Métodos de explantes de tejidos El cultivo fémur humano para el Estudio de la colonización de la célula del cáncer de pecho de la Niche metastásico

Resumen

Protocolos se describen para el estudio de la migración de células de cáncer de mama, la proliferación y la colonización en un sistema modelo de explante de tejido óseo humano.

Resumen

El hueso es el sitio más común de metástasis del cáncer de mama. Aunque es ampliamente aceptado que el comportamiento de las células del cáncer de influencias microambiente, poco se sabe acerca de las propiedades celulares de cáncer de mama y comportamientos dentro del microambiente natural de tejido óseo humano. Hemos desarrollado enfoques para realizar el seguimiento, cuantificar y modular las células de cáncer de mama humano en el microambiente de fragmentos humanas cultivadas de tejido óseo aisladas de cabezas femorales desechados después de cirugía de reemplazo total de cadera. El uso de células de cáncer de mama de ingeniería para la luciferasa y la proteína fluorescente (EGFP) expresión verde mejoradas, somos capaces de cuantificar de forma reproducible la migración y proliferación de patrones de uso de imágenes de bioluminiscencia (BLI), interacciones celulares pista dentro de los fragmentos de hueso mediante microscopía de fluorescencia, y evaluar las células del seno después la colonización con citometría de flujo. Las principales ventajas de este modelo son: 1) a, microE tejido arquitectónico intacto nativambiente que incluye tipos de células humanas pertinentes, y 2) el acceso directo al microambiente, lo que facilita cuantitativo rápido y monitoreo cualitativo y perturbación de mama y de células óseas propiedades, comportamientos e interacciones. Una limitación principal, en la actualidad, es la viabilidad finito de los fragmentos de tejido, lo que limita la ventana del estudio de cultivo a corto plazo. Aplicaciones del sistema de modelo incluyen el estudio de la biología básica del cáncer de mama y otros tumores malignos por el hueso dentro del nicho metastásico, y el desarrollo de estrategias terapéuticas para orientar eficazmente las células de cáncer de mama en los tejidos óseos.

Introducción

El microambiente tumoral es ampliamente reconocida como un determinante crítico de la conducta de células de cáncer durante la progresión del cáncer de mama metastásico y repartidas ^1-3. El objetivo del método que aquí se presenta es la de facilitar el estudio de las células de cáncer de mama en el microambiente del tejido óseo humano, el sitio más frecuente de metástasis del cáncer de mama ^4-6. El hueso se compone de compartimentos mineralizadas y médula ósea ^7-9, ambos de los cuales albergan células y factores secretados implicados en la progresión metastásica ^10,11. Aunque es ampliamente utilizado en modelos in vivo de ratón facilitar estudios sistémicos del proceso metastásico ^12-15, interacciones de las células dentro del esqueleto no son de fácil acceso para la observación y la perturbación directa. Sistemas de modelo para el estudio y el cultivo de tejidos óseos ratón y células de médula de ratón proporcionan un mejor acceso y han dado muchas ideas con respecto a la interferencia y los mecanismos que subyacen a las células del cáncer de mama metastasis del esqueleto murino ^16-22. Sin embargo, los estudios han sugerido que puede haber patrones de osteotropism específicas de la especie por el tejido óseo ^23,24. Estos patrones podrían reflejar especies específicas inherentes diferencias en las propiedades del tejido óseo, las diferencias resultantes de poblaciones de médula ósea alterados en ratones inmunodeficientes ^11, y / o la edad relativamente joven de los ratones utilizados en los experimentos, todos los cuales son posibles determinantes de la médula microambiente.

