培養ヒト大腿骨組織外植するための方法は、転移性ニッチの乳癌細胞コロニー形成を研究する

要約

プロトコルは、ヒト骨組織外植片モデル系において乳癌細胞の移動、増殖およびコロニー形成を研究するために記載されている。

要約

骨は、乳癌転移の最も一般的な部位である。それは広く微小環境に影響を与える癌細胞の挙動が認められているものの、ほとんどは人間の骨組織の天然の微小環境内での乳癌細胞の特性および動作について知られている。我々は、追跡定量化の微小環境内でのヒト乳癌細胞を調節するためのアプローチを開発した人工股関節全置換手術の後に廃棄された大腿骨頭から単離された培養されたヒト骨組織断片。ルシフェラーゼおよび強化緑色蛍光タンパク質（EGFP）発現のために操作乳癌細胞を用いて、我々は、再現性生物発光イメージング（BLI）を用いて、遊走および増殖パターンを定量することができ、蛍光顕微鏡を用いて、骨片内のトラックの細胞の相互作用、および後の乳癌細胞を評価するフローサイトメトリーでのコロニー形成。このモデルの主な利点は、1）ネイティブ、アーキテクチャ的に無傷組織のマイクロE関連するヒト細胞型を含み、かつ迅速な定量的および定性的な監視と乳癌および骨細胞の性質、行動や相互作用の摂動を促進する微小環境、2）直接アクセスnvironment。主要な制限は、現在では、短期培養の研究のウィンドウを閉じ込める組織断片、有限の生存能力である。モデルシステムのアプリケーションは、乳癌および転移性のニッチ内の他の骨求め悪性疾患の基礎生物学を研究し、効果的に骨組織中の乳癌細胞を標的とする治療戦略の開発を含む。

概要

腫瘍微小環境は広く、乳癌の進行および転移拡散^1-3中の癌細胞の挙動の重要な決定因子として認識されている。ここに提示された方法の目的は、人間の骨組織、乳癌転移^4-6の最も頻繁な部位の微小環境内での乳癌細胞の研究を容易にすることである。骨は、細胞と転移進行^10,11に関与する分泌因子を抱くどちらも、鉱化と骨髄コンパートメント^7-9で構成されている。広く生体マウスモデルで使用されるが、転移プロセス^12-15の全身研究を促進、スケルトン内の細胞の相互作用は観察と直接摂動のために容易にアクセスすることはできません。マウス骨髄組織およびマウス骨髄細胞がより良いアクセスを提供し、クロストークおよび乳癌セルmのメカニズムに関する多くの知見が得られている研究及び培養するためのモデル系ネズミスケルトン^16-22のetastasis。しかし、研究は、骨組織^23,24のためosteotropismの種特異的なパターンが存在し得ることを示唆している。これらのパターンは、骨の可能性の決定因子である全てが骨組織の特性に固有の種特異的な差異は、免疫欠損マウス^11、及び/又は実験に使用したマウスは、比較的若い年齢で変化した骨髄集団から得られた差を反映している可能性が微小環境。

インビトロでは 、典型的には、骨髄由来の骨芽細胞または単層として培養された間質細胞として、または操作された3次元モデル系^25〜35内の特定の骨の細胞型に焦点を当ててきたヒト骨共培養において乳癌細胞を研究するために近づく。 2次元の細胞培養モデルは、in vitroでの柱を形成し、がん研究のために近づいているが、それは長い細胞の挙動は基本メートルに変更されることが認識されている培養系^18,36,37 onolayer。これは、コラーゲンのような天然材料からなるマトリックス - 足場ベースのモデルを含む3次元の生体組織の複雑性を模倣工学的微小環境が開発された、または合成ポリマーが組織様微小環境を作成するために特定の細胞型を播種^36-41。工学的ア ​​プローチも制御し、微小環境^18,19,41-43のホルモン環境を研究するためのバイオリアクタープラットフォームの使用が含まれている。バイオミメティックモデル及びバイオリアクターを制御する設定で複雑 ​​な組織微小環境の多くの要素を提供し、成功した骨^{18,19,35,42,43}の乳癌転移の研究を進めるために適用されているが、操作されたモデル系は、一般的に内蔵されていない天然の骨の環境内に存在する細胞型および細胞外マトリックス成分の全スペクトル。

