Протоколы Получение зиготических и соматических эмбрионов для изучения Положение раннего развития эмбрионов в Типовом бобовых<em&gt; Medicago truncatula</em

Резюме

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Аннотация

Раннего эмбриогенеза, начиная с одной зиготы клетки проходит быстрого деления клеток и морфогенеза, и морфологически характеризуются предварительно шаровидные, шаровых, сердце, торпедных и семядольных этапов. Это прогрессивное развитие находится под жесткой регуляции сложной молекулярной сети. Сбор достаточно ранние эмбрионы на аналогичной стадии развития имеет важное значение для исследования клеточного и молекулярного регулирование раннего эмбриогенеза. Это не просто, так как в начале эмбриогенеза подвергается быстрому морфогенез в короткое время например 8 дней для Medicago truncatula достичь ранней стадии семядолей. Здесь мы решить проблему двумя подходами. Первый устанавливает связь между развитием эмбриона и под-морфологии, помогая указать этап зиготического эмбриона. Это особенно на основе количества стручка спиралей и развитие шипов. Альтернативный способ, чтобы дополнить в естественных условиях сtudies осуществляется через культивирование листовых эксплантов для получения соматических эмбрионов. Носитель содержит необычное сочетание гормона - ауксин (1-нафталинуксусной кислоты) цитокинина (6-бензиламинопурина), абсцизовой кислоты и Гиббереллиновая кислоты. Различные этапы можно выделить растущие из каллуса без вскрытия.

Введение

Бобовые третий по величине семейство высших растений с примерно 20000 видов и (или) Fabaceae семейства бобовых являются второй зерновых в области собрано и общий объем производства ^1. Соя является третьим по величине урожай выращивается. Зерновые бобовые обеспечить около одной трети диетического белка и одной трети растительного масла для потребления человеком ^2. Бобовые с их N ₂ крепления емкости также способствуют устойчивых сельскохозяйственных систем. Medicago truncatula, как соя, магазины белка и масла в семядолях его семян и генетических и геномных модель бобовых со значительными генетическими и геномных ресурсов ^3,4. В то время как М. truncatula позволило достижения в понимании бобово-Rhizobium симбиоз ⁴ было больше используются для изучения бобовых семян биологии ^5-7 и эмбриогенеза ^8,9. Arabidopsis эмбриогенез была тщательно изучена ^10,11, но это яса небобовых и детали эмбриогенеза не идентичны Medicago ^8,10. Зиготических эмбриогенез в М. truncatula имеет интересные особенности, с характерным многоклеточного гипофиза, в endoployploid суспензорные и базальная передачи ячейки ^8.

Соматического эмбриогенеза (SE) обычно используется для регенерации растений ^12. В бобовых модели М. truncatula, семян линии Jemalong 2HA (2HA) была разработана с родителем Jemalong иметь высокие темпы соматического эмбриогенеза ^13. Количество эмбрионов, полученных в последнее время существенно увеличивается при добавлении как Гиббереллиновая кислоту (GA) и АБК (ABA) в давние среды ^14. В этом случае А. и ABA синергически, что является необычным, учитывая, что А. и АБК, как правило, действуют антагонистически ^14. Эмбрионы, полученные из каллуса развиваются на поверхности, которая позволяет стадии эмбриогенеза, чтобы быть легко определены visuallу и легко собирают. Имея рядом изогенных линий, которые эмбриогенный (2HA) и не эмбриогенный (Jemalong) облегчает исследование соматического эмбриогенеза и имеющий как в естественных условиях и в пробирке систем обеспечивает различные экспериментальные возможности.

Понимание клеточные и молекулярные механизмы развития эмбриона имеет важное значение для понимания семян и развития растений. В бобовых, как и в других двудольных, это семядоли зародыша, что хранить продукты, которые используются для питания человека. Раннего эмбриогенеза включает быстрое деление клеток, и правильное структурирование эмбриона. В примерно 8 дней после оплодотворения, в М. truncatula эмбрион достигает ранние стадии семядолей. Морфологическая характеристика точно не указывается дней после оплодотворения в условиях теплицы. Таким образом, эффективность стандартизированный подход, чтобы указать на сцену развивающихся эмбрионов является ценным в изучении генетического REGULвания раннего эмбриогенеза зиготического.

