Protokolle für die Beschaffung Zygotic und somatischen Embryonen zur Untersuchung der Regulation der frühen Embryo-Entwicklung in der Modell-Hülsenfrucht<em&gt; Medicago truncatula</em

Zusammenfassung

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Zusammenfassung

Der frühen Embryogenese ausgehend von einer einzigen Zelle Zygote geht durch schnelle Zellteilung und Morphogenese und ist morphologisch durch pre-kugelförmig, kugelförmig, Herz, Torpedo und Keimblattstufen gekennzeichnet. Diese fortschreitende Entwicklung ist unter der strengen Regelung einer komplexen molekularen Netzwerk. Ernte ausreichend frühen Embryonen in einem ähnlichen Entwicklungsstufe ist für die Untersuchung der zellulären und molekularen Regulation der frühen Embryogenese. Das ist nicht einfach, da der frühen Embryogenese erfährt rasche Morphogenese in kurzer Zeit zB 8 Tage Medicago truncatula die frühen Keimblattstadium zu erreichen. Hier wenden wir uns das Problem durch zwei Ansätze. Die erste stellt eine Verbindung zwischen der Embryonalentwicklung und pod Morphologie helfen zeigen die Stufe des zygotischen Embryos. Dies ist insbesondere auf die Anzahl der Spiralen und pod Entwicklung der Stacheln beruht. Ein alternativer Weg zur Ergänzung des in vivo sTUDIEN ist über Kultivierung Blattexplantate zu somatischen Embryonen zu produzieren. Das Medium enthält eine ungewöhnliche Hormonkombination - ein Auxin (1-Naphthalinessigsäure), ein Cytokinin (6-Benzylaminopurin), Abscisinsäure und Gibberellinsäure. Die verschiedenen Phasen erkennbar wachsen aus dem Kallus ohne Dissektion werden.

Einleitung

Hülsenfrüchte sind die drittgrößte Gruppe von höheren Pflanzen mit ca. 20.000 Arten und der (oder Fabaceae) Familie Leguminosae sind einmalig Getreide in Gebiet geerntet und Gesamtproduktion ^1. Sojabohne ist die drittgrößte Kulturpflanzen. Hülsenfrüchte liefern etwa ein Drittel des Nahrungsprotein und ein Drittel von Pflanzenöl für den menschlichen Verzehr ^2. Hülsenfrüchte mit Fixierfähigkeit N ₂ auch dazu beitragen, eine nachhaltige landwirtschaftliche Systeme. Medicago truncatula, wie Sojabohne, speichert Protein und Öl in den Kotyledonen der Samen und ist eine genetische und genomische Leguminosen Modell mit erheblichen genetischen und genomischen Ressourcen ^3,4. Während M. truncatula hat Fortschritte im Verständnis der Leguminosen-Rhizobien Symbiose ⁴ hat es zunehmend eingesetzt, um Hülsenfruchtsamen Biologie ^5-7 und Embryogenese ^8,9 studieren aktiviert. Arabidopsis Embryogenese wurde intensiv untersucht, aber es ^10,11 isa Nichthülsenfrucht und die Details der Embryogenese sind nicht identisch mit Medicago ^8,10. Zygotischen Embryogenese in M. truncatula hat interessante Features, mit einem unverwechselbaren vielzelligen Hypophyse, einer endoployploid suspensor und basalen Übertragungszelle ^8.

Somatische Embryogenese (SE) wird üblicherweise zur Regeneration von Pflanzen ¹² eingesetzt. In der Hülsenfrüchte Modell M. truncatula das Saatgut Linie Jemalong 2HA (2HA) wurde aus der Mutter Jemalong entwickelt worden, um hohe somatische Embryo ¹³ haben. Die Zahl der Embryonen hergestellt wurde kürzlich inhaltlich, indem sowohl die Gibberellinsäure (GA) und Abscisinsäure (ABA) in die seit langem etablierte Medium ¹⁴ erhöht. In diesem Fall GA und ABA wirken synergistisch, was ungewöhnlich ist da GA und ABA in der Regel ¹⁴ antagonistisch wirken. Die aus Kallus produziert Embryonen entwickeln sich auf der Oberfläche, die das Stadium der Embryogenese, leicht bestimmt werden können Visually und leicht geerntet. Mit in der Nähe von isogenen Linien, die embryo (2HA) und nicht-embryo (Jemalong) sind erleichtert die Untersuchung der somatischen Embryogenese und sowohl in vivo und in vitro-Systemen bietet verschiedene Experimentiermöglichkeiten.

