Protocolos para obtenção de embriões somáticos e Zygotic para estudar a regulação do desenvolvimento embrionário precoce no Modelo de leguminosas<em&gt; Medicago truncatula</em

Resumo

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Resumo

No início da embriogênese a partir de uma única célula zigoto passa por rápida divisão celular e morfogênese, e é caracterizada morfologicamente por estágios de pré-globular, globulares, coração, torpedo e cotilédones. Esta evolução progressiva está sob a regulação apertada de uma rede molecular complexa. Colhendo embriões suficientes em um estágio similar de desenvolvimento é essencial para a investigação da regulação celular e molecular da embriogênese precoce. Isso não é simples, uma vez embriogênese sofre morfogênese rápido em um curto espaço de tempo por exemplo, oito dias para Medicago truncatula para chegar à fase de cotilédones cedo. Aqui, nós resolver a questão através de duas abordagens. O primeiro estabelece uma ligação entre o desenvolvimento do embrião e morfologia pod em ajudar indicar a etapa do embrião zigótico. Isto é particularmente com base no número de espirais e desenvolvimento das espinhas pod. Uma forma alternativa para complementar o s in vivotudies é através de cultura de explantes de folhas para produzir embriões somáticos. O meio inclui uma combinação de hormônio incomum - uma auxina (ácido 1-naftalenoacético), uma citocinina (6-benzilaminopurina), ácido abscísico e giberelina. As diferentes fases pode ser discernido que cresce fora do calo sem dissecção.

Introdução

Legumes são a terceira maior família de plantas superiores com cerca de 20.000 espécies e da (ou Fabaceae) família Leguminosae são segundo para os cereais produzidos na área colhida e produção total de ^1. A soja é a terceira maior safra cultivada. Leguminosas fornecer cerca de um terço da proteína da dieta e um terço de óleo vegetal para consumo humano ^2. Legumes com a sua capacidade de fixação de N ₂ também contribuir para sistemas agrícolas sustentáveis. Medicago truncatula, como soja, lojas de proteína e óleo nos cotilédones de suas sementes e é um modelo legume genética e genómica com consideráveis ​​recursos genéticos e genômicos ^3,4. Enquanto M. truncatula permitiu avanços na compreensão da simbiose rizóbio-leguminosa ⁴ tem sido cada vez mais utilizados para estudar biologia sementes de leguminosas ^5-7 e embriogênese ^8,9. Arabidopsis embriogénese tem sido extensivamente estudada ^10,11 mas isa não leguminosa e os detalhes da embriogénese não são idênticos aos Medicago ^8,10. Embriogênese Zygotic em M. truncatula tem características interessantes, com um hipófise multicelular distintivo, um suspensor endoployploid e célula de transferência basal ^8.

Embriogênese somática (SE) é comumente usado para regeneração de plantas ^12. No modelo de leguminosa M. truncatula, a linha de semente Jemalong 2HA (2HA) foi desenvolvido a partir do pai Jemalong a ter altas taxas de embriogênese somática ^13. O número de embriões produzidos recentemente tem sido substancialmente aumentada pela adição tanto de ácido giberélico (GA) e ácido abscísico (ABA) para a forma longa estabelecida ^14. Neste caso GA e agir sinergicamente ABA, o que é incomum, dado que GA e ABA normalmente agem antagonicamente ^14. Os embriões produzidos a partir de calo desenvolver na superfície que permite que a fase de embriogénese a ser prontamente determinada Visually e facilmente colhidas. Tendo em perto de linhas isogénicas que são embriogénicos (2HA) e não embriogénico (Jemalong) facilita a investigação de embriogénese somática e tendo tanto in vivo como em sistemas in vitro proporciona diferentes possibilidades experimentais.

