO ₄ • 7H ₂ O. Enfin faire jusqu'à 1 L quand les ingrédients sont dissous. Magasin en ambre bouteilles à 4 ° C coloré.
   5. Faire remonter la moyenne de base de P4 avec les solutions d'achat d'actions dans le tableau 4. Les hormones dans le milieu sont 10 uM NAA, 4 uM BAP, 1 uM ABA, 5 uM GA (voir tableau 4 et matériaux spécifiques tableau). Ajouter la NAABAP et avant passage à l'autoclave et ajouter ABA GA et après passage à l'autoclave et refroidissement à environ 55 ° C, en utilisant la filtration stérilisante avec un filtre de 0,22 um fixée à une seringue. Bien mélanger en remuant doucement.
   6. Ajustez les médias à pH 5,8 avec 1 M KOH avant autoclavage. Autoclave à 121 ° C pendant 20 min.
   7. Après autoclavage ajouter le filtre stérilisé ABA et GA, et versez environ 25 ml de milieu dans des boîtes de Pétri de 9 cm stériles dans une hotte à flux laminaire ou Biohazard cabinet. Refroidir et laisser l'agar réglé avec le couvercle. Ensuite, mettre sur le couvercle et assurez-vous qu'il n'y a pas de condensation sur le couvercle. Étiquette comme nécessaire et conserver à 4 ° C (dans une boîte en carton pour éviter couvercle condensat).
5. Stérilisation des tissus foliaires
   1. Travailler dans une hotte à flux laminaire stérilisée aux UV ou une armoire risque biologique.
   2. Lieu laisse dans la boule de maillage d'une boule à thé de printemps préalablement autoclave.
   3. Immerger boule à thé contenant les feuilles dans 70% (v: v) d'éthanol dans un culpot ture pendant 30 sec.
      REMARQUE: Pour toutes les étapes de cette procédure utilisent 250 ml bouchon à vis des pots de culture de polycarbonate qui sont passés à l'autoclave.
   4. Égoutter puis transférer et plonger le tissu de la feuille en 1: 8 (v: v) l'eau de javel diluée (0,5% de chlore) pendant 10 min. Agiter doucement de temps à autre.
   5. Égoutter l'eau de Javel et de transférer l'infuseur à thé dans un pot de culture contenant de l'eau distillée stérile déminéralisée. Remuer doucement et égoutter l'excès d'eau. Répéter une fois de plus avec un pot de culture frais de l'eau distillée stérile déminéralisée.
   6. Retirer les feuilles de l'infuseur à thé avec des pinces stériles à un pot de culture frais de l'eau distillée stérile déminéralisée. Visser le bouchon stérile et rincez en inversant et tourbillonnant. Laissez les feuilles flottant sur l'eau stérile jusqu'au moment de préparer explants.
6. Préparation et Placage explants
   1. En utilisant des techniques stériles, couper dépliants stérilisés individuels à partir du bord avec un scalpel, et couper le rectangle restant en deux ou Three explants rectangulaires (8-10 x 3-5 mm) avec la nervure médiane au centre de chaque explant (figure 5A).
      NOTE: La taille de l'expiant est très important dans le lancement de la première callusing. Effectuer la coupe sur les couvercles des contenants stériles alimentaires à emporter.
   2. Planche 6 explants sur agar-milieu de culture solidifié en 9 cm de diamètre des boîtes de Pétri (figure 5B). Plaque du explants côté abaxiale vers le bas pour maintenir l'orientation de la feuille d'habitude.
   3. Sceller les boîtes de Pétri avec Parafilm (Figure 5C) tendus autour du plat. Le tissu est maintenant prêt pour l'incubation.
7. L'incubation de tissus
   1. Incuber les plaques à l'obscurité à 28 ° C dans une chambre à température régulée ou une armoire de croissance tout au long de la période de culture.
      NOTE: Les explants entameront dédifférenciation, subir la division cellulaire, la prolifération (formation de cals) et de l'embryogenèse (différenciation).
   2. Repiquer la EXPOSÉ différenciernts après trois semaines sur un milieu frais. À cette sous-culture transférer la totalité expiant aide d'une spatule en acier inoxydable stérile et forceps, dans une hotte à flux laminaire ou dans une armoire de risque biologique. Comme callusing se produit et le cal est supérieure à la taille de la plus grande sur la figure 5C, transférer 50% de l'individu lors de repiquage des cals dans un milieu frais.
   3. Respecter les premiers embryons en environ 4 semaines. Bien qu'il existe un degré de synchronie, de recueillir différents stades de l'embryon au cours d'une période d'incubation de 4-8 semaines (figure 6A, B). Recueillir sous un microscope et le processus de dissection selon les objectifs expérimentaux.
   4. Repiquer toutes les 3 semaines et éliminer périodiquement embryons afin que les explants continueront à produire des embryons pendant 3 mois.

Résultats

Pour embryogenèse différente zygotiques structures pod correspondant aux différents stades de l'embryon sont présentés dans la figure 1A - F tandis que les différents stades de l'embryon sont présentés dans la figure 2A - F. En sélectionnant gousses au même stade, des échantillons de ovules qui sont assez uniforme peut être obtenue (figure 3A). En utilisant RT-qPCR embryon gènes spécifiques peuvent être facilement...

Discussion

Les protocoles décrits sont relativement simples et permettent enquête de l'embryogenèse légumineuses avec toute la cellule contemporaine et des techniques moléculaires. Nous reconnaissons qu'il ya des avantages et des inconvénients des deux in vivo et in vitro approches. Les deux permettent davantage l'accent sur ​​l'embryogenèse précoce par rapport à la culture des graines immatures ^19.

Dans le cas des études in vivo ce qui est dé...

matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
P4 medium	Sigma-Aldrich		Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier
Major salts
Minor salts
Vitamins
Agar	Bacto Laboratories	214010	Bacto agar
Plant hormones
1-Naphthaleneacetic acid	Sigma-Aldrich	N0640	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
Abscisic acid	Sigma-Aldrich	A1049	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
6-Benzylaminopurine	Sigma-Aldrich	B3274	Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl
Gibberellic Acid	Sigma-Aldrich	G7645	Dissolve in small amount of ethanol
Equipment
Stereo dissecting microscope	Leica	MZFLIII	Or similar
Light microscope	Zeiss	Axiophot	Or similar, with suitable optics
Digital camera	Zeiss	AxioCam HRc	Or similar
Sterilising leaves
250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid	SARSTEDT	75.9922.519	Autoclavable