JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • النتائج
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

يتم وصف البروتوكولات لدراسة سرطان الثدي هجرة الخلايا وانتشارها والاستعمار في نسيج العظام نظام نموذجي يزدرع البشري.

Abstract

العظام هو الموقع الأكثر شيوعا لالانبثاث سرطان الثدي. على الرغم من أنه من المقبول على نطاق واسع أن سلوك الخلايا السرطانية المكروية التأثيرات، لا يعرف إلا القليل عن سرطان الثدي خصائص الخلية والسلوكيات داخل المكروية الأم من أنسجة العظام البشرية. لقد قمنا بتطوير المناهج لتتبع وقياس وتعدل خلايا سرطان الثدي البشرية داخل المكروية ل مثقف شظايا الأنسجة والعظام البشرية معزولة عن رؤساء الفخذ التخلص التالية إجمالي العمليات الجراحية لاستبدال مفصل الورك. باستخدام خلايا سرطان الثدي هندسيا لو luciferase تعزيز الخضراء بروتين فلوري (EGFP) التعبير، ونحن قادرون ل quantitate بتكاثر الهجرة وانتشار أنماط باستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI)، والتفاعلات خلية المسار داخل شظايا العظام باستخدام المجهر مضان، وتقييم خلايا الثدي بعد الاستعمار مع التدفق الخلوي. المزايا الرئيسية لهذا النموذج ما يلي: 1) من مواليد، microe الأنسجة سليمة معمارياnvironment يتضمن أنواع الخلايا الإنسان ذات الصلة، و2) الوصول المباشر إلى المكروية، مما يسهل الكمية السريعة ومراقبة النوعية واضطراب الثدي والخلايا العظمية الخصائص والسلوكيات والتفاعلات. ومن القيود الأساسية، في الوقت الحاضر، هو قابلية محدودة من شظايا الأنسجة، والتي تحصر نافذة الدراسة إلى الثقافة على المدى القصير. وتشمل تطبيقات في النظام النموذجي دراسة البيولوجيا الأساسية للسرطان الثدي وغيرها من الأورام الخبيثة التي تسعى العظام داخل المتخصصة النقيلي، ووضع استراتيجيات علاجية فعالة لاستهداف خلايا سرطان الثدي في أنسجة العظام.

Introduction

ومن المعترف به على نطاق واسع المكروية الورم بأنه حاسم للسلوك الخلايا السرطانية خلال تطور سرطان الثدي النقيلي وتنتشر 1-3. والهدف من الطريقة المعروضة هنا هو تسهيل دراسة خلايا سرطان الثدي داخل المكروية من النسيج العظمي البشري، الموقع الأكثر شيوعا من سرطان الثدي ورم خبيث 4-6. وتتكون العظام من المقصورات المعادن ونخاع 7-9، وكلاهما تأوي الخلايا وعوامل يفرز المتورطين في تطور النقيلي 10،11. على الرغم من أن تستخدم على نطاق واسع في نماذج الماوس الجسم الحي تسهيل الدراسات المنهجية لعملية النقيلي 12-15، والتفاعلات خلية داخل الهيكل العظمي لا يمكن الوصول إليها بسهولة لمراقبة واضطراب المباشر. نظم نموذج لدراسة وزراعة الأنسجة الماوس العظام وخلايا نخاع الماوس توفر وصول أفضل، وقد أسفرت العديد من الأفكار بشأن الحديث المتبادل والآليات الكامنة وراء خلية سرطان الثدي مetastasis الهيكل العظمي الفئران 16-22. ومع ذلك، فقد أوضحت الدراسات أنه قد يكون هناك أنماط أنواع محددة من osteotropism للأنسجة العظام 23،24. هذه الأنماط يمكن أن تعكس أنواع محددة المتأصلة الاختلافات في خصائص النسيج العظمي، والاختلافات الناجمة عن تغير السكان نخاع العظم في المناعة ناقصة الفئران 11، و / أو سن مبكرة نسبيا من الفئران المستخدمة في التجارب، وكلها المحددات المحتملة للعظم المكروية.