В этой статье, мы предоставляем два стандартизированных протоколов для сбора развивающиеся эмбрионы для биологических исследований эмбриогенеза в бобовых модели М. truncatula. Первый заключается в сборе зиготических эмбрионов, связывая эмбриогенеза и стручок морфологию, а второй соматического эмбриогенеза с помощью культивирования листовых эксплантов, чтобы обеспечить доступ легко большое количество эмбрионов.

протокол

1. зиготических развития эмбриона

1. Растительный Материал
   1. Расти люцерны truncatula дикого типа Jemalong или его почти изогенных, высоко повторно генерируемых генотип Jemalong 2HA ¹³ (известный как 2HA) в теплице с 14 ч фотопериода и 23 ° C / 19 ° C день / ночь температуре.
      1. Пирс поверхность кожуры (с 23 G иглой) до посева семена так, чтобы вода допускаются семена и замочить в воде на ночь. Добавить достаточно воды, чтобы полностью покрыть семена.
      2. Сейте семена 3 в каждом 15 см диаметр горшка (в общей сложности 10 горшков) в горшечной смеси (крупнозернистого песка, перлита, торфа кокосовой-(1: 1: 1) плюс 5 г Osmocote Точный стандарт: медленное высвобождение удобрений) и передачи теплицы. Сохранить здоровую рассаду после прорастания, так что 1 завод в горшок и окружают шпалере для стебли растений, чтобы подняться.
2. Сбор Бобы
   1. Соберите стручки от WМН тип Jemalong или 2HA получить соответствующие этапы раннего эмбриона, как впервые описано ^9.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Различные этапы стручок показаны на рисунке 1, и соответствующие этапы эмбриона показано на рисунке 2.
   2. Проверьте различные этапы стручок на урожай, используя критерии, как показано в Таблице 1. Измерьте время, прошедшее с этапа 6, чтобы помочь отдельные этапы 6 и 7 (таблица 2).
3. Пройдя яйцеклетки из стручков и проверки зачаточном
   1. Изолировать яйцеклетки из стручков с использованием тонких щипцов одна или стерео микроскопом рассекает щипцов и по мере необходимости. При необходимости стадия эмбриона может быть быстро проверена с помощью стандартного соединения микроскопа (рис 3B).
   2. Готовят раствор модифицированного Hoyer, содержащей 7,5 г гуммиарабика 100 г хлоралгидрат, 5 мл глицерина, 60 мл деионизированной дистиллированной воды. Растворите перемешиванием в течение 3-5 ч или в течение ночи.
   3. Для получения более подробной Уточнитьд микроскопии очистить расчлененные яйцеклетки в растворе ^15,16 модифицированной Хойер в. Тщательно подобрать нетронутыми яйцеклеток и место в небольшом объеме раствора Хойер (в достаточно, чтобы покрыть яйцеклетки) при комнатной температуре до освобождения.
   4. Просмотреть образцы с дифференциальным вмешательство контрастности (ОПК) оптики. Захват изображений iwth цифровой камеры ⁹ (рисунок 2).
   5. Получить наиболее однородные яйцеклетки из центральной части стручка и накапливать необходимого количества. Пример показан на фигуре 3А. Сбор яйцеклеток на льду и хранят при необходимой температуре (-80 ° С в течение нуклеиновые кислоты) для дальнейшего анализа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для получения подробной информации по анализу гистологических срезов, трансмиссионной электронной микроскопии, а в гибридизация см статей ^8,9.