In vitro enfoques para el estudio de las células de cáncer de mama en co-cultivos óseos humanos se han centrado generalmente en los tipos de células óseas específicas tales como osteoblastos derivados de médula o de células estromales cultivadas como monocapas o dentro de la ingeniería de sistemas modelo de 3 dimensiones ^25-35. Aunque los modelos de cultivo de células de 2 dimensiones han formado la base del in vitro enfoques para la investigación del cáncer, desde hace tiempo se ha reconocido que el comportamiento celular se altera fundamentalmente en monolayer sistemas de cultivo ^18,36,37. Esto ha llevado al desarrollo de microambientes de ingeniería que imitan la complejidad de los tejidos vivos de 3 dimensiones, incluyendo la Matriz y modelos basados ​​en los andamios compuestos de materiales naturales tales como colágeno, o polímeros sintéticos sembraron con tipos específicos de células para crear microambientes similar a un tejido ^36-41. Enfoques de ingeniería también han incluido el uso de las plataformas de biorreactores para controlar y estudiar el entorno hormonal del microambiente ^18,19,41-43. Aunque los modelos biomiméticos y biorreactores proporcionan muchos elementos de un microambiente del tejido complejo en un entorno controlado, y se han aplicado con éxito para avanzar en el estudio de la metástasis del cáncer de mama al hueso ^{18,19,35,42,43,} sistemas de modelos de ingeniería por lo general no incorporan el espectro completo de tipos de células y componentes de la matriz extracelulares presentes en el entorno hueso nativo.

Hasta hace poco, el cáncer de mamacélulas no se han estudiado en el microambiente nativo, intacto, 3-dimensional de tejidos óseos humanos. Recientemente hemos informado de la elaboración de un modelo de co-cultivo utilizando fragmentos de tejidos óseos humanos aislados de reemplazo total de cadera (THR) cirugía especímenes ^44. Estos especímenes albergan tanto los compartimentos mineralizadas y ósea necesarias para estudiar los mecanismos subyacentes de micro-metástasis en cultivo a corto plazo. En trabajos anteriores hemos establecido una prueba de principio para el uso de imágenes de bioluminiscencia (BLI) para monitorear la proliferación de células de cáncer de mama que expresan luciferasa (MDA-MB-231-fLuc) co-cultivadas con fragmentos de hueso ^44. Aquí presentamos detallamos los protocolos experimentales para el estudio de la proliferación celular del cáncer de pecho, la colonización y la migración dentro del contexto de la microambiente nativo usando explantes de tejido óseo humano.

En primer lugar se presenta un protocolo para el co-cultivo de células de cáncer de seno adyacentes a fragmentos de hueso para medir mamala proliferación celular usando BLI. En esta sección, las suspensiones celulares de mama se siembran en forma de manchas de células en placas de 6 pocillos adyacentes a fragmentos óseos, que están inmovilizados por piezas de cera de hueso. Los pocillos de control contienen cera de hueso, pero no fragmento de hueso. Una vez manchas de células se adhieren, se añade medio y la placa se cultivaron durante 24 h, después de lo cual la intensidad de señal bioluminiscente (asociado con el número de células) se mide con BLI. En el siguiente paso se presentan métodos para células de cáncer de mama co-cultivo sembradas directamente sobre fragmentos de hueso para estudiar la colonización y proliferación. Aquí las suspensiones de células de mama se pipetean directamente sobre los fragmentos de tejido óseo, que se controlan mediante cultivo por BLI y microscopía de fluorescencia con el tiempo para realizar un seguimiento de la colonización y el número de células. En este método, el compartimiento de la médula se puede lavar a partir de los fragmentos de hueso en cualquier punto de tiempo para el análisis de las células de cáncer de mama colonizados por citometría de flujo, o los ensayos de viabilidad ósea.

Además, Deescriba dos enfoques diferentes para medir la migración de células de cáncer de mama. En el primer método pasos se describen para la medición de la migración hacia los sobrenadantes de cultivo de tejido óseo. En este protocolo las células de cáncer de mama se siembran en las superficies interiores, superiores de las membranas Transwell insertan con un 8 micras de tamaño de poro (como se muestra en la Figura 1A). Los insertos se colocan en un plato receptor con pocillos que contienen sobrenadante tejido óseo o medio de control. En el transcurso de un período de incubación de 20 h, pequeñas cantidades de células de cáncer de mama migran a través de las membranas de inserción hacia abajo en los pocillos de cultivo de tejidos más bajos donde se unen para la detección por BLI. En el segundo método de migración de las células de cáncer de mama se siembran en las superficies inferiores, exteriores de las membranas de inserción Transwell. Fragmentos de tejido de hueso se colocan en las tazas de inserción y las células de cáncer de mama migran a través de las membranas para colonizar los fragmentos de hueso (como se muestra en la Figura 1B), el cualluego son proyectados utilizando BLI.

Protocolo

Cabezas femorales se obtuvieron de los pacientes sometidos a cirugía electiva THR en el Departamento de Cirugía Ortopédica en la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford. Todos los tejidos se recogieron como muestras sin identificación, de acuerdo con las regulaciones de la Oficina de Cumplimiento de Investigación de la Universidad de Stanford.