في المختبر النهج لدراسة خلايا سرطان الثدي في الإنسان العظام المشترك الثقافات وركزت عادة على أنواع الخلايا العظمية محددة مثل بانيات المشتقة من نخاع أو خلايا انسجة مثقف كما الطبقات الوحيدة أو داخل النظم نموذج 3-الأبعاد المهندسة 25-35. على الرغم من أن نماذج ثقافة الخلية 2-الأبعاد وقد شكلت الدعامة الأساسية لفي المختبر النهج لأبحاث السرطان، منذ فترة طويلة تم الاعتراف بأن سلوك الخلية يتم تبديل جذري في مonolayer نظم الاستزراع 18،36،37. وقد أدى ذلك إلى تطوير microenvironments المهندسة التي تحاكي تعقيد الأنسجة الحية 3-الأبعاد، بما في ذلك المصفوفة والنماذج القائمة على سقالة مكونة من مواد طبيعية مثل الكولاجين، أو البوليمرات الاصطناعية المصنفة مع أنواع معينة من الخلايا لخلق microenvironments الأنسجة مثل 36-41. وشملت النهج المهندسة أيضا استخدام منصات مفاعل حيوي لمراقبة ودراسة الوسط الهرموني من المكروية 18،19،41-43. على الرغم من أن نماذج المحاكاة البيولوجية والمفاعلات الحيوية توفر العديد من عناصر المكروية الأنسجة المعقدة في الإعداد للرقابة، كما تم تطبيقها بنجاح للمضي قدما في دراسة الانبثاث سرطان الثدي إلى العظام 18،19،35،42،43، نظم نموذج هندسيا لا تتضمن عموما مجموعة كاملة من أنواع الخلايا ومكونات المصفوفة خارج الخلية الحالية ضمن بيئة العظام الأم.

حتى وقت قريب، وسرطان الثديلم تدرس الخلايا داخل، سليمة، المكروية 3-الأبعاد الأصلية للأنسجة العظام البشرية. نحن ذكرت مؤخرا تطوير نموذج التعاون الثقافة باستخدام شظايا الأنسجة والعظام البشرية معزولة عن استبدال مفصل الورك (THR) جراحة العينات 44. هذه العينات تؤوي كل من المقصورات المعادن ونخاع اللازمة لدراسة الآليات الكامنة الصغرى الانبثاث في الثقافة على المدى القصير. في الأعمال السابقة أنشأنا إثبات صحة المبدأ لاستخدام التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI) لمراقبة انتشار خلايا سرطان الثدي، معربا عن luciferase المراسل (MDA-MB-231-fLuc) شارك في تربيتها مع شظايا العظام 44. هنا نقدم تفصيلا البروتوكولات التجريبية لدراسة انتشار خلايا الثدي السرطانية، والاستعمار، والهجرة في سياق المكروية الأم باستخدام إإكسبلنتس النسيج العظمي البشري.

لأول مرة نقدم بروتوكول للمشاركة في زراعة خلايا سرطان الثدي المجاورة لشظايا العظام لقياس الثديتكاثر الخلايا باستخدام BLI. في هذا القسم، والمصنف تعليق خلية الثدي كبقع خلية في 6 لوحات جيدا المجاورة لشظايا العظام، والتي يجمد بواسطة قطعة من الشمع العظام. آبار المراقبة تحتوي على الشمع العظام، ولكن لا شظية العظام. مرة واحدة نعلق البقع الخلية، ويضاف المتوسطة واللوحة هو مثقف لمدة 24 ساعة، وبعد ذلك كثافة إشارة للإضاءة الحيوية (المرتبطة عدد الخلايا) ويقاس مع BLI. في الخطوة التالية نقدم طرق لخلايا سرطان الثدي زراعة شارك المصنف مباشرة على شظايا العظام لدراسة الاستعمار والانتشار. هنا و pipetted تعليق خلية الثدي مباشرة على أجزاء النسيج العظمي، والتي يتم رصدها في الثقافة عن طريق BLI ومضان المجهر مع مرور الوقت لتتبع الاستعمار وعدد الخلايا. في هذه الطريقة، مقصورة نخاع يمكن مسح من شظايا العظام في أي لحظة من الوقت لتحليل خلايا سرطان الثدي مستعمرة من قبل التدفق الخلوي، أو المقايسات الجدوى نخاع.

وبالإضافة إلى ذلك، فإننا ديالكاتب نهجين مختلفين لقياس سرطان الثدي خلية الهجرة. في الطريقة الأولى وترد خطوات لقياس الهجرة نحو supernatants زراعة الأنسجة العظمية. في هذا البروتوكول هي المصنفة في خلايا سرطان الثدي على الداخلية، والسطوح العليا من Transwell إدراج الأغشية مع 8 ميكرون حجم المسام (كما هو موضح في الشكل 1A). ثم يتم وضعها على إدراج في لوحة المتلقي مع الآبار التي تحتوي على طاف النسيج العظمي أو السيطرة المتوسطة. وعلى مدار فترة حضانة 20 ساعة، أعداد صغيرة من خلايا سرطان الثدي تهاجر من خلال الأغشية إدراج أسفل إلى أقل الآبار زراعة الأنسجة حيث يعلقونها للكشف من قبل BLI. في طريقة الهجرة الثانية هي المصنفة في خلايا سرطان الثدي على الدنيا، الأسطح الخارجية للTranswell الأغشية إدراج. توضع شظايا النسيج العظمي في أكواب إدراج وخلايا سرطان الثدي تهاجر من خلال الأغشية لاستعمار شظايا العظام (كما هو موضح في الشكل 1B)، والتيثم يتم تصويرها باستخدام BLI.

