Model Baklagil Erken Embriyo Geliştirme Yönetmeliği incelenmesi için zigotik ve somatik embriyolar Elde protokolleri<em&gt; Medicago truncatula</em

Özet

The goal is to illustrate that the model legume Medicago truncatula can be readily utilized to investigate the regulation of early plant embryogenesis to complement the non-legume Arabidopsis model. Pod morphology is linked to zygotic embryogenesis stages and a protocol to collect embryos using tissue culture is also provided.

Özet

Tek bir hücre zigot başlayarak Erken embryogenesis hızlı hücre bölünmesi ve morfogenez geçer ve morfolojik öncesi küresel, küresel, kalp, torpido ve kotiledon aşamalarında ile karakterizedir. Bu ilerici gelişme karmaşık bir moleküler ağ sıkı yönetmelik altındadır. Benzer bir gelişme aşamasında yeterli bir erken embriyolar Hasat erken embriyogenez hücresel ve moleküler düzenleme incelemek için gereklidir. Medicago'dan örneğin 8 gün erken kotiledon aşamaya ulaşmak için truncatula ise erken embriyogenez kısa hızlı morfolojilerinden uğrar çünkü bu kolay değildir. Burada, iki yaklaşımlarla sorunu gidermek. İlki zigotik embriyo aşamasına işaret yardımcı embriyo gelişimi ve bakla morfolojisi arasında bir bağlantı kurar. Bu, özellikle bakla spiraller ve dikenler geliştirilmesi sayısına dayanır. In vivo s tamamlayacak alternatif bir yoltudies somatik embriyoların üretilmesi için kültür yaprak eksplantlarından yoluyladır. Orta sıra dışı bir hormon kombinasyonu içeren - bir oksin (1-naftalenasetik asit), bir sitokinin (6-benzilaminopurin), absisik asit ve gibberellik asit. farklı aşamalarında diseksiyon olmadan kallus dışında büyüyen ayırt edilebilir.

Giriş

Hasat alan ve toplam üretim ^1'de hububat ikinci baklagiller, yaklaşık 20.000 tür ve Leguminosae (Fabaceae veya) ailesi ile yüksek bitkilerin üçüncü büyük aileyiz vardır. Soya üçüncü büyük kültür bitkisidir. Tahıl baklagiller diyet proteini üçte biri ve insan tüketimine ² bitkisel yağ üçte biri ile ilgili sağlar. Onların N ₂ sabitleme kapasitesi ile Baklagiller ayrıca tohum kotiledonlarında soya, mağazalar protein ve yağ gibi. Sürdürülebilir tarımsal sistemlere Medicago truncatula katkıda önemli genetik ve genomik kaynakların ^3,4 ile genetik ve genomik baklagil modelidir. M. iken truncatula giderek baklagil tohum biyolojisi ^5-7 ve embriyojenezi ^8,9 incelemek için istihdam edilmiştir baklagil-rhizobium simbiyoz ⁴ anlamada ilerlemeler sağladı. Arabidopsis embryogenesis yoğun ^10,11 okudu ama ben olmuştursa olmayan baklagil ve embriyogenez ayrıntıları Medicago'dan ^8,10 özdeş değildir. M'de zigotik embryogenesis truncatula farklı bir çok hücreli hipofiz, bir endoployploid uyutucuya ve bazal transferi hücresinin ^8, ilginç özelliklere sahiptir.

Somatik embriyojenez (SE), yaygın olarak bitkiler ¹² rejenerasyonu için kullanılır. Baklagil modelinde M. In truncatula, ebeveyn Jemalong dan geliştirilmiştir tohum çizgisi Jemalong 2HA (2HA) somatik embriyogenez ¹³ yüksek oranlarına sahip. üretilen embriyoların sayısı son zamanlarda önemli ölçüde köklü orta ¹⁴ hem gibberelik asit (GA) ve absisik asit (ABA) eklenerek artış olmuştur. GA ve ABA genellikle antagonistik ¹⁴ hareket verilen sıradışı sinerjik bu durumda GA ve ABA hareket içinde. kallustan embriyoların embriyogenez evresi hali hazırda visuall saptanmasına olanak sağlamaktadır yüzeyi üzerinde gelişebiliry ve kolaylıkla hasat edildi. Somatik embriyojenez incelenmesi (Jemalong) (2HA) embriyonik ve embriyonik olmayan olan izojenik hatlarının yakınında kolaylaştırır olması ve in vivo ve farklı deneysel olanaklar sağlar in vitro sistemlerde de sahip.