1. Selección de una línea (s) Celular del Cáncer de Mama

1. Obtener o transfectar la línea celular de cáncer de mama deseado (s) con un reportero luciferase construir-GFP. Los siguientes experimentos se realizaron utilizando el MCF-7 de cáncer de mama líneas celulares de ingeniería para la expresión estable de la luciferasa de luciérnaga (fLUC) y proteína fluorescente verde potenciada (EGFP) MDA-MB-231 y por transfección con el plásmido transposón de belleza durmiente pKT2 / Lubig y el pK plásmido transposasa / hubiC-SB11 ^45,46.
   NOTA: Las líneas celulares transfectadas se conocen como MDA-MB-231-fLuc-EGFP, y MCF-7-fLuc-EGFP.

2. Aislar Tissue Fragments de Cabezas femorales

1. Después de la cirugía THR, recoger la cabeza femoral desechado en un recipiente estéril lleno de solución salina fisiológica. Transferir la muestra al laboratorio y procesarla dentro de 1-3 horas de la cirugía. Nota: si hay un retraso en el procesamiento, coloque la muestra a 4 ° C.
2. Prepare un área de trabajo mediante la colocación de los siguientes elementos en una estera absorbente en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar: guantes estériles, gubia quirúrgica, fórceps, vaso de precipitado con isopropanol al 70% para enjuagar los instrumentos y los vasos de cultivo de tejidos como se estipula a continuación para cada tipo de experimento .
3. El uso de un guante quirúrgico estéril para mantener la cabeza del fémur ronda en una mano, utilice la gubia en la otra mano para extraer fragmentos de hueso trabecular del tamaño deseado (~ 5.2 mm) del eje superior expuesta del fémur. Transferencia de fragmentos de hueso en el recipiente de cultivo (por ejemplo, 6, 12, o 24 y placa de cultivo de tejidos o la cámara de migración), dependiendo del tipo de la proliferación, colonization o migración experimento, tal como se describe en los pasos 3, 4 o 5.
   NOTA: fragmentos de tejido óseo debe ser cosechada como se describe anteriormente después de completar los pasos iniciales para cada ensayo específico proliferación, colonización o migración. Fragmentos variarán en tamaño como se muestra en la Figura 2. Los fragmentos pueden ser pesados ​​antes o después de los experimentos con el propósito de la normalización.

3. Las células de cáncer de mama co-cultivo adyacentes a fragmentos de hueso para medir la proliferación de células de mama Utilizando BLI

1. Antes del experimento, preparar una suspensión que contiene 2 x 10 ⁵ células de cáncer de mama / 50 l, y preparar tapones de cera de hueso para inmovilizar los fragmentos de hueso en cultivo. Cortar una punta de micropipeta P200 en 3 pedazos y usar el extremo estrecho de la pieza más grande de una manera "cortador de galletas" para cortar pequeños (~ 35 mg) piezas de cera de hueso. Utilice el extremo ancho de la pieza más pequeña para expulsar los tapones de cera de hueso en una placa de Petripara el almacenamiento.
2. Coloque un pedazo de cera de hueso en la posición de las 12 de cada bien y presione suavemente hacia abajo con un dedo índice estéril enguantada.
3. Pipetear 50 l de suspensión de células que contiene 1 x 10 ⁵ células de cáncer de mama en DMEM-FBS al 10% + Pen-Strep en el centro de cada pocillo de una placa de 6 pocillos. (Alternativamente, las células de semillas en un patrón disperso si lo desea.) Colocar la placa en un C de cultivo de tejidos incubadora a 37 ° durante 45 min para promover la unión celular.
4. Coloque el fragmento 1 hueso en 1 pieza de cera de hueso para cada pozo experimental y aplicar una presión suave con la gubia para asegurarlo. Realizar experimentos por triplicado tal que 3 fragmentos óseos de una muestra de THR dados se colocan en los tres primeros pozos, mientras que los tres pocillos de fondo contienen cera de hueso sólo como controles.
5. Usando una pipeta de 5 ml, entregar suave y lentamente 5 ml de DMEM-FBS al 10% a un lado de cada pocillo para evitar que se desprenda de las células de la mama o fragmentos de hueso. Colocar la placa en un 3776; C incubadora de cultivo de tejidos de 20 a 24 h.
6. Para realizar imágenes de bioluminiscencia (BLI) retire la placa de la incubadora y añadir sustrato luciferina (para lograr una concentración de 300 mg / ml) a cada pocillo. Imagen de la placa de inmediato en una plataforma de imágenes IVIS utilizando los siguientes parámetros: f-stop de 1, pequeña de agrupación, el tiempo de exposición de 1 segundo, el nivel D. Mide la intensidad de la señal de cada uno así como la luminosidad media (fotones / segundo / centímetro cuadrado / estereorradián).
7. Utilice software de imagen para definir regiones de interés (ROI) para cuantificar la radiación promedio para todos los pozos experimentales y de control. Exportar valores medios luminosidad a una hoja de Excel para realizar estadísticas y generar gráficos.