Protocol

تم جمع رؤساء الفخذ من المرضى الذين يخضعون لجراحة THR الاختيارية في قسم جراحة العظام في كلية الطب بجامعة ستانفورد. تم جمع جميع الأنسجة كما العينات التي تم تحديدها دي وفقا للوائح مكتب الالتزام بحوث جامعة ستانفورد.

1. اختيار الخط سرطان الثدي خلية (ق)

  1. الحصول على أو بالنقل خط خلايا سرطان الثدي المطلوب (ق) مع luciferase المراسل-GFP مراسل بناء. وأجريت التجارب التالية باستخدام MDA-MB-231 وMCF-7 سرطان الثدي خطوط الخلايا المهندسة للتعبير مستقر من يراعة luciferase (fLuc) وتعزيز البروتين الفلوري الأخضر (EGFP) من خلال ترنسفكأيشن مع الجمال النائم ينقول بلازميد pKT2 / LuBiG وPK ترانسبوزاز بلازميد / hUbiC-SB11 45،46.
    ملاحظة: يتم أشار خطوط الخلايا transfected باسم MDA-MB-231-fLuc-EGFP، وMCF-7-fLuc-EGFP.

2. عزل الأنسجة Fragments من رؤساء الفخذ

  1. بعد الجراحة THR، وجمع رأس الفخذ التخلص منها في حاوية معقمة مليئة المالحة الفسيولوجية. نقل العينة إلى المختبر ومعالجته ضمن 1-3 ساعة من الجراحة. ملاحظة: إذا كان هناك تأخير في المعالجة، ووضع العينة في 4 درجات مئوية.
  2. إعداد منطقة العمل عن طريق وضع العناصر التالية على حصيرة ماصة في تدفق الصفحي غطاء نسيج الثقافة: قفازات معقمة، مقراض جراحي، ملقط، دورق مع 70٪ الأيزوبروبانول لشطف الأدوات، والسفن زراعة الأنسجة كما هو منصوص عليه أدناه لكل نوع من التجربة .
  3. يرتدي القفازات الجراحية المعقمة لعقد رئيس عظم الفخذ المستديرة في يد واحدة، استخدم مقراض في جهة أخرى لاستخراج شظايا العظام التربيقية من الحجم المطلوب (~ 2-5 ملم) من رمح العلوي المكشوفة من عظم الفخذ. نقل شظايا العظام في سفينة الثقافة (على سبيل المثال، 6-، 12-، أو 24 بئرا لوحة زراعة الأنسجة أو غرفة الهجرة)، وهذا يتوقف على نوع من الانتشار النووي، العقيدonization أو الهجرة التجربة، كما هو موضح في الخطوات من 3 أو 4 أو 5.
    ملاحظة: شظايا العظام الأنسجة يجب أن تحصد كما هو موضح أعلاه بعد إكمال الخطوات الأولية لكل انتشار والاستعمار أو الهجرة فحص معين. سوف شظايا تتراوح في حجمها كما هو مبين في الشكل (2). شظايا يمكن أن يكون وزنه قبل أو بعد عدة تجارب لغرض توحيد.

3. زراعة المشارك خلايا سرطان الثدي المجاورة لشظايا العظام لقياس الثدي انتشار الخلية باستخدام BLI