最近まで、乳癌細胞は、ヒト骨組織の天然の、無傷の、3次元微小環境内で検討されていない。我々は最近、（THR）手術が⁴⁴標本人工股関節全置換から単離されたヒト骨組織フラグメントを用いた共培養モデルの開発を報告した。これらの標本は、短期培養でマイクロ転移のメカニズムを研究するために必要な鉱化と骨髄コンパートメントの両方を抱く。以前の研究では、骨片^{44（MDA-MB-231-Fluc}細胞）とを共培養し、ルシフェラーゼを発現する乳癌細胞の増殖をモニターするために生物発光イメージング（BLI）を使用するための原理の証明を確立した。ここでは、乳癌細胞癌の増殖、コロニー化、及びヒト骨組織外植片を使用して、ネイティブの微小環境のコンテキスト内での移行を研究するための詳細な実験プロトコルを提示する。

まず、乳房を測定するための骨片に隣接する共培養乳癌細胞のためのプロトコルを提示BLIを使用して細胞増殖。このセクションでは、乳房の細胞懸濁液を骨ろう片により固定される骨片に隣接する6ウェルプレート中の細胞スポットとして播種する。対照ウェルは、骨のワックス、ない骨片が含まれている。セルスポットがアタッチすると、培地を添加し、プレートをBLIにより測定される生物発光シグナル強度（細胞数に関連する）、その後24時間、培養されている。次のステップでは、コロニー形成および増殖を研究するために、骨片に直接播種共培養乳癌細胞のための方法を提示する。ここでは、乳房細胞懸濁液をコロニー形成細胞数を追跡するために時間をかけてBLI、蛍光顕微鏡により培養物中に監視された骨組織断片上に直接ピペットで移す。この方法では、骨髄区画は、フローサイトメトリー、または骨髄生存率アッセイによりコロニー形成さ乳癌細胞の解析のために任意の時点での骨片から洗い流すことができる。

さらに、我々はデ乳癌細胞遊走を測定するための2つの異なるアプローチをスクライブ。第一の方法のステップは、骨組織培養上清に向かって移動を測定するために概説されている。このプロトコルでは、乳癌細胞は、内側に播種され、トランスウェルの上面は、（ 図1Aに示されるように）8μmの孔径を有する膜を挿入する。挿入物は、次いで、骨組織上清または対照培地を含有するウェルを有する受け板内に配置される。 20時間のインキュベーション期間にわたって、乳癌細胞の少数がダウンそれらがBLIによる検出に取り付ける下部組織培養ウェルへの挿入膜を通って移動する。第二の移行方法で乳癌細胞をトランスウェルインサート膜の下側、外表面上に播種される。骨組織断片を挿入カップおよび乳癌細胞内に配置される（ 図1Bに示すように）骨片にコロニーを形成するために、膜を通って移行し、これその後、BLIを使用して画像化される。

プロトコル

大腿骨頭は、スタンフォード大学医学部での整形外科学科の選択科目THR手術を受けている患者から採取した。すべての組織は、スタンフォード大学の研究コンプライアンス室の規則に従って匿名化検体として採取した。

1。乳癌細胞株（複数可）を選択する

1. 取得またはルシフェラーゼ-GFPレポーター構築物を有する所望の乳癌細胞株（複数可）をトランスフェクトする。以下の実験は、 スリーピングビューティートランスポゾンプラスミドPKT2 / LuBiGトランスフェクションすることによってMDA-MB-231およびMCF-7乳癌細胞株ホタルルシフェラーゼを安定に発現するように操作（Fluc細胞）および高感度緑色蛍光タンパク質（EGFP）を用いて行った。とトランスポザーゼプラスミドPK / hUbiC-SB11 ^45,46。
   注：トランスフェクトされた細胞株は、MDA-MB-231-Flucを-EGFPおよびMCF-7-Fluc細胞-EGFPと呼ばれている。

2.組織Fの分離大腿ヘッドからragments

1. THR手術後、生理食塩水で満たされた無菌の容器に廃棄された大腿骨頭を収集する。研究所に検体を移し、手術の1-3時間以内にそれを処理する。注：処理の遅延がある場合には、4℃で試料を置く。
2. 実験の各タイプについては、以下に定める滅菌手袋、外科鉗子、ピンセット、器具をすすぐために、70％イソプロパノールでビーカー、および組織培養容器：層流の組織培養フード内で吸収マットの上、以下の項目を配置することによって、作業領域を準備する。
3. 無菌手術用手袋を身に着けていることは、片方の手で丸い大腿骨ヘッドを保持する大腿骨の露出した上軸から希望のサイズ（〜2〜5ミリメ​​ートル）の小柱骨片を抽出する一方で骨鉗子を使用する。増殖のタイプに応じて、培養容器（ 例えば、6-、12-、または24ウェル組織培養プレートまたは遊走チャンバー）内に骨片を移し、コルonizationまたは遊走実験手順3、4または5に記載の方法。
   注：上記のように骨組織断片は、それぞれ特定の増殖、コロニー化または移行アッセイのための最初のステップを完了した後に収穫する必要があります。 図2に示すように、断片は、サイズの範囲であろう。フラグメントの前または標準化の目的のために実験後に秤量することができる。