4. Las células de cáncer de mama co-cultivo sembrados directamente en fragmentos de hueso para el Estudio de Colonización y número de la célula

1. El uso de fórceps para colocar los fragmentos de hueso directamente en los pocillos vacíos de una placa de cultivo de tejido de 24 pocillos (1 fragmento / pocillo).
2. PepitaETTE un 50 l suspensión de células de gotita de DMEM-FBS al 10% que contiene 1 x 10 ^3-6 células de cáncer de mama directamente en la parte superior de cada fragmento de hueso. Colocar la placa en un 37 ° C tejido cultura incubadora durante 45 minutos para promover la unión celular. Añadir suavemente 1-2 ml DMEM-FBS al 10% en el lado de cada pocillo de tal manera que el fragmento se sumerge totalmente en medio. Incubar la placa en un 37 ° C tejido cultura incubadora durante 20 a 24 horas.
3. Después de la incubación, el uso de fórceps para transferir cada fragmento de tejido óseo a una placa de 24 pocillos fresco que contenía 1 ml de DMEM-FBS al 10% en cada pocillo. Para realizar BLI, siga los pasos 3.6 a 3.7 anteriores. Además, los fragmentos pueden ser vistos usando un microscopio de fluorescencia, o tirarse por obtener la población ósea para el análisis de los números de células de cáncer de mama y las propiedades como se describe en el paso 6.
4. Para preparar los fragmentos intactos para la evaluación cualitativa por microscopía de fluorescencia después de BLI, pipeta de 5 l de solución de etiquetado bisfosfonato fluorescente (precomparación de acuerdo con las instrucciones del fabricante) en cada pocillo para etiquetar las espículas mineralizados de los fragmentos de hueso. Se incuba la placa en la incubadora de cultivo de tejidos durante otras 24 h.
5. Tras 24 horas de cultivo en solución de etiquetado bisfosfonato fluorescente, use pinzas para transferir los fragmentos de placas de cultivo de tejidos que contienen medio sin rojo fenol y vista usando un microscopio de fluorescencia configurado para GFP imagen (485 nm) y la etiqueta con bifosfonatos (680 nm).

5. Medición de la migración de células de cáncer de mama a los fragmentos de tejido óseo y cultivadas Fragmento de hueso sobrenadantes