  1. قبل التجربة، وإعداد تعليق يحتوي على 2 × 10 5 خلايا سرطان الثدي / 50 ميكرولتر، وإعداد شمعات من الشمع العظام لشل حركة شظايا العظام في الثقافة. قطع رأس P200 micropipette في 3 قطع واستخدام نهاية الضيقة من أكبر قطعة في "قطع الكعكة" بطريقة لقطع صغيرة (~ 35 ملغ) قطعة من الشمع العظام. استخدام نهاية واسعة من أصغر قطعة لإخراج المقابس الشمع العظام في طبق بتريللتخزين.
  2. ضع قطعة من الشمع العظام في موقف 12:00 من كل بئر واضغط بلطف إلى أسفل مع السبابة معقم-القفاز.
  3. ماصة 50 ميكرولتر من تعليق خلية تحتوي على 1 × 10 5 خلايا سرطان الثدي في DMEM 10٪ FBS + القلم بكتيريا في وسط كل بئر من لوحة 6 جيدا. (بدلا من ذلك، وخلايا البذور في نمط فرقت اذا شئت.) وضع لوحة في 37 درجة مئوية نسيج الثقافة الحاضنة لمدة 45 دقيقة إلى تعزيز مرفق الخلية.
  4. وضع جزء 1 العظام على 1 قطعة من الشمع العظام لكل بئر تجريبي وتطبيق ضغط لطيف مع مقراض لضمان الحصول عليها. إجراء تجارب في ثلاث نسخ توضع مثل أن 3 شظايا العظام من عينة THR نظرا الى أعلى ثلاثة آبار، في حين أن ثلاثة آبار السفلية تحتوي على الشمع العظام فقط والضوابط.
  5. باستخدام ماصة 5 مل، برفق وببطء تقديم 5 مل من DMEM 10٪ FBS إلى جانب كل بئر لتجنب طرد الخلايا الثدي أو شظايا العظام. وضع لوحة في 3776، C الأنسجة ثقافة حاضنة لل20-24 ساعة.
  6. لأداء التصوير تلألؤ بيولوجي (BLI) إزالة لوحة من الحاضنة وإضافة الركيزة luciferin (لتحقيق تركيز من 300 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر. صورة لوحة فورا على منصة التصوير IVIS باستخدام المعلمات التالية: F توقف 1، binning صغير، وقت التعرض لل 1 ثانية، ومستوى D. قياس كثافة إشارة من كل جانب متوسط ​​الاشعاع (الفوتونات / ثانية / سنتيمتر مربع / ستيراديان).
  7. استخدام برامج التصوير لتحديد المناطق ذات الاهتمام (ROI) ل quantitate متوسط ​​الاشعاع لجميع الآبار التجريبية والضابطة. تصدير متوسط ​​قيم الاشعاع لورقة اكسل لأداء الإحصاءات وتوليد الرسوم البيانية.

4. زراعة المشارك خلايا سرطان الثدي المصنف مباشرة على شظايا العظام لدراسة الاستعمار وعدد الخلايا

  1. استخدام ملقط لوضع شظايا العظام مباشرة في الآبار الفارغة ل24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة (1 جزء / جيد).
  2. بذرةETTE 50 ميكرولتر تعليق الخلية قطرة من DMEM 10٪ FBS تحتوي على 1 X 03-06 أكتوبر خلايا سرطان الثدي مباشرة على رأس كل منهما جزء العظام. وضع لوحة في 37 درجة الأنسجة C ثقافة حاضنة لمدة 45 دقيقة إلى تعزيز مرفق الخلية. إضافة بلطف 1-2 مل DMEM 10٪ FBS إلى جانب كل هذا جيدا أن شظية وغمرت تماما في المتوسط. احتضان لوحة في 37 ° C الأنسجة ثقافة حاضنة لل20-24 ساعة.
  3. بعد الحضانة، واستخدام ملقط لنقل كل جزء أنسجة العظام لوحة 24-جيدا الطازجة التي تحتوي على 1 مل DMEM 10٪ FBS في كل بئر. لأداء BLI، اتبع الخطوات 3،6-3،7 أعلاه. بالإضافة إلى ذلك، يمكن اعتبار أجزاء باستخدام مجهر مضان، أو مسح للحصول على السكان نخاع لتحليل أرقام خلايا سرطان الثدي والممتلكات كما هو موضح في الخطوة 6.
  4. لإعداد شظايا سليمة للتقييم النوعي بواسطة المجهر مضان التالية BLI، ماصة 5 ميكرولتر من الفلورسنت حل وضع العلامات البايفوسفونيت (ما قبلقلص وفقا لتعليمات الشركة الصانعة) في كل بئر لتسمية شويكات المعدنية من شظايا العظام. احتضان لوحة في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 24 ساعة أخرى.
  5. وبعد 24 ساعة من الثقافة في الفلورسنت حل وضع العلامات البايفوسفونيت، واستخدام ملقط لنقل شظايا لوحات زراعة الأنسجة التي تحتوي على الفينول الحمراء الخالية المتوسطة وعرض باستخدام مجهر مضان تكوينها لGFP صورة (485 نانومتر) والتسمية البايفوسفونيت (680 نانومتر).