Embriyo gelişimi hücresel ve moleküler mekanizmaların anlaşılması anlayış tohum ve bitki gelişimi için gereklidir. Baklagiller, diğer çeneklilere olduğu gibi, insan beslenmesi için kullanılan ürünler depolamak embriyo kotiledonları olduğunu. Erken embryogenesis hızlı hücre bölünmesi ve doğru embriyo desenlendirme içerir. 8 gün sonra gübreleme, M'de truncatula embriyo erken kotiledon aşamaları ulaşır. morfolojik karakterizasyon tam sera koşullarında döllenme sonrasında gün gösterilmez. Böylece, gelişmekte olan embriyo aşamasına belirtmek için verimli bir standart yaklaşım, genetik REGUL okuyan değerlidirErken zigotik embriyojenezin tirme.

Bu yazıda, baklagil modelde M. de embriyogenezin biyolojik çalışmalar için gelişen embriyolar toplamak için iki standart protokolleri sağlamak truncatula. İlki ikinci kolayca erişilen büyük embriyo sayıları sağlamak için kültür yaprak eksplantlarından yoluyla somatik embriyogenesis ise embriyogenez ve pod morfolojisi ilişkilendirerek Zigotik embriyolar toplamaktır.

Protokol

1. Zigotik Embriyo Gelişimi

1. Bitki Materyali
   1. Büyüme Medicago, bir 14 saatlik aydınlık periyoduyla serada 23 ° C / 19 ° C gündüz / gece sıcaklığı yabani tip Jemalong ya da yüksek oranda yeniden generable onun yakınındaki izogenik, (2HA olarak da bilinir) genotip Jemalong 2HA ¹³ truncatula.
      1. Suyun tohumu girin ve bir gece suda bekletin izin, böylece tohumun ekim önce Pierce (23 G iğne ile), tohum kaplama yüzeyi. Tam tohum örtecek kadar su ekleyin.
      2. Saksı karışımı içinde her 15 cm çapında pota 3 tohum ekmek (10 kapların toplam) (kaba kum, perlit, lif-turba (1: 1: 1) artı Osmocote Exact Standardı 5 g: Yavaş salimli gübre) ve aktarma sera. Bitki tırmanmak sapları için pot ve çevre başına 1 bitki bir kafes tarafından var bu yüzden çimlenme sonrası sağlıklı fide saklayın.
2. Hasat Bölmeler
   1. W gelen bakla toplayınJemalong veya 2HA uygun erken embriyo aşamalarında elde etmek ild türü olarak ilk ⁹ nitelendirdi.
      Not: Farklı bölme aşamaları, Şekil 1 'de gösterilmiştir ve karşılık gelen embriyo aşamaları, Şekil 2'de gösterilmiştir.
   2. Ayrı aşamaları 6 ve 7 (Tablo 2) yardım etmek için sahneye 6 geçen süreyi. Tablo 1 gereğince kriterleri kullanılarak hasat farklı pod aşamalarını kontrol ölçün.
3. Bölmelerinden ovüllerin Kesme ve embriyo aşaması kontrol
   1. Gerekirse tek başına ince forseps kullanarak bakla veya stereo mikroskop ve forseps gelen ovüllerin izole edin. Gerekirse embriyo aşaması hızla standart bileşik mikroskobu (Şekil 3B) kullanılarak kontrol edilebilir.
   2. Arabic 7.5 g sakız, 100 g klor hidrat, 5 ml gliserol, damıtılmış deiyonize su 60 ml su ihtiva eden Hoyer çözeltisi modifiye hazırlayın. 3-5 saat veya gece boyunca karıştırılarak çözülür.
   3. Daha fazla rafine içind mikroskopi modifiye Hoyer çözümü ^15,16 disseke ovüllerin temizleyin. Dikkatle berrak olana kadar oda sıcaklığında (ovül karşılamak için yeterli) Hoyer çözeltisi, küçük bir hacim içinde sağlam ovüllerin ve yeri al.
   4. Diferansiyel girişim kontrast (DIC) optik ile örnekleri görüntüleyin. Bir dijital fotoğraf makinesi ⁹ (Şekil 2) iwth görüntüler çekin.
   5. Pod merkezi bölgesinde en üniforma ovüllerin edinin ve gerekli sayıda birikir. Bir örnek, Şekil 3A'da gösterilmiştir. Daha fazla analiz için gerekli sıcaklıkta buz ve mağaza ovüllerin (-80 ° C için nükleik asitler) toplayın.
      NOT: histolojik kesitlerin analizi, transmisyon elektron mikroskobu ile ilgili detaylar için, ve in situ melezleme kağıtları ^8,9 bakınız.