BLIを使用して、乳房細胞増殖を測定する骨の断片に隣接3.共培養乳癌細胞

1. 実験の前に、/50μlの2×10 ⁵乳癌細胞を含有する懸濁液を調製し、培養物中の骨片を固定するための骨ワックスのプラグを用意する。 3ピースにP200のマイクロピペットチップをカットし、骨ワックスの小さい（〜35 mg）の作品をカットする「クッキーカッター」の方法で最大の作品の狭い方の端を使用しています。ペトリ皿に骨ろうプラグを排出する最小単位の広い方の端を使用してくださいストレージ用。
2. 各ウェルの12時の位置に骨ろうの部分を置き、静かに滅菌手袋をはめた人差し指で押し下げます。
3. ピペット6ウェルプレートの各ウェルの中央にDMEM-10％FBS +ペニシリン-ストレプトマイシン中で1×10 ⁵乳癌細胞を含む細胞懸濁液50μl。 （あるいは、必要に応じて分散されたパターンでシード細胞が）、細胞付着を促進するために、45分間、37℃の組織培養インキュベーター中でプレートを置き。
4. 各実験ウェルについての骨のワックスの1枚に1骨片を置き、それを確保するために骨鉗子で穏やかな圧力を適用します。下の3つのウェルのみをコントロールとして、骨のワックスを含有しながら、与えられたTHR標本から3骨片は、トップ3ウェルに入れられるように三連で実験を行う。
5. を5mlピペットを用いて、穏やかにゆっくりと乳房細胞または骨断片を追い出し回避するために、各ウェルの側にDMEM-10％FBSを5ml提供。 37でプレートを置き76; 20〜24時間、C組織培養インキュベーター。
6. 生物発光イメージング（BLI）を実行するために、各ウェルに（300μgの/ mlの濃度を達成する）インキュベーターからプレートを除去し、ルシフェリン基質を加える。イメージは、次のパラメータを用いてIVISイメージングプラットフォーム上ですぐにプレート：1のFストップ、小さなビニング、1秒の露光時間は、レベルD.は、信号それぞれの強度だけでなく、平均的な輝き（光子/秒/平方センチメートルを測定/ステラジアン）。
7. すべての実験およびコントロールウェルについての平均輝きを定量するために関心領域（ROI）の領域を定義するためにイメージングソフトウェアを使用してください。 Excelシートにエクスポート平均放射輝度値は、統計を実行し、グラフを生成する。

4.共培養コロニー形成を研究する骨の断片上に直接播種乳癌細胞と細胞数

1. 直接24ウェル組織培養プレート（1断片/ウェル）の空のウェルに骨片を配置するために鉗子を使用する。
2. ピップ各骨片の上に直接1 X 10 ^3-6乳がん細胞を含むDMEM-10％FBS、50μlの細胞懸濁液滴をETTE。細胞接着を促進するために45分間37℃の組織培養インキュベーター中でプレートを置き。静かにフラグメントが完全に培地中に沈められていることを各ウェルなどの側面に1〜2ミリリットルDMEM-10％FBSを追加します。 20-24時間、37℃の組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。
3. インキュベーション後、各ウェルを1mlのDMEM-10％FBSを含有する新鮮な24ウェルプレートに、各骨組織フラグメントを転送するために鉗子を使用する。 BLIを実行するには、手順上記の3.6から3.7に従ってください。さらに、断片は、蛍光顕微鏡を使用して表示、またはステップ6で説明したように、乳癌細胞数および特性の分析のための骨髄集団を得るためにフラッシュされる。
4. BLI、ピペット蛍光ビスホスホネート標識溶液を5μl（事前以下の蛍光顕微鏡で定性的な評価のための完全な断片を製造するために、骨片の鉱化骨片を標識するために、各ウェルに）、製造業者の指示に従って比べ。さらに24時間、組織培養インキュベーター中でプレートをインキュベートする。
5. 蛍光ビスホスホネート標識溶液中での培養の24時間後に、画像GFP（485 nm）であり、ビスホスホネートラベル（680 nm）に設定され、蛍光顕微鏡を用いて、フェノールレッドを含まない培地とビューを含む組織培養プレートにフラグメントを転送するために鉗子を使用する。