5. قياس الهجرة من خلايا سرطان الثدي إلى أجزاء الأنسجة والعظام ومثقف العظام جزء Supernatants

  1. الهجرة نحو أنسجة العظام الثقافة طاف.
    ملاحظة: إجراء تجارب في ثلاث نسخ بحيث 3 شظايا من عينة THR معين وتستخدم لتوليد 3 supernatants. لكل تجربة، تتم مقارنة الهجرة عبر ثلاث آبار تحتوي على supernatants العظام مقابل ثلاثة آبار تحتوي على السيطرة المتوسطة فقط.
    1. توليد تيس العظاممقاضاة supernatants من خلال وضع شظايا العظام في آبار من لوحة 12-جيدا تحتوي على 2.2 مل DMEM 10٪ FBS لكل بئر. الثقافة في 37 ° C الأنسجة ثقافة حاضنة لمدة 24 ساعة. سحب متوسطة على مدار 24 ساعة واستبدالها مع 2.2 مل الطازجة٪ FBS DMEM-10. آبار المراقبة علاج تحتوي على DMEM 10٪ FBS بنفس الطريقة.
      ملاحظة: يتم تغيير المتوسطة في 24 ساعة لإزالة العوامل يفرز استجابة لصدمة الأنسجة الناتجة من عملية جراحية. لأنه يتم إنشاؤها supernatants النسيج العظمي في FBS تحتوي المتوسطة والآبار التي تحتوي على FBS التي تحتوي على المتوسطة مدرجة فقط للسيطرة على مساهمات FBS للهجرة خلايا سرطان الثدي.
    2. في 48 ساعة، وجمع 0.9 مل من كل طاف / تحكم المتوسطة وماصة في آبار من لوحة الاستقبال. سيتم لاحقا وضع تدرج في هذه الآبار. احتضان لوحة الاستقبال في الثقافة حاضنة الأنسجة في حين بذر تدرج. ملاحظة: طاف المتبقية (~ 1 مل بعد التبخر) يمكن جمعها لتحليل الواقع secretomeالتمرير إذا رغب 44.
    3. البذور يدرج Transwell، ووضعها في معيار، فارغة 24-جيدا لوحة زراعة الأنسجة. ماصة 350 ميكرولتر تعليق الخلية التي تحتوي على 1 × 10 5 خلايا سرطان الثدي في DMEM 10٪ FBS على العلوي، داخل سطح غشاء من كل إدراج كما هو مبين في الشكل 1A. وضع لوحة 24-جيدا تحتوي على إدراج المصنفة في 37 ° C زراعة الأنسجة حاضنة لمدة 45 دقيقة من أجل تعزيز المرفق.
    4. مرة واحدة وقد أرفقت الخلايا إلى إدراج، واستخدام ملقط لنقل إدراج لوحة المتلقي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. زاوية كل إدراج عندما وضعها في جهاز الاستقبال جيدا لمنع تشكيل فقاعة بين الغشاء إدراج والمتلقي طاف جيدا. احتضان لوحة الاستقبال مع تدرج لمدة 20 ساعة في 37 ° C الأنسجة الثقافة الحاضنة.
      ملاحظة: تحقق الجانب السفلي من لوحة المتلقي لفقاعات بين الغشاء إدراج والمتلقي supernatan جيدار. إذا فقاعات واضحة، وإزالة إدراج محددة ووضعها مرة أخرى إلى المتلقي بشكل جيد حتى موجودة جود فقاعات.
    5. بعد 20 ملقط استخدام ساعة لإزالة إدراج من لوحة الاستقبال. باستخدام الإجراءات في الخطوات 3،6-3،7 أداء BLI لصورة الخلايا التي هاجروا إلى وتعلق على الجزء السفلي من الآبار لوحة الاستقبال.
  2. الهجرة نحو شظايا النسيج العظمي.
    توضع إجراء تجارب في ثلاث نسخ بحيث 3 شظايا من عينة THR بالنظر إلى 3 إدراج منفصلة، ​​وتوضع 3 الخرز الزجاجي إلى 3 إدراج منفصلة الضوابط: ملاحظة.
    1. إعداد لوحة الاستقبال من قبل pipetting 0.9 مل DMEM 10٪ FBS في كل بئر. وضعه في الثقافة حاضنة الأنسجة أثناء إعداد تدرج.
    2. إلى البذور وإدراج، عكس لهم على سطح microfuge أنبوب مربع من البلاستيك يحتوي على غطاء. ماصة 50 ميكرولتر تعليق الخلية قطرة من DMEM 10٪ FBS تحتوي على 1 × 10 5 خلايا سرطان الثدي دirectly على، السطح السفلي الخارجي من كل غشاء إدراج (والذي هو مواجهة على إدراج المقلوب). تغطية مربع microfuge أنبوب مع غطاء تصدع مفتوحة وتحويلها إلى 37 درجة مئوية الحاضنة الأنسجة لمدة 45 دقيقة إلى تعزيز مرفق الخلية.
    3. نقل مربع microfuge أنبوب إلى نسيج الثقافة هود، واستخدام ملقط لتحويل إدراج المصنفة الجانب الأيمن حتى ونقلها إلى الآبار من لوحة الاستقبال. ماصة 0.450 مل DMEM 10٪ FBS في كل كوب إدراج. باستخدام ملقط، ونقل جزء واحد أنسجة العظام (~ 3 ملم) في كل كوب إدراج استعداد. اختياريا، واستخدام الخرز الزجاجي ضوابط السلبية كما في آبار إضافية. وضع لوحة في ثقافة حاضنة الأنسجة لمدة 20 ساعة.
    4. لقياس الهجرة، وإعداد 24-جيدا القياسية لوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على 1 مل DMEM 10٪ FBS لكل بئر. إزالة لوحة الاستقبال من الحاضنة واستخدام ملقط لنقل شظايا العظام وحبات من كل إدراج في آبار منفصلة من لوحة القياسية. إضافة وسيفيرينالركيزة (لتحقيق تركيز النهائي من 300 ميكروغرام / مل) إلى كل بئر وتنفيذ BLI باستخدام الإجراءات في الخطوات 3،6-3،7.