Das Verständnis der zellulären und molekularen Mechanismen der Embryoentwicklung ist wesentlich für das Verständnis Saatgut und Pflanzenentwicklung. In Hülsenfrüchten, wie in anderen Dikotyle ist es die Cotyledonen des Embryos, die die Produkte, die für die menschliche Ernährung verwendet werden, zu speichern. Der frühen Embryogenese beinhaltet schnelle Zellteilung und korrekte Embryo Musterung. In ca. 8 Tage nach der Befruchtung, der M. truncatula Embryo erreicht frühen Keimblattstufen. Die morphologischen Charakterisierung ist nicht genau durch Tage nach der Befruchtung in Gewächshausbedingungen angedeutet. Somit ist eine effiziente Standardansatz, um die Phase der sich entwickelnden Embryonen zeigen wertvoll bei der Untersuchung der genetischen regulation der frühen Embryogenese zygotische.

In diesem Beitrag stellen wir zwei standardisierte Protokolle, um sich entwickelnden Embryonen für biologische Untersuchungen der Embryogenese in der Hülsenfrüchte Modell M. sammeln truncatula. Die erste ist zu zygotischen Embryos durch Zuordnung der Embryogenese und pod Morphologie während der zweite ist die somatische Embryogenese via Kultivierung Blattexplantate zu leicht zugänglich großen Embryo Zahlen liefern zu sammeln.

Protokoll

1. Zygotic Embryo-Entwicklung

1. Pflanzenmaterial
   1. Wachsen die Medicago truncatula Wildtyp Jemalong oder dessen in der Nähe von isogenen, hoch wieder erzeugbaren Genotyp Jemalong 2HA ¹³ (als 2HA bekannt) in einem Gewächshaus mit einer 14 h Fotoperiode und 23 ° C / 19 ° C Tag / Nacht-Temperatur.
      1. Pierce die Oberfläche der Samenschale (mit einer 23 G-Nadel) vor der Aussaat der Samen, so dass Wasser ist erlaubt, um den Samen geben und genießen in Wasser über Nacht. Fügen Sie genug Wasser, um den Samen vollständig abdecken.
      2. Sow 3 Samen in jeder 15 cm Durchmesser Topf (insgesamt 10 Töpfe) in Blumenmischung (Grobsand, Perlit, Kokosfaser-Torf (1: 1: 1) plus 5 g Osmocote Exact Standard: Langzeitdünger) und Transfer zum Gewächshaus. Bewahren Sie die gesündeste Sämling nach der Keimung, so gibt es 1 Pflanze pro Topf und umgeben von einem Gitter für die Pflanzenstengel zu klettern.
2. Harvesting Pods
   1. Sammeln Sie Früchte aus der wild Typ Jemalong oder 2HA, um die entsprechenden frühen Embryo Stufen zu erhalten, wie zuerst beschrieben ^9.
      HINWEIS: Die verschiedenen pod Stufen sind in Figur 1 gezeigt, und die entsprechenden Embryo Stufen sind in Abbildung 2 dargestellt.
   2. Überprüfen Sie die verschiedenen pod Stufen bei der Ernte mit Hilfe von Kriterien gemäß Tabelle 1. Messen Sie die Zeit von Stufe 6 vergangen zu getrennten Stufen 6 und 7 (Tabelle 2) zu helfen.
3. Sezieren Samenanlagen von Hülsen und die Überprüfung der Embryonalstadium
   1. Isolieren Samenanlagen von Hülsen mit feinen Pinzette allein oder einem Stereo Binokular und Pinzette wie nötig. Bei Bedarf kann der Embryo Phase kann mit einem Standard-gesetzten Mikroskop (3B) schnell überprüft werden.
   2. Bereiten geändert Hoyers Lösung, die 7,5 g Gummi arabicum, 100 g Chloralhydrat, 5 ml Glycerin, 60 ml entionisiertem, destilliertem Wasser. Lösen sich durch Rühren für 3-5 Stunden oder über Nacht.
   3. Weitere verfeinernd Mikroskopie deaktivieren Sie die seziert Samenanlagen in modifizierten Hoyer-Lösung ^15,16. Vorsichtig holen die intakten Eizellen und in einem kleinen Volumen von Hoyer-Lösung (genug, um die Samenanlage abdecken) bei Raumtemperatur, bis klar.
   4. Sehen Sie sich die Proben mit Differentialinterferenzkontrast (DIC) Optik. Erfassen Sie die Bilder iwth einer Digitalkamera ⁹ (Abbildung 2).
   5. Besorgen Sie sich die gleichmäßige Samenanlagen aus dem Mittelbereich der pod und sammeln die erforderliche Anzahl. Ein Beispiel ist in 3A gezeigt. Sammeln Sie die Samenanlagen auf Eis und an einem gewünschten Temperatur (-80 ° C für Nukleinsäuren) zur weiteren Analyse.
      HINWEIS: Einzelheiten zur Analyse der histologischen Schnitten, Transmissionselektronenmikroskopie, und in-situ-Hybridisierung finden Sie Papiere ^8,9.

2. Entwicklung somatischer Embryonen in vitro-

1. Verwenden Sie ein M. truncatula Sorte tHut ist in der Lage, leicht zu bilden Embryonen in Kultur. Aus diesem Protokoll für Blattexplantate verwenden 2HA Pflanzen ^13,17, die 2-4 Monate alt sind.
2. Nehmen Sie aus dem aktuellen Flugblätter fast vollständig erweitert dreiblättrigen Blatt einer Verlängerungsschaft.
3. Halten Sie die dreiblättrigen Blätter auf feuchten Papiertüchern in einem Kulturtopf um Austrocknung zu vermeiden.
   Hinweis: Wenn der dreiblättrigen Blätter geerntet werden sie brauchen, um mit minimaler Verzögerung genutzt werden.
4. Herstellung des Kulturmediums
   1. Verwenden Sie den P4 10: 4: 1: 5 Medium in Agar (0,8% w: v) in 9 cm Petrischalen.
      HINWEIS: Der P4 10: 4: 1: 5-Medium besteht aus dem P4-Basalmedium ¹⁸ plus 10 & mgr; M 1-Naphthalinessigsäure (NAA), 4 & mgr; M 6-Benzylaminopurin (BAP), 1 & mgr; M Abscisinsäure (ABA) und 5 uM gibberellic Säure (GA). Die Verwendung von GA + ABA beschleunigt Embryobildung und verursacht materiellen Steigerungen Embryo Nummer ^14.
   2. Bilden die die P4 Grundmedium in 1 L; bestehend aus Hauptsalze (machen Calcium separat), kleinere Salze und Vitamine (Tabelle 3), Chelat-Eisen (bilden separat), Casaminosäuren (Caseinhydrolysat), 30 g Saccharose, 8 g Agar.
   3. Shop Stammlösungen der wichtigsten Salze, Calcium, Casaminosäuren, kleinere Salze und Vitamine bei -20 ° C in geeigneten Teilmengen. Speichern Chelateisen bei 4 ° C.
   4. Bilden den chelatisierten Eisen (200x) durch Auflösen 7,44 g Na ₂ EDTA • 2H ₂ O in etwa 900 ml entionisiertem destilliertem Wasser unter Rühren, dann wird die Lösung auf 98-99 ° C unter Zugabe von 1,853 g FeSO ₄ • 7 H ₂ O. Schließlich auf 1 L, wenn die Inhaltsstoffe gelöst sind. Shop in bernsteinfarbenen Flaschen bei 4 ° C.
   5. Machen den P4 Grundmedium mit den Stammlösungen, wie in Tabelle 4. Die Hormone im Medium sind 10 uM NAA, 4 uM BAP, 1 uM ABA, 5 uM GA (siehe Tabelle 4 und spezifische Materialien Tabelle). Fügen Sie die NAAund BAP vor dem Autoklavieren und fügen ABA und GA nach dem Autoklavieren und Abkühlen auf etwa 55 ° C unter Verwendung von Filtersterilisation mit einem 0,22 um-Filter in eine Spritze befestigt. Und Mischen leicht schwenken.
   6. Stellen Sie die Medien auf pH 5,8 mit 1 M KOH vor dem Autoklavieren. Autoklaven bei 121 ° C für 20 min.
   7. Nach dem Autoklavieren fügen Sie den Filter sterilisiert ABA und GA, und gießen Sie etwa 25 ml Medium in sterile 9 cm Petrischalen in einer Steril oder Biohazard Schrank. Kühl und lassen Sie die Agar mit dem Deckel off gesetzt. Dann legen Sie den Deckel und stellen Sie sicher, es gibt keine Kondensat auf dem Deckel. Label nach Bedarf und bei 4 ° C (in einem Karton auf Deckel Kondensat vermeiden).
5. Sterilisation von Blattgewebe
   1. Arbeiten Sie in einem UV-sterilisiert Sterilbank oder Biohazard Schrank.
   2. Platz verlässt Ball in die Maschen eines zuvor autoklaviert Frühjahr Tee-Ei.
   3. Tauchen Tee-Ei, das die Blätter in 70% (v: v) Ethanol in einer Stichture Topf für 30 Sekunden.
      Hinweis: Für alle Schritte in diesem Verfahren verwenden 250 ml Schraubverschluss Polycarbonat Kulturgefäßen, die autoklaviert werden.
   4. Ablassen und dann übertragen und tauchen in das Blattgewebe in 1: 8 (v: v) verdünnt Bleiche (0,5% Chlor) für 10 min. Vorsichtig schwenken von Zeit zu Zeit.
   5. Lassen Sie das Bleichmittel und überweisen Sie den Tee-Ei in einer Kultur Topf mit sterilem entionisiertem destilliertem Wasser. Vorsichtig schwenken und überschüssiges Wasser abtropfen lassen. Wiederholen Sie noch einmal mit frischem Kulturtopf sterilem entionisiertem destilliertem Wasser.
   6. Blätter aus dem Tee-Ei mit einer sterilen Pinzette entfernen, um ein frisches Kulturtopf sterilem entionisiertem destilliertem Wasser. Schrauben Sie die sterile Schutzkappe und spülen Sie durch Umdrehen und wirbeln. Lassen Blätter schwimmen auf dem sterilem Wasser bis zu seiner Explantate vorzubereiten.
6. Vorbereitung und Beschichtung Explantate
   1. Mit sterilen Techniken, Trimm einzelnen sterilisiert Flugblätter von der Kante mit einem Skalpell, und schneiden Sie die verbleibenden Rechtecks ​​in zwei oder three rechteckigen Explantate (8-10 x 3-5 mm) mit der Mitte der Vene in der Mitte jedes Explantat (5A).
      HINWEIS: Die Größe des Explantats ist ziemlich wichtig im Hinblick auf die ersten Verhornung. Führen Sie den Schneid auf sterilen Deckeln aus Take-away-Essen-Container.
   2. Platte 6 Explantate auf Agar verfestigten Nährboden in 9 cm Petrischalen (5B). Platte der Explantate abaxial Seite nach unten zu den üblichen Blatt Ausrichtung zu halten.
   3. Verschließen Sie die Petrischalen mit Parafilm (5C) gestreckt um die Schale. Das Gewebe ist nun bereit für die Inkubation.
7. Tissue Incubation
   1. Die Platten im Dunkeln inkubieren bei 28 ° C in einem Raum mit kontrollierter Temperatur oder Wachstumskammer in der gesamten Kulturperiode.
      HINWEIS: Die Explantate werden Entdifferenzierung initiieren, Zellteilung, Zellproliferation (Kallusbildung) und Embryogenese (Differenzierung) zu unterziehen.
   2. Subkultur die Differenzierung Sälen mit Kaminnts nach 3 Wochen auf frisches Medium. An dieser Subkultur überweisen Sie den gesamten Explantat mit einem sterilen Spatel und Pinzette aus rostfreiem Stahl, in einer Steril oder ein Biohazard Schrank. Wie Verhornung auftritt und der Kallus die Größe der größte in 5C überschreitet, übertragen 50% der einzelnen Kallus bei Subkultivierung auf frischem Medium.
   3. Beachten Sie die ersten Embryonen in ca. 4 Wochen. Zwar gibt es ein gewisses Maß an Synchronität, sammeln verschiedene Embryo Stufen über einem 4-8 Woche Inkubationszeit (6A, B). Sammeln unter einem Binokular und Verfahren nach Versuchsziele.
   4. Subkultur alle 3 Wochen und Embryonen periodisch zu entfernen, so dass die Explantate werden weiterhin Embryonen für 3 Monate zu produzieren.