5.骨組織フラグメントに乳癌細胞の移行を測定し、培養骨断片上清

1. 骨組織培養上清の方へ移行。
   注記：特定のTHR標本から3断片を3上清を生成するために使用されるような三連での実験を行います。各実験について、マイグレーションが骨上清対コントロール培地のみを含む3つのウェルを含む3つのウェル間で比較される。
   1. 骨のTISの生成ウェル当たり2.2ミリリットルDMEM-10％FBSを含有する12ウェルプレートのウェルに、骨片を配置することにより、上清を訴える。 24時間、37℃の組織培養インキュベーター中で培養。 24時間後に培地を撤回し、2.2ミリリットルの新鮮なDMEM-10％FBSを交換してください。 DMEM-10％FBSを同じように含有処理対照ウェル。
      注：培地は、手術に起因する組織損傷に応答して分泌された因子を除去するために24時間後に変更される。骨組織の上清を、FBS含有培地中で生成されるので、FBS含有培地を含むウェルのみ乳癌細胞遊走に対するFBSの寄与を制御するために含まれる。
   2. 48時間後に、レシーバプレートのウェルに各上清/対照培地とピペット0.9mlの収集。インサートは、後に、これらのウェルに配置される。挿入物を播種しながら組織培養インキュベーター中レシーバープレートをインキュベートする。注：残りの上清（蒸発後〜1ml）をセクレトーム事実上の分析のために収集することができるRS場合は^44を希望する。
   3. トランスウェルインサートをシードするには、標準の、空の24ウェル組織培養プレートに入れます。 図1Aに示すように、各インサートの上部の、内膜表面にDMEM-10％FBS中に1×10 ⁵個の乳癌細胞を含むピペット350μlの細胞懸濁液。付着を促進するために45分間37℃で組織培養インキュベーター中に播種された挿入物を含有する24ウェルプレートを置く。
   4. 細胞をインサートに取り付けた後、製造業者の説明書に従って受け板にインサートを転送するために鉗子を使用する。角度インサート膜とウェル上清受信機との間の気泡の形成を防止するだけでなく、受信機にそれを置く各インサート。 37℃の組織培養インキュベーター中で20時間インサートレシーバープレートをインキュベートする。
      注：インサート膜と受信機の間に気泡のためのレシーバープレートの下側​​を確認してもsupernatanトン。泡が表示されている場合は、特定のインサートを削除し、気泡が存在しないまでも受信機に再配置します。
   5. 20時間後、レシーバープレートからのインサートを削除する鉗子を使用しています。ステップの手順を使用すると、3.6から3.7イメージにに​​移行し、レシーバプレートウェルの底部に取り付けた細胞をBLIを行う。
2. 骨組織片の方へ移行。
   注記：特定のTHR標本から3フラグメントは、3つの別々のインサート内に配置され、3ガラスビーズを対照として、3つの別々のインサート内に配置されるように三連での実験を行います。
   1. 各ウェルに0.9ミリリットルDMEM-10％FBSをピペッティングすることによりレシーバプレートを準備します。挿入を準備している間、組織培養インキュベータにそれを置きます。
   2. 挿入を種子に、蓋を持つプラスチック製のマイクロチューブボックスの表面にそれらを反転。 dは1×10 ⁵乳癌細胞を含むDMEM-10％FBS、50μlの細胞懸濁液滴をピペットirectly（反転インサート上で上を向いている）各挿入膜の外、底面に。蓋付きのマイクロチューブボックスが開いて割れてカバーし、細胞接着を促進するために45分間37℃の組織培養器に移す。
   3. 組織培養フードにマイクロチューブボックスを転送し、右側アップシードの挿入をオンにし、レシーバプレートのウェル中にそれらを転送するために鉗子を使用する。各インサートカップにピペット0.450ミリリットルDMEM-10％FBS。ピンセットを用いて、それぞれの準備インサートカップにつの骨組織片（約3 mm）を転送する。必要に応じて、追加のウェルにおけるネガティブコントロールとしてガラスビーズを使用しています。 20時間組織培養インキュベーターでプレートを置きます。
   4. 遊走を測定するために、ウェルあたり1mlのDMEM-10％FBSを含有する標準的な24ウェル組織培養プレートを準備する。インキュベーターからレシーバープレートを取り外し、それぞれから骨片とビーズを転送するために鉗子を使用する標準プレートの別々のウェルに挿入します。ルシフェリンを追加基板を各ウェルに（300μgの/ mlの最終濃度を達成するため）、ステップ3.6から3.7までの手順を使用してBLIを行う。