6. قبل وبعد التجريبية تحليلات إضافية

  1. تحليل نخاع مسح.
    1. نقل جزء العظام في مصفاة الخلية 70 ميكرومتر وضعها في أعلى 50 مل أنبوب مخروطي الشكل. استخدام حقنة 10 مل مع إبرة 25 G لطرد بقوة جزء مع 10 مل من برنامج تلفزيوني للحصول على تعليق من خلايا نخاع في أنبوب مخروطي الشكل. الطرد المركزي تعليق خلية لمدة 3 دقائق في 300 x ج و 21 درجة مئوية، ونضح وطاف resuspend الخلايا مكعبات في برنامج تلفزيوني أو حل آخر المطلوبة للالتدفق الخلوي.
      ملاحظة: تختلف أحجام إعادة تعليق اعتمادا على حجم بيليه الخلية بعد الطرد المركزي، والتطبيق.
    2. لفحوصات قابلية ~ 75-300 حجم ميكرولتر من PBS مناسبة، ويمكن تحليلها باستخدام هذه المعلقات fluorescenc المتاحة تجارياالبريد المقايسات الحيوية مقرها وفقا لتعليمات الشركة الصانعة، pipetted في عدادة الكريات التقليدية، وتحسب باستخدام مجهر مضان مقلوب.
    3. لتحليل تدفق cytometric أو الفرز على أساس الكشف عن خلايا سرطان الثدي GFP إيجابية، resuspend الكرية خلية في 1 مل PBS تحتوي على 2٪ FBS، 2mm و EDTA، و 10 ملي HEPES مثل أن تركيز هو 1 × 10 6 خلية / مل.
  2. H & E تلطيخ والمناعية.
    1. لمعالجة شظايا لالهيماتوكسيلين ويوزين (H & E) تلطيخ و / أو المناعية، ضع شظايا في أشرطة بلاستيكية المسمى مع قلم رصاص رقم 2، ويغرق في حاوية مليئة 10٪ من الفورمالين مخزنة لمدة 24 ساعة.
    2. الأنسجة عملية البارافين التضمين، باجتزاء وتلطيخ باستخدام بروتوكولات الروتينية التي تشمل خطوة زوال الكلس لحساب شويكات المعدنية داخل كل جزء.

النتائج

عزل شظايا الأنسجة من رؤساء الفخذ

تم جمع رؤساء الفخذ من أعداد متساوية من الذكور والإناث من المرضى (44-90 عاما) يخضع الاختيارية مجموع جراحة استبدال مفصل الورك في قسم جراحة العظام في كلية الطب بجامعة ستانفورد. يحتوي كل رأس الفخذ التخلص...

Discussion

ميهرا وآخرون. وقد سبق وصفها جمع بعد الوفاة وتحليل عينات العظام من مرضى سرطان البروستاتا النقيلي حصادها في وقت تشريح الجثة، وكشف عن الأنسجة عالية الجودة والتحقق من صحة استخدام عينات العظام البشرية لدراسة عملية النقيلي 47. هنا وصفناها بروتوكولات لجمع ومعالج...

Disclosures

No disclosures to report.