2. соматического развития эмбриона в пробирке

1. Используйте М. truncatula сорт тшляпа может легко образуют эмбрионов в культуре. Для этого протокола для листовых эксплантов использовать 2HA растения ^13,17, которые 2-4 месяцев.
2. Возьмите листовки с последней почти полностью расширенной трехлистной лист с удлиняя стебля.
3. Держите тройчатые листья на влажной бумаге полотенец в культуральной горшок, чтобы избежать обезвоживания.
   ПРИМЕЧАНИЕ: После того, как тройчатые листья собирают они должны быть использованы с минимальной задержкой.
4. Приготовление питательной среды
   1. Использование P4 10: 4: 1: 5 в среду агара (0,8% W: V) в 9 см чашки Петри.
      Примечание: P4 10: 4: 1: 5 среда состоит из минимальной среды Р4 ¹⁸ плюс 10 мкМ 1-нафтилуксусной кислоты (NAA), 4 мкМ 6-бензиламинопурин (БАП), 1 мкМ абсцизовой кислоты (ABA) и 5 мкМ гибберелловой кислота (ГК). Использование GA + ABA ускоряет образование эмбриона и вызывает существенные увеличения числа эмбрионов ^14.
   2. Макияж Р4 базальной среды в 1 л; состоящий из основных солей (сделать calciuм отдельно), незначительные соли и витамины (Таблица 3), хелатного железа (составляют отдельно), казаминокислот (гидролизат казеина), 30 г сахарозы, 8 г агара.
   3. Магазин исходные растворы основных солей, кальция, казаминокислот, незначительные солей и витаминов при -20 ° С в подходящих аликвотах. Хранить хелатного железа при 4 ° С.
   4. Составляют хелатного железа (200x) путем растворения 7,44 г Na ₂ EDTA • 2Н ₂ О приблизительно 900 мл деионизированной дистиллированной воды при перемешивании, а затем довести раствор до 98-99 ° С при добавлении 1,853 г FeSO ₄ • 7H ₂ О. Наконец составлять до 1 л, когда ингредиенты растворяются. Хранить в янтарную окраску бутылки на 4 ° C.
   5. Макияж P4 базальной среды с фондовых решений, как в таблице 4. Гормоны в среде 10 мкМ НУК, 4 мкМ БАП, 1 мкМ АБК, 5 мкМ Г.А. (см таблицу 4 и конкретные материалы таблицу). Добавить НААи БАТ перед автоклавированием и добавить ABA и GA после автоклавирования и охлаждения до примерно 55 ° С, используя фильтр стерилизации с помощью фильтра 0,22 мкм, прикрепленной к шприцу. Все хорошо перемешать, осторожно закрученного.
   6. Отрегулируйте СМИ до рН 5,8 с помощью 1 М КОН до автоклавирования. Автоклаве при 121 ° C в течение 20 мин.
   7. После автоклавирования добавить стерилизовали фильтрованием и ABA GA, и залить приблизительно 25 мл среды в стерильные 9 см чашки Петри в колпаке с ламинарным потоком или биологической шкафу. Круто и агар установить с крышкой прочь. Затем положить на крышке и убедитесь, что нет конденсата на крышке. Этикетка по мере необходимости, и хранят при температуре 4 ° С (в картонной коробке, чтобы предотвратить крышки конденсат).
5. Стерилизация ткань листа
   1. Работа в капюшоне ламинарного потока УФ-стерилизации или биологической кабинета.
   2. Место оставляет в сетчатый шар ранее автоклавного весной чайник для заварки.
   3. Погрузитесь чай заварочный, содержащий листья в 70% (по объему) этанола в кульра горшок в течение 30 сек.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для всех шагов в этой процедуре использовать 250 мл винтовой крышкой из поликарбоната культуры горшки, которые автоклавного.
   4. Drain, а затем передать и погружают ткань листьев в 1: 8 (по объему) разбавляли отбеливателя (0,5% активного хлора) в течение 10 мин. Вихревой нежно время от времени.
   5. Слейте отбеливатель и передать чай заварочный в культуральной горшок, содержащей стерильную деионизированную дистиллированную воду. Аккуратно водоворот и слейте лишнюю воду. Повторите еще раз с свежей культуральной горшок стерильной деионизированной дистиллированной воде.
   6. Удалите листья из чая для заварки с стерильным пинцетом в свежей культуральной горшок стерильной деионизированной дистиллированной воде. Винт на стерильной крышкой и промыть обращением и закрученной. Оставьте листья не плавают на стерильной воде до готовности, чтобы подготовить эксплантов.
6. Подготовка и Покрытие ЭКСПЛАНТОВ
   1. Использование стерильных методов, отделка отдельных стерилизованных листовки от края с помощью скальпеля и сократить оставшееся прямоугольник в двух или Thrи ее прямоугольные эксплантов (8-10 х 3-5 мм) с середины вены в центре каждого эксплантов (рис 5А).
      Примечание: размер эксплантов очень важно в инициировании первый callusing. Провести резка на стерильных крышек от вынос пищевых контейнеров.
   2. Пластина 6 эксплантов на агар-затвердевает культуральной среде в 9 см в диаметре чашки Петри (рис 5б). Плита эксплантов абаксиальной стороной вниз, чтобы поддерживать обычный ориентацию листа.
   3. Печать на чашки Петри с Parafilm (рис 5в) растянутые вокруг блюдо. Ткань готов к инкубации.
7. Ткань Инкубационный
   1. Инкубируйте пластин в темноте при 28 ° С в контролируемой комнатной температуре или в шкафу роста в течение всего периода культивирования.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Эксплантаты будет инициировать дедифференцировку, пройти деление клеток, пролиферация (каллусообразования) и эмбриогенеза (дифференциации).
   2. Субкультуры дифференцирующего explaНТС после 3 недель на свежую среду. В этой субкультуры передать весь эксплантов с помощью стерильного шпателя из нержавеющей стали и щипцы, в ламинарном боксе или биологически опасных шкафу. В callusing происходит и каллуса превышает размер самого большого на рисунке 5С, передавать 50% от индивидуального каллуса при пересева в свежую среду.
   3. Соблюдайте первые эмбрионов в течение 4 недель. В то время как есть степень синхронности, собирать различные этапы эмбрионов в течение 4-8 недель инкубационного периода (рис 6а, б). Сбор при вскрытии микроскопом и способа согласно экспериментальных целей.
   4. Пересевают каждые 3 недели и периодически удалять эмбрионов, так что экспланты будет продолжать производить эмбрионов в течение 3 месяцев.