6.追加前後の実験的解析

1. フラッシュされた骨髄の分析。
   1. 50ミリリットルコニカルチューブの最上部に配置された70μmのセルストレーナーに骨片を転送します。激しくコニカルチューブに骨髄細胞の懸濁液を得るために10mlのPBSで断片をフラッシュするために25 G針を用いた10mlの注射器を使用する。遠心分離機300×gで21℃で3分間、細胞懸濁液を、上清を吸引し、PBSまたはフローサイトメトリーのための他の所望の溶液中で細胞ペレットを再懸濁する。
      注：再懸濁体積は遠心分離後の細胞ペレットのサイズは、用途に応じて変化する。
   2. 生存率アッセイのため〜PBSの75〜300μlの体積は適切であり、これらの懸濁液は、市販fluorescencを用いて分析することができる電子基づく生存率アッセイは、製造業者の指示に従って、従来の血球計数器にピペットで入れ、倒立蛍光顕微鏡を用いて計数した。
   3. GFP陽性乳癌細胞の検出に基づいてフローサイトメトリー分析またはソーティングのために、濃度が1×10 ⁶細胞/ mlであることFBS、2mMのEDTA、および10mM HEPES、例えば2％を含有する1mlのPBSで細胞ペレットを再懸濁する。
2. H＆E染色および免疫組織化学。
   1. ヘマトキシリン​​＆エオシン（H＆E）染色および/または免疫組織化学のための断片を処理するには、番号2鉛筆で標識されたプラスチック製のカセット内の断片を配置し、24時間、10％緩衝ホルマリンを満たした容器に水没。
   2. パラフィン包埋のためのプロセス組織切片、各フラグメント内鉱化骨片を考慮して脱灰工程を含む慣用のプロトコールを用いて染色する。

結果

大腿ヘッドから組織片を分離

大腿骨頭は、スタンフォード大学医学部での整形外科学科の選択科目人工股関節全置換術を受けた男性と女性患者（年齢の44から90歳）の同数から収集した。各廃棄された大腿骨頭は、鉱化骨片と骨髄から構成される小柱骨組織を保有上部の大腿骨の小部分が含まれています。この組織は、小さな断片を抽出するために、外科骨鉗子を使用し?...

ディスカッション

Mehra らは以前に、高品質の組織を明らかにし、転移プロセス^47を研究するためのヒト骨髄サンプルの使用を検証し、剖検時に採取し、転移性前立腺癌患者の骨片の死後の収集と分析を記載している。ここでは、収集、処理および乳癌細胞移動、コロニー形成及び増殖を研究するための短期共培養系におけるTHR手術後の破棄大腿骨頭から得られたヒト骨組織の断片を使用するた?...

資料

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Life Technologies	10569-010	Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
McCoy's 5A Medium (1X)	Life Technologies	16600-082	Supplement all McCoy's  with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
Fetal bovine serum	Life Technologies	16000-044
Penicillen Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Blastocidin (10 mgl/ml)	InvivoGen	ant-bl	Supplement media used for transfected cell lines.
Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size)	Corning Incorporated	353097
Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate	Corning Incorporated	353504
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*	Invitrogen Detection Technologies	L-3224
FluoroBrite DMEM	Life Technologies	A18967-01
D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml)	Life Technologies	L-8220
Sterile Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	22363548
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3516
12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3513
24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3526
Friedman-Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16021-14
Bone wax	Surgical Specialties Corporation	903
IVIS 50 Imaging Platform	Caliper Life Sciences/PerkinElmer
Living Image Software Program	Caliper Life Sciences/PerkinElmer	133026
EVOS FL Imaging System	Life Technologies	Version 4.2
OsteoSense 680 EX	PerkinElmer	NEV10020EX
MCF-7 breast cancer cells	ATCC	HTB-22
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC	HTB-26
Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody	DAKO Cytomation	Clone (AE1/AE3)