Acknowledgements

وقد تم تمويل هذه الدراسات، في جزء منه، من المنح المقدمة من مؤسسة البديل بحوث والتنمية (107588)، والمعهد الوطني للصحة (1U54CA136465-04S1)، وبرنامج بحوث سرطان الثدي كاليفورنيا (201B-0141). نشكر الدكاترة. أندرو ويلبر وR. سكوت ماكيفور للتبرع السخي من هم transponson وPK / hUbiC-SB11 البلازميدات ترانسبوزاز. ونحن نعترف بامتنان جون Tamaresis، دكتوراه للحصول على المشورة على الأساليب الإحصائية، تيموثي براون لأداء التدفق الخلوي، جورجيت هنريك لتقديم المشورة بشأن الهجرات المقايسات، ونانسي Bellagamba لتسهيل جمع العينات THR.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM (1X) + GlutaMAX-lLife Technologies10569-010Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
McCoy's 5A Medium (1X)Life Technologies16600-082Supplement all McCoy's  with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
Fetal bovine serumLife Technologies16000-044
Penicillen StreptomycinLife Technologies15140-122
Blastocidin (10 mgl/ml)InvivoGen ant-blSupplement media used for transfected cell lines.
Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size)Corning Incorporated353097
Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion PlateCorning Incorporated353504
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*Invitrogen Detection TechnologiesL-3224
FluoroBrite DMEMLife TechnologiesA18967-01
D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml)Life TechnologiesL-8220
Sterile Cell Strainer 70 μmFisher Scientific22363548
6 Well TC-Treated Cell Culture ClusterCorning Incorporated3516
12 Well TC-Treated Cell Culture ClusterCorning Incorporated3513
24 Well TC-Treated Cell Culture ClusterCorning Incorporated3526
Friedman-Pearson RongeurFine Science Tools16021-14
Bone waxSurgical Specialties Corporation903
IVIS 50 Imaging PlatformCaliper Life Sciences/PerkinElmer
Living Image Software Program Caliper Life Sciences/PerkinElmer133026
EVOS FL Imaging SystemLife TechnologiesVersion 4.2
OsteoSense 680 EXPerkinElmerNEV10020EX
MCF-7 breast cancer cellsATCCHTB-22
MDA-MB-231 breast cancer cellsATCCHTB-26
Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibodyDAKO CytomationClone (AE1/AE3)