1. La migración hacia el tejido óseo sobrenadante de cultivo.
   NOTA: Realice experimentos por triplicado tal que 3 fragmentos de un espécimen THR dados se utilizan para generar 3 sobrenadantes. Para cada experimento, se compara la migración a través de tres pocillos que contienen sobrenadantes de hueso frente a tres pocillos que contienen medio de control solamente.
   1. Generar tis huesodemandar sobrenadantes mediante la colocación de fragmentos de hueso en los pocillos de una placa de 12 pocillos que contenía 2,2 ml de DMEM-FBS al 10% por pocillo. Cultura en un 37 ° C incubadora de cultivo de tejido durante 24 horas. Retire el medio a las 24 horas y reemplazar con 2,2 ml DMEM-FBS al 10%. Los pocillos de control de tratamiento que contiene DMEM-FBS al 10% de la misma manera.
      ATENCIÓN: se cambió el medio a las 24 horas para eliminar factores secretados en respuesta al trauma del tejido resultante de la cirugía. Debido a que los sobrenadantes del tejido óseo se generan en contenía FBS al medio, los pocillos que contenían FBS medio que contiene sólo se incluyen para controlar las contribuciones de FBS a la migración de células de cáncer de mama.
   2. En 48 horas, recoger 0,9 ml de cada uno / medio de control sobrenadante y pipeta en los pocillos de una placa receptora. Los insertos posteriormente serán colocados en estos pozos. Incubar la placa receptora en la cultura incubadora de tejido mientras la siembra de las inserciones. Nota: El resto de sobrenadante (~ 1 ml después de la evaporación) se pueden recoger para el análisis de secretoma factors si se desea ^44.
   3. Para sembrar las inserciones Transwell, colóquelos en un estándar, de 24 pocillos placa de cultivo tisular vacía. Pipetear 350 l suspensión de células que contiene 1 x 10 ⁵ células de cáncer de mama en DMEM-FBS al 10% sobre la superficie de la membrana superior, interior de cada inserto como se muestra en la Figura 1A. Coloque la placa de 24 pocillos que contenía los insertos de cabezas de serie en el 37 ° C de cultivo de tejidos incubadora durante 45 min para promover la unión.
   4. Una vez que las células se han unido a los insertos, el uso de fórceps para transferir los insertos a la placa de receptor de acuerdo con las instrucciones del fabricante. Ángulo de cada inserto cuando la coloque en el receptor así para evitar la formación de burbujas entre la membrana de inserción y el receptor así sobrenadante. Incubar la placa receptora con inserciones durante 20 horas en un 37 ° C tejido cultura incubadora.
      NOTA: Verifique el lado inferior de la placa receptora de burbujas entre la membrana de inserción y el receptor así supernatant. Si se ven burbujas, extraiga los protectores específicos y colocarlos de nuevo en el receptor bien hasta que no queden burbujas están presentes.
   5. Después de 20 horas de uso de fórceps para extraer los insertos de la placa receptora. Usando los procedimientos en los pasos 3.6 a 3.7 realizar BLI a la imagen de las células que han migrado en y unidos a la parte inferior de los pocillos de la placa receptor.
2. La migración hacia los fragmentos de tejido óseo.
   NOTA: Realice experimentos por triplicado tal que 3 fragmentos de un espécimen THR dados se colocan en 3 inserciones separadas, y 3 perlas de vidrio se colocan en 3 inserciones separadas como controles.
   1. Preparar la placa receptora pipeteando 0,9 ml de DMEM-FBS al 10% en cada pocillo. Colóquelo en la cultura incubadora tejido mientras se preparan los insertos.
   2. Para sembrar las inserciones, ellos invertir en la superficie de una caja de tubo de microcentrífuga de plástico que tiene una tapa. Pipetear 50 l de suspensión celular gota de DMEM-FBS al 10% que contiene 1 x 10 ⁵ células de cáncer de mama directly sobre la superficie exterior, parte inferior de cada membrana de inserción (que está mirando hacia arriba en los insertos invertidas). Cubrir la caja del tubo de microcentrífuga con la tapa entreabierta y la transfiere a la incubadora a 37 ° tejido durante 45 min para promover la unión celular.
   3. Transferir la caja del tubo de microcentrífuga a la campana de cultivo de tejido, y el uso de fórceps para girar los insertos sembradas lado derecho hacia arriba y transferirlos en los pocillos de la placa receptora. Pipetear 0,450 ml de DMEM-FBS al 10% en cada taza de inserción. Con unas pinzas, transferir un fragmento de tejido óseo (~ 3 mm) en cada taza de inserción preparado. Opcionalmente, utilizar cuentas de vidrio como controles negativos en pozos adicionales. Colocar la placa en una cultura incubadora tejido durante 20 horas.
   4. Para medir la migración, preparar una placa de cultivo tisular estándar de 24 pocillos que contenía 1 ml de DMEM-FBS al 10% por pocillo. Retire la placa receptora de la incubadora y el uso de fórceps para transferir los fragmentos de hueso y los granos de cada insertar en pocillos separados de la placa estándar. Añadir luciferinasustrato (para lograr una concentración final de 300 mg / ml) a cada pocillo y realizar BLI usando los procedimientos en los pasos 3.6 a 3.7.