İn Vitro 2. Somatik Embriyo Gelişimi

1. Bir M. kullanın truncatula çeşidi tŞapka kolaylıkla kültür embriyoları meydana edebilmektedir. Yaprak eksplantlarından için bu protokol için 2-4 aylık olduklarında 2HA bitkiler ^13,17 kullanın.
2. Bir uzatma kök son neredeyse tamamen genişletilmiş üç yapraklı yapraktan broşürler alın.
3. Dehidratasyonu önlemek için bir kültür tencerede nemli kağıt havlu üzerinde üç yapraklı yaprakları tutun.
   NOT: üç yapraklı yaprak hasat edilir sonra da en az gecikmeyle kullanılabilir olması gerekir.
4. Kültür ortamının hazırlanması
   1. 4: 1: agar 5 orta (ağırlık% 0,8: hacim) içinde 9 cm Petri kapları P4 10 kullanın.
      Not: P4 10: 4: 1: 5, orta P4 bazal ortamı ¹⁸ artı 10 uM 1-naftalenasetik asit (NAA), 4 uM 6-benzilaminopurin (BAP), 1 uM absisik asit (ABA) ve 5 uM gibberellik oluşmaktadır asit (GA). GA + ABA kullanımı embriyo oluşumunu hızlandırır ve embriyo sayısı ¹⁴ maddi artışlara neden olmaktadır.
   2. 1 L P4 bazal ortamı Makyaj; (calciu yaptığı büyük tuzlarından oluşan,) ayrı ayrı m minör tuzları ve vitaminler (Tablo 3), şelatlanmış demir (ayrı makyaj), kazamino asitler (kasein hidrolizat), 30 g sakroz, 8 g agar.
   3. Uygun parçalar halinde -20 ° C'de ana tuzlar, kalsiyum, kazamino asitler, minör tuzları ve vitaminler mağazası stok çözeltileri. 4 ° C'de şelatlı demir saklayın.
   4. • 7H FeSO ₄ 1,853 g eklenirken karıştırılırken iyonu giderilmiş damıtma suyu yaklaşık 900 ml _Na2EDTA • 7.44 g 2H ₂ O çözündürülmesiyle şelatlı demir (200x) makyaj, daha sonra 98-99 ° C'ye kadar bir çözüm getirmek ₂ O. Terkip maddeleri, çözündüğü zaman son olarak 1 L tamamlanır. Amber içinde saklayın 4 ° C'de şişe renkli.
   5. Tablo 4'de olduğu gibi hisse senedi çözümleri ile P4 bazal ortamı Makyaj. Ortamda hormonlar 10 uM NAA, 4 iM BAP, 1 uM ABA, 5 mcM GA (Tablo 4 ve Tablo Spesifik Malzeme bakınız). NAA Ekleve önceki BAP otoklavda bir şınngaya bağlanmış bir 0.22 um filtre ile filtre sterilizasyonu, otoklav yaklaşık 55 ° C'ye kadar soğutulduktan sonra, ABA ve GA ekleyin. Nazik dönen ile iyice karıştırın.
   6. Otoklav öncesinde 1 M KOH ile pH 5.8 medyayı ayarlayın. 20 dakika boyunca 121 ° C'de otoklav.
   7. Filtre sterilize ABA ve GA, ekleme ve bir laminer akış kaputu ya da biyolojik tehlike kabine steril 9 cm Petri kapları içine medya yaklaşık 25 ml dökün otoklav sonra. Serin ve ağar kapaklı kapalı olarak ayarlamanıza olanak tanır. Sonra kapağı üzerine koymak ve kapağın üzerinde hiçbir yoğuşma olmadığından emin olun. (Kapak kondens önlemek için bir karton kutu içinde) 4 ° C'de gerekli ve mağaza gibi etiket.
5. Yaprak dokusu sterilizasyonu
   1. UV-sterilize laminer akış kaputu ya da biyolojik tehlike kabine çalışın.
   2. Yeri önceden otoklavlanmış yay çay demlik mesh topun içine bırakır.
   3. Bir cul etanol:% 70 (v v) yaprakları içeren çay demliği daldırın30 saniye boyunca Ture pot.
      NOT: Bu prosedürde tüm adımları kullanın 250 ml otoklavlanırlar kapak polikarbonat kültür tencere vida.
   4. Boşaltın ve daha sonra transferi ve 1 yaprak dokusu sokmak: 8 (hac: hac) ile seyreltilmiş ağartma maddesi (% 0.5 klorin), 10 dakika boyunca karıştırılır. Zaman zaman hafifçe karıştırılır.
   5. Çamaşır suyu boşaltın ve steril deiyonize distile su içeren bir kültür tencerede çay demliği aktarın. Yavaşça girdap ve fazla suyu boşaltın. Steril deiyonize distile su taze kültür pot ile bir kez daha tekrarlayın.
   6. Steril deiyonize damıtılmış su, taze kültür kap steril forseps çay infüzyon edicinin yaprakları çıkarın. Steril kapağını tekrar ve tersini ve dönen tarafından durulayın. Eksplantlar hazırlamak için hazır olana kadar steril su üzerinde yüzen yapraklar bırakın.
6. Eksplantlarındaki hazırlanması ve Kaplama
   1. Steril teknikleri kullanarak, bir neşter ile kenarından bireysel sterilize broşürler Döşeme ve iki ya da thr içine kalan dikdörtgen kesilmişdikdörtgen eksplantlar her eksplant (Şekil 5A) merkezinde orta damar ile (8-10 x 3-5 mm) ee.
      NOT: eksplant büyüklüğü ilk Kalluslaştırma başlatılması oldukça önemlidir. Take-away gıda kapları steril kapaklarındaki kesme yürütmek.
   2. Plaka 9 cm çapında Petri kapları (Şekil 5B) agar-katılaşmış kültür ortamında 6 eksplantlar. Her zamanki yaprak yönünü korumak için aşağı eksplantlar abaxial tarafı Plate.
   3. Yemeğin etrafında gergin Parafilm (Şekil 5C) ile Petri kapları mühür. Doku şimdi inkübasyon için hazırdır.
7. Doku Kuluçka
   1. Kültür süresi boyunca sıcaklığı kontrol edilen bir oda ya da büyüme odasında 28 ° C'de karanlıkta inkübe edin.
      NOT: eksplantlar, dediferansiyonunu başlatmak hücre bölünmesi, çoğalması (kallus oluşumu) ve embriyogenez (farklılaşma) uğrayacaktır.
   2. Farklılaştırarak expla altkültürütaze ortama 3 hafta sonra NTS. Bu altkültür bir laminer akış kaputu ya da biyolojik tehlike kabinede, steril paslanmaz çelik spatula ve forseps kullanılarak tüm eksplant aktarın. Kalluslu oluşur ve kallus Şekil 5C büyük bir boyutunu aşıyor gibi taze ortama alt kültüre zaman bireysel yara dokusunun% 50 transfer.
   3. Yaklaşık 4 hafta içinde ilk embriyoların uyun. Senkronize bir derece olsa da, 4-8 haftalık kuluçka dönemi boyunca farklı embriyo aşamalarını toplamak (Şekil 6A, B). Deneysel hedefleri doğrultusunda bir mikroskop ve işlem altında toplayın.
   4. Eksplantlar 3 ay boyunca embriyo üretmeye devam edeceğiz, böylece her 3 haftada bir altkültürü ve periyodik embriyolar kaldırmak.