References

  1. Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13, 227 (2011).
  2. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
  3. Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat Rev Cancer. 1, 46-54 (2001).
  4. Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. British journal of cancer. 55, 61-66 (1987).
  5. Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nat Rev Cancer. 2, 584-593 (2002).
  6. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  7. Clarke, B. Normal bone anatomy and physiology. Clin J Am Soc Nephrol. 3, S131-S139 (2008).
  8. Weatherholt, A. M., Fuchs, R. K., Warden, S. J. Specialized connective tissue: bone, the structural framework of the upper extremity. Journal of hand therapy : official journal of the American Society of Hand Therapists. 25, 123-131 (2012).
  9. Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicologic pathology. 34, 548-565 (2006).
  10. Casimiro, S., Guise, T. A., Chirgwin, J. The critical role of the bone microenvironment in cancer metastases. Molecular and cellular endocrinology. 310, 71-81 (2009).
  11. Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7, 1285-1297 (2011).
  12. Goldstein, R. H., Weinberg, R. A., Rosenblatt, M. Of mice and (wo)men: mouse models of breast cancer metastasis to bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 25, 431-436 (2010).
  13. Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and biophysical research communications. 394, 443-447 (2010).
  14. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
  15. Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer metastasis reviews. 33, 721-735 (2014).
  16. Schiller, K. R., et al. Secretion of MCP-1 and other paracrine factors in a novel tumor-bone coculture model. BMC Cancer. 9, 45 (2009).
  17. Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex-vivo co-cultures of live calvarial bones and cancer cells. Biomaterials. 33, 1065-1078 (2012).
  18. Krishnan, V., et al. Dynamic interaction between breast cancer cells and osteoblastic tissue: comparison of two- and three-dimensional cultures. Journal of cellular physiology. 226, 2150-2158 (2011).
  19. Krishnan, V., Vogler, E. A., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. In vitro mimics of bone remodeling and the vicious cycle of cancer in bone. Journal of cellular physiology. 229, 453-462 (2014).
  20. Bussard, K. M., Venzon, D. J., Mastro, A. M. Osteoblasts are a major source of inflammatory cytokines in the tumor microenvironment of bone metastatic breast cancer. Journal of cellular biochemistry. 111, 1138-1148 (2010).
  21. Sosnoski, D. M., Krishnan, V., Kraemer, W. J., Dunn-Lewis, C., Mastro, A. M. Changes in Cytokines of the Bone Microenvironment during Breast Cancer Metastasis. International journal of breast cancer. 2012, 160265 (2012).
  22. Bussard, K. M., et al. Localization of osteoblast inflammatory cytokines MCP-1 and VEGF to the matrix of the trabecula of the femur, a target area for metastatic breast cancer cell colonization. Clinical & experimental metastasis. 27, 331-340 (2010).
  23. Kuperwasser, C., et al. A mouse model of human breast cancer metastasis to human bone. Cancer research. 65, 6130-6138 (2005).
  24. Rosenblatt, M. A tale of mice and (wo)men: development of and insights from an 'all human' animal model of breast cancer metastasis to bone. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 123, 135-150 (2012).
  25. Oh, H. S., et al. Bone marrow stroma influences transforming growth factor-beta production in breast cancer cells to regulate c-myc activation of the preprotachykinin-I gene in breast cancer cells. Cancer research. 64, 6327-6336 (2004).
  26. Moharita, A. L., et al. SDF-1alpha regulation in breast cancer cells contacting bone marrow stroma is critical for normal hematopoiesis. Blood. 108, 3245-3252 (2006).
  27. Koro, K., et al. Interactions between breast cancer cells and bone marrow derived cells in vitro define a role for osteopontin in affecting breast cancer cell migration. Breast cancer research and treatment. 126, 73-83 (2011).
  28. Pohorelic, B., et al. Role of Src in breast cancer cell migration and invasion in a breast cell/bone-derived cell microenvironment. Breast cancer research and treatment. 133, 201-214 (2012).
  29. Nicola, M. H., et al. Breast cancer micrometastases: different interactions of carcinoma cells with normal and cancer patients' bone marrow stromata. Clinical & experimental metastasis. 20, 471-479 (2003).
  30. Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin alpha5beta1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer research. 64, 4514-4522 (2004).
  31. Martin, F. T., et al. Potential role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the breast tumour microenvironment: stimulation of epithelial to mesenchymal transition (EMT). Breast cancer research and treatment. 124, 317-326 (2010).
  32. Kapoor, P., Suva, L. J., Welch, D. R., Donahue, H. J. Osteoprotegrin and the bone homing and colonization potential of breast cancer cells. Journal of cellular biochemistry. 103, 30-41 (2008).
  33. Chen, X., Lu, J., Ji, Y., Hong, A., Xie, Q. Cytokines in osteoblast-conditioned medium promote the migration of breast cancer cells. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine. 35, 791-798 (2014).
  34. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35, 2454-2461 (2014).
  35. Marlow, R., et al. A novel model of dormancy for bone metastatic breast cancer cells. Cancer research. 73, 6886-6899 (2013).
  36. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
  37. Hutmacher, D. W., et al. Can tissue engineering concepts advance tumor biology research. Trends in biotechnology. 28, 125-133 (2010).
  38. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 211-224 (2006).
  39. Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature. 9, 90-93 (2010).
  40. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in cancer biology. 15, 365-377 (2005).
  41. Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology advances. 32, 1256-1268 (2014).
  42. Dhurjati, R., Krishnan, V., Shuman, L. A., Mastro, A. M., Vogler, E. A. Metastatic breast cancer cells colonize and degrade three-dimensional osteoblastic tissue in vitro. Clinical & experimental metastasis. 25, 741-752 (2008).
  43. Mastro, A. M., Vogler, E. A. A three-dimensional osteogenic tissue model for the study of metastatic tumor cell interactions with bone. Cancer research. 69, 4097-4100 (2009).
  44. Contag, C. H., et al. Monitoring dynamic interactions between breast cancer cells and human bone tissue in a co-culture model. Molecular imaging and biology : MIB : the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 16, 158-166 (2014).
  45. Multhaup, M., et al. Cytotoxicity associated with artemis overexpression after lentiviral vector-mediated gene transfer. Human gene therapy. 21, 865-875 (2010).
  46. Thorne, S. H., et al. CNOB/ChrR6, a new prodrug enzyme cancer chemotherapy. Mol Cancer Ther. 8, 333-341 (2009).
  47. Mehra, R., et al. Characterization of bone metastases from rapid autopsies of prostate cancer patients. Clin Cancer Res. 17, 3924-3932 (2011).
  48. Riccio, A. I., Wodajo, F. M., Malawer, M. Metastatic carcinoma of the long bones. Am Fam Physician. 76, 1489-1494 (2007).
  49. Ahmann, G. J., et al. Effect of tissue shipping on plasma cell isolation, viability, and RNA integrity in the context of a centralized good laboratory practice-certified tissue banking facility. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 17, 666-673 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

97 osteotropism

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved