JoVE Logo
Authors
Contact Us

Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • תוצאות
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקולים מתוארים ללימוד הגירה של תאי סרטן השד, התפשטות והתנחלות במערכת מודל explant רקמת עצם אנושית.

Abstract

עצם הוא האתר הנפוץ ביותר של גרורות סרטן השד. למרות שזה מקובל שסרטן השפעות מייקרו-סביבת התנהגות התא, מעט מאוד ידוע על מאפייני סרטן שד תא והתנהגויות בתוך מייקרו-הסביבה המקומית של רקמת עצם אנושית. פיתחנו גישות כדי לעקוב אחר, לכמת ולווסת את תאי סרטן השד אנושיים במייקרו-הסביבה של שברים בתרבית רקמת עצם אנושיים מבודדים מראשי הירך הושלכו הבאים כולל ניתוחי החלפת מפרק ירך. שימוש בתאי סרטן השד מהונדס ללוציפראז ומשופר חלבון פלואורסצנטי ביטוי ירוק (EGFP), אנו יכולים לכמת reproducibly דפוסי הגירה והתפשטות שימוש בהדמית פליטת אור (BLI), אינטראקציות תא מסלול בתוך שברי העצמות באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, ולהעריך את תאי שד לאחר קולוניזציה עם cytometry זרימה. היתרונות העיקריים של מודל זה כוללים: 1) microe ילידים, ארכיטקטוני שלם רקמהnvironment הכולל סוגי תאים אנושיים רלוונטיים, ו- 2) גישה ישירה למייקרו-הסביבה, המאפשר כמותית מהירה וניטור איכותי והפרעות של נכסי שד ותאי עצם, התנהגויות ואינטראקציות. מגבלה העיקרית, כיום, היא הכדאיות סופית של שברי הרקמות, אשר מגביל את החלון של מחקר לתרבות לטווח קצר. יישומים של מערכת המודל כוללים מחקר על הביולוגיה הבסיסית של סרטן השד וגידולים ממאירים המבקש עצם אחרים בתוך הנישה גרורתי, ופיתוח אסטרטגיות טיפוליות למקד ביעילות תאי סרטן השד ברקמות עצם.

Introduction

מייקרו-הסביבה של הגידול להכרה רחבה כקובע קריטי של תאים סרטניים התנהגות במהלך התקדמות סרטן השד גרורתי והתפשטה 1-3. המטרה של השיטה שהוצגה כאן היא להקל על המחקר של תאי סרטן השד במייקרו-הסביבה של רקמת עצם אנושי, האתר השכיח ביותר לגרורות סרטן השד 4-6. עצם מורכב מתאי mineralized ומח 7-9, אשר שניהם נמל תאים וגורמים מופרשים מעורבים בהתקדמות גרורתי 10,11. למרות שימוש נרחב במודלים של עכברי vivo להקל על מחקרים מערכתיים של התהליך גרורתי 12-15, אינטראקציות תא בתוך השלד אינן נגישים לתצפית והפרעות ישירות. מערכות מודל ללימוד וculturing רקמות עצם עכבר ותאי מח העכבר לספק גישה טובה יותר והניבו תובנות רבות לגבי crosstalk ומנגנונים מ 'תאי סרטן שדetastasis של השלד העכברי 16-22. עם זאת, המחקרים הראו כי ייתכן שיש מינים ספציפיים דפוסי osteotropism לרקמת עצם 