6. Los análisis adicionales pre y post-experimentales

1. Análisis de médula enrojecida.
   1. Transferencia de un fragmento de hueso en un filtro de células de 70 micras colocado en la parte superior de un tubo cónico de 50 ml. Utilice una jeringa de 10 ml con una aguja de 25 G para enjuagar vigorosamente el fragmento con 10 ml de PBS para obtener una suspensión de células de médula en el tubo cónico. Centrifugar la suspensión de células durante 3 minutos a 300 xg y 21 ° C, aspirar el sobrenadante y resuspender las células sedimentadas en PBS u otra solución deseada para citometría de flujo.
      NOTA: los volúmenes de resuspensión variarán dependiendo del tamaño del sedimento celular después de la centrifugación, y la aplicación.
   2. Para los ensayos de viabilidad ~ 75-300 mu l volúmenes de PBS son apropiados, y estas suspensiones se pueden analizar utilizando fluorescenc disponible comercialmenteensayos de viabilidad basado en correo de acuerdo con las instrucciones del fabricante, pipetearon en un hemocitómetro convencional, y se contaron usando un microscopio de fluorescencia invertido.
   3. Para el análisis de citometría de flujo o de la clasificación basada en la detección de células de cáncer de mama positivas para GFP, resuspender el sedimento celular en 1 ml de PBS que contenía 2% de FBS, 2 mM de EDTA, y 10 mM HEPES tal que la concentración es 1 x 10 ⁶ células / ml.
2. H & E tinción inmunohistoquímica y.
   1. Para procesar los fragmentos de hematoxilina y eosina (H & E) tinción y / o inmunohistoquímica, colocar los fragmentos en cassettes de plástico marcadas con un lápiz número 2, y sumergirse en un recipiente lleno con 10% de formalina tamponada durante 24 hr.
   2. Tejidos de proceso para la inclusión en parafina, seccionamiento y tinción usando protocolos rutinarios que incluyen una etapa de descalcificación para dar cuenta de las espículas mineralizadas dentro de cada fragmento.

Resultados

El aislamiento de fragmentos de tejido de Cabezas femorales

Cabezas femorales se obtuvieron de igual número de hombres y mujeres (44 a 90 años de edad) sometidos a cirugía electiva de reemplazo total de cadera en el Departamento de Cirugía Ortopédica en la Escuela de Medicina de la Universidad de Stanford. Cada cabeza femoral desechado contiene una pequeña porción de la parte superior del fémur, que alberga el tejido óseo trabecular compuesto por espículas mineralizadas y ósea. Es...

Discusión

Mehra et al., Han descrito previamente la recogida y análisis de muestras de hueso postmortem de pacientes con cáncer de próstata metastásico cosechadas en el momento de la autopsia, que revela los tejidos de alta calidad y validar el uso de muestras de huesos humanos para estudiar el proceso metastásico ^47. Aquí hemos descrito los protocolos de recolección, procesamiento y uso de fragmentos de tejidos óseos humanos obtenidos de cabezas femorales desechados después de la cirugía THR en un s...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM (1X) + GlutaMAX-l	Life Technologies	10569-010	Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
McCoy's 5A Medium (1X)	Life Technologies	16600-082	Supplement all McCoy's  with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
Fetal bovine serum	Life Technologies	16000-044
Penicillen Streptomycin	Life Technologies	15140-122
Blastocidin (10 mgl/ml)	InvivoGen	ant-bl	Supplement media used for transfected cell lines.
Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size)	Corning Incorporated	353097
Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion Plate	Corning Incorporated	353504
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*	Invitrogen Detection Technologies	L-3224
FluoroBrite DMEM	Life Technologies	A18967-01
D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml)	Life Technologies	L-8220
Sterile Cell Strainer 70 μm	Fisher Scientific	22363548
6 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3516
12 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3513
24 Well TC-Treated Cell Culture Cluster	Corning Incorporated	3526
Friedman-Pearson Rongeur	Fine Science Tools	16021-14
Bone wax	Surgical Specialties Corporation	903
IVIS 50 Imaging Platform	Caliper Life Sciences/PerkinElmer
Living Image Software Program	Caliper Life Sciences/PerkinElmer	133026
EVOS FL Imaging System	Life Technologies	Version 4.2
OsteoSense 680 EX	PerkinElmer	NEV10020EX
MCF-7 breast cancer cells	ATCC	HTB-22
MDA-MB-231 breast cancer cells	ATCC	HTB-26
Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibody	DAKO Cytomation	Clone (AE1/AE3)