Ergebnisse

Für zygotischen Embryogenese Kultivare Strukturen entsprechend den verschiedenen Embryo Stufen in 1A gezeigt - F - F während die verschiedenen Embryo Stufen in 2A gezeigt. Durch die Auswahl Schoten auf der gleichen Stufe, Proben von Samenanlagen, die sehr gleichmäßige erhalten werden (3A) sind. Durch die Verwendung von RT-qPCR Embryo bestimmte Gene können leicht erkannt und Zeitverlauf Studien evaluiert ^9. Einige zusätz...

Diskussion

Die beschriebenen Protokolle sind relativ einfach und ermöglicht Untersuchung der Leguminosen Embryogenese mit allen modernen Zell- und molekulare Techniken. Wir erkennen, dass es Vorteile und Nachteile sowohl in vivo und in vitro-Ansätze. Beide erlauben mehr Fokus auf der frühen Embryogenese im Vergleich zu Kultur der unreifen Samen ^19.

Im Fall von in vivo-Studien, was beschrieben wird vorwiegend die Isolierung der Samenanlage von dem POD passend fü...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
P4 medium	Sigma-Aldrich		Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier
Major salts
Minor salts
Vitamins
Agar	Bacto Laboratories	214010	Bacto agar
Plant hormones
1-Naphthaleneacetic acid	Sigma-Aldrich	N0640	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
Abscisic acid	Sigma-Aldrich	A1049	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
6-Benzylaminopurine	Sigma-Aldrich	B3274	Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl
Gibberellic Acid	Sigma-Aldrich	G7645	Dissolve in small amount of ethanol
Equipment
Stereo dissecting microscope	Leica	MZFLIII	Or similar
Light microscope	Zeiss	Axiophot	Or similar, with suitable optics
Digital camera	Zeiss	AxioCam HRc	Or similar
Sterilising leaves
250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid	SARSTEDT	75.9922.519	Autoclavable