A compreensão dos mecanismos celulares e moleculares do desenvolvimento do embrião é essencial para a compreensão de sementes e o desenvolvimento da planta. Em leguminosas, como em outros dicotiledóneas, são os cotilédones do embrião que armazenar os produtos que são utilizados para a nutrição humana. Embriogênese inicial envolve a divisão celular rápida e padronização embrião correta. Em cerca de 8 dias após a fertilização, a M. truncatula embrião atinge estágios iniciais de cotilédones. A caracterização morfológica não é exatamente indicado por dias após a fertilização em condições de casa de vegetação. Assim, uma abordagem padronizada eficiente para indicar a fase de embriões em desenvolvimento é valioso no estudo da genética regulção da embriogênese zigótica cedo.

Neste artigo, nós fornecemos dois protocolos padronizados para coletar embriões em desenvolvimento para estudos biológicos da embriogênese no modelo legume M. truncatula. O primeiro deles é coletar embriões zigóticos, associando a embriogênese e pod morfologia enquanto o segundo é embriogênese somática via explantes foliares cultura para fornecer um grande número de embriões facilmente acessados.

Protocolo

1. Desenvolvimento de Embriões Zygotic

1. Material Vegetal
   1. Cresça o Medicago truncatula tipo selvagem Jemalong ou seu próximo isogênico, altamente re-generativas genótipo Jemalong 2HA ¹³ (conhecido como 2HA) em uma estufa com um fotoperíodo de 14 horas e 23 ° C / 19 ° C de temperatura dia / noite.
      1. Pierce a superfície do revestimento de semente (com uma agulha G 23) antes de semear a semente de modo que a água pode entrar a semente e embeber em água durante a noite. Adicionar água suficiente para cobrir integralmente a semente.
      2. Sow 3 sementes em cada vaso diâmetro 15 cm (total de 10 potes) em mistura de envasamento (areia grossa, perlita, coco-turfa (1: 1: 1) mais de 5 g de Osmocote padrão exato: fertilizante de liberação lenta) e transferir para o estufa. Manter a plântula após a germinação saudável para que haja uma planta por vaso e cercada por uma treliça para os caules das plantas para escalar.
2. Pods Colhendo
   1. Colete pods do wTipo de ild Jemalong ou 2HA para obter os estágios do embrião precoce apropriados como primeiro descrito ^9.
      NOTA: As diferentes etapas pod são mostrados na Figura 1 e as correspondentes fases de embriões são mostrados na Figura 2.
   2. Confira os diferentes estágios pod na colheita utilizando critérios conforme tabela 1. Medir o tempo decorrido a partir da fase 6 para ajudar fases distintas 6 e 7 (Tabela 2).
3. Dissecando óvulos de vagens e verificar a fase de embrião
   1. Isolar óvulos de vagens, usando uma pinça fina sozinho ou um microscópio de dissecação estéreo e uma pinça, se necessário. Se necessário, a fase de embrião pode ser rapidamente verificados usando um microscópio composto padrão (Figura 3B).
   2. Prepare modificado solução de Hoyer contendo 7,5 g goma arábica, 100 g hidrato de cloral, 5 ml de glicerol, 60 ml de água desionizada destilada. Dissolve-se por agitação durante 3-5 horas ou durante a noite.
   3. Para obter mais refinarmicroscopia d limpar os óvulos dissecados em solução ^15,16 modificado de Hoyer. Com cuidado, pegue os óvulos intactas e coloque em um pequeno volume de solução de Hoyer (suficiente para cobrir o óvulo) à temperatura ambiente até claro.
   4. Ver as amostras com contraste de interferência diferencial (DIC) óptica. Capturar as imagens iwth uma câmara digital ⁹ (Figura 2).
   5. Obter os óvulos mais uniformes da região central do pod e acumular o número requerido. Um exemplo é mostrado na Figura 3A. Coletar os óvulos no gelo e armazenar a temperatura requerida (ácidos -80 ° C para nucleicos), para posterior análise.
      NOTA: Para detalhes sobre a análise dos cortes histológicos, microscopia eletrônica de transmissão, e hibridização in situ consulte papéis ^8,9.

2. Somatic Desenvolvimento de embriões in vitro

1. Use um M. truncatula cultivar tchapéu é capaz de formar prontamente embriões em cultura. Para este protocolo para explantes foliares usar plantas 2HA ^13,17 que são 2-4 meses de idade.
2. Tome folhetos da última trifólio quase totalmente expandida de uma haste de alongamento.
3. Mantenha os trifólios sobre papel toalha úmida em uma panela de cultura para evitar a desidratação.
   NOTA: Uma vez que os trifólios são colhidas eles precisam para ser utilizado com o mínimo de atraso.
4. Preparação do meio de cultura
   1. Utilizar a P4 10: 5 em meio de agar (0,8% w:: v) de 4: 1 em placas de Petri de 9 centímetros.
      NOTA: O P4 10: 4: 1: 5 do meio consiste na forma P4 basal ¹⁸ mais 10 uM de ácido 1-naftalenoacético (NAA), 4 uM de 6-benzilaminopurina (BAP), 1 uM de ácido abscísico (ABA) e 5 uM giberélico ácido (GA). O uso de GA + ABA acelera a formação de embriões e provoca aumentos substanciais no número de embriões ^14.
   2. Certifique-se o meio basal P4 em 1 L; que consiste em sais principais (fazer Calcium-se separadamente), sais e vitaminas menores (Tabela 3), ferro quelato (certifique-se separadamente), casaminoácidos (hidrolisado de caseína), 30 g de sacarose, 8 g de ágar.
   3. Soluções de loja de grandes sais, de cálcio, de ácidos casamino, sais menores e vitaminas a -20 ° C em aliquotas adequadas. Armazenar ferro quelato a 4 ° C.
   4. Perfazer o ferro quelado (200x) por dissolução de 7,44 g de Na ₂ EDTA • 2H ₂ O em aproximadamente 900 ml de água destilada desionizada, enquanto se agitava, em seguida, levar a solução a 98-99 ° C, enquanto a adição de 1,853 g de _FeSO4 • 7H ₂ O. Finalmente completar a 1 L quando os ingredientes são dissolvidos. Loja em âmbar garrafas a 4 ° C colorido.
   5. Adicione-se o meio basal P4 com as soluções de reserva como na Tabela 4. As hormonas no meio são 10 uM de NAA, 4 uM BAP, 1 uM de ABA, 5 uM GA (ver Tabela 4 e Tabela materiais específicos). Adicione o NAAe BAP antes da autoclavagem e adicionar ABA e GA após autoclavagem e arrefecimento a cerca de 55 ° C, utilizando-se esterilização por filtração com um filtro de 0,22 um ligado a uma seringa. Misture bem por agitação suave.
   6. Ajuste a mídia para pH 5,8 com 1 M KOH antes da autoclavagem. Autoclave a 121 ° C durante 20 min.
   7. Após autoclavagem adicionar o filtro ABA esterilizado e GA, e despeje cerca de 25 ml de mídia na estéreis nove centímetros placas de Petri numa câmara de fluxo laminar ou gabinete de risco biológico. Legal e deixar o agar conjunto com a tampa fora. Em seguida, coloque sobre a tampa e certifique-se que não há condensado na tampa. Etiqueta tal como exigido e armazenar a 4 ° C (em uma caixa de papelão para impedir tampa condensado).
5. Esterilização de tecido foliar
   1. Trabalhar em uma capela de fluxo laminar, esterilizada por UV ou gabinete de risco biológico.
   2. Coloque as folhas em malha a bola de um infusor de chá mola previamente autoclavada.
   3. Imergir infusor de chá que contém as folhas em 70% (v: v) de etanol em um culpot tura durante 30 segundos.
      NOTA: Para todas as etapas deste procedimento utilizar 250 ml tampa de rosca potes de cultura de policarbonato que são autoclavados.
   4. Drenar e, em seguida, transferir e imergir o tecido de folha em 1: 8 (v: v) de lixívia diluída (0,5% de cloro) durante 10 min. Homogeneizar suavemente ao longo do tempo.
   5. Escorra a água sanitária e transferir o infusor de chá em uma panela de cultura contendo água destilada deionizada estéril. Agite suavemente e drenar o excesso de água. Repita mais uma vez com um pote de cultura fresco de água destilada deionizada estéril.
   6. Retire as folhas do infusor de chá com uma pinça estéril para um pote de cultura fresco de água destilada deionizada estéril. Parafuso na tampa estéril e enxaguar invertendo e rodando. Deixe as folhas que flutuam na água estéril até que esteja pronto para preparar explantes.
6. Preparação e chapeamento explantes
   1. Usando técnicas estéreis, guarnição folhetos esterilizados individuais a partir da borda com um bisturi, e cortar o retângulo restante em dois ou tree explantes rectangulares (8-10 x 3-5 mm) com o meio da veia no centro de cada explante (Figura 5A).
      NOTA: O tamanho do explante é bastante importante no início do primeiro dos calos. Realizar o corte em tampas estéreis a partir de recipientes de comida take-away.
   2. Placa 6 explantes no meio de cultura solidificado com agar de 9 cm de diâmetro em placas de Petri (Figura 5B). Placa explantes lado do abaxial para baixo para manter a orientação da folha de costume.
   3. Selar as placas de Petri com Parafilm (Figura 5C) se estenderam ao redor do prato. O tecido está agora pronto para a incubação.
7. A incubação de tecidos
   1. Incubam-se as placas no escuro a 28 ° C numa sala de temperatura controlada ou câmara de crescimento durante todo o período de cultura.
      NOTA: Os explantes iniciará desdiferenciação, sofrem divisão celular, proliferação (formação de calos) e embriogênese (diferenciação).
   2. Subcultura do EXPOSIÇÃO diferenciandonts após 3 semanas em meio fresco para. Neste subcultura transferir todo o explante usando uma espátula de aço inoxidável estéril e uma pinça, em uma câmara de fluxo laminar ou um armário de risco biológico. Como ocorre calos e o calos excede o tamanho do maior na Figura 5C, transferir 50% do calo indivíduo quando subcultura para meio fresco.
   3. Observar os primeiros embriões em cerca de 4 semanas. Embora haja um certo grau de sincronia, recolher os diferentes estágios de embriões, durante um período de incubação de 4-8 semanas (Figura 6A, B). Recolha sob um microscópio de dissecação e processo de acordo com objetivos experimentais.
   4. Subcultura a cada 3 semanas e remover embriões periodicamente de modo que os explantes continuará a produzir embriões durante 3 meses.