Sonuçlar

F - Farklı embriyo aşamaları Şekil 2A gösterilmiştir ise F - Farklı embriyo aşamalarına karşılık gelen zigotik embryogenesis farklı pod yapılarda Şekil 1A gösterilmiştir. Aynı aşamada bakla seçerek, Yumurtacığa örnekleri oldukça tekdüze (Şekil 3A) elde edilebilir ki. RT-qPCR embriyoyu kullanarak belirli genler kolayca algılanır ve zaman derste ⁹ değerlendirilebilir. Bazı ek diseksiyon embriyo

Tartışmalar

açıklanan protokoller oldukça yalındır ve tüm çağdaş hücre ve moleküler teknikler ile baklagil embriyogenezde soruşturma izin verir. Bu avantaj ve in vivo ve in vitro yaklaşımlar hem de dezavantajları vardır tanır. Hem olgunlaşmamış tohumlar ¹⁹ kültürüne göre erken embriyogenez daha fazla odaklanmak sağlar.

In vivo çalışmalarda durumunda neler açıklanan ağırlıklı birçok embriyo çalışmaları için uygundur b?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
P4 medium	Sigma-Aldrich		Use Sigma-Aldrich Chemicals or other analytical grade supplier
Major salts
Minor salts
Vitamins
Agar	Bacto Laboratories	214010	Bacto agar
Plant hormones
1-Naphthaleneacetic acid	Sigma-Aldrich	N0640	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
Abscisic acid	Sigma-Aldrich	A1049	Dissolve in small amount of 1 M NaOH
6-Benzylaminopurine	Sigma-Aldrich	B3274	Dissolve in MQ water with heating and few drops 1N HCl
Gibberellic Acid	Sigma-Aldrich	G7645	Dissolve in small amount of ethanol
Equipment
Stereo dissecting microscope	Leica	MZFLIII	Or similar
Light microscope	Zeiss	Axiophot	Or similar, with suitable optics
Digital camera	Zeiss	AxioCam HRc	Or similar
Sterilising leaves
250 mL screw cap polycarbonate container with polypropylene lid	SARSTEDT	75.9922.519	Autoclavable