Результаты

Для зиготических эмбриогенеза отличается стручок структур, отвечающих различных этапах эмбриона показаны на рисунке 1А - F в то время как различные этапы эмбриона показано на рисунке 2А - F. Выбрав стручки на той же стадии, образцы семяпочек, что доста?...

Обсуждение

Протоколы, описанные относительно прямо вперед, и позволяют исследование бобовых эмбриогенеза со всей современной клетки и молекулярных методов. Мы признаем, что есть преимущества и недостатки как в естественных условиях и в пробирке подходов. Оба позволяют больше внимания ...

Материалы

Name	Company	Catalog Number	Comments
P4 medium	Sigma-Aldrich		Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier
Major salts
Minor salts
Vitamins
Agar	Bacto Laboratories	214010	Bacto agar
Plant hormones
1-Naphthaleneacetic acid	Sigma-Aldrich	N0640	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
Abscisic acid	Sigma-Aldrich	A1049	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
6-Benzylaminopurine	Sigma-Aldrich	B3274	Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl
Gibberellic Acid	Sigma-Aldrich	G7645	Dissolve in small amount of ethanol
Equipment
Stereo dissecting microscope	Leica	MZFLIII	Or similar
Light microscope	Zeiss	Axiophot	Or similar, with suitable optics
Digital camera	Zeiss	AxioCam HRc	Or similar
Sterilising leaves
250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid	SARSTEDT	75.9922.519	Autoclavable