Resultados

Para diferentes estruturas de embriogénese pod zigóticos correspondentes às diferentes fases de embriões são mostrados na Figura 1A - F enquanto os diferentes estágios embrionários são mostrados na Figura 2A - F. Ao seleccionar vagens na mesma fase, as amostras de óvulos que são bastante uniforme pode ser obtida (Figura 3A). Usando RT-qPCR embrião genes específicos podem ser facilmente detectada e os estudos do curso de temp...

Discussão

Os protocolos descritos são relativamente simples e permitir a investigação de embriogênese legume com toda a célula contemporânea e técnicas moleculares. Reconhecemos que há vantagens e desvantagens de ambos in vivo e in vitro abordagens. Ambos permitem mais foco na embriogênese inicial em relação à cultura de sementes imaturas ^19.

No caso de estudos in vivo que é descrito é predominantemente o isolamento do óvulo da vagem que é adequado para mui...

Materiais

Name	Company	Catalog Number	Comments
P4 medium	Sigma-Aldrich		Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier
Major salts
Minor salts
Vitamins
Agar	Bacto Laboratories	214010	Bacto agar
Plant hormones
1-Naphthaleneacetic acid	Sigma-Aldrich	N0640	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
Abscisic acid	Sigma-Aldrich	A1049	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
6-Benzylaminopurine	Sigma-Aldrich	B3274	Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl
Gibberellic Acid	Sigma-Aldrich	G7645	Dissolve in small amount of ethanol
Equipment
Stereo dissecting microscope	Leica	MZFLIII	Or similar
Light microscope	Zeiss	Axiophot	Or similar, with suitable optics
Digital camera	Zeiss	AxioCam HRc	Or similar
Sterilising leaves
250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid	SARSTEDT	75.9922.519	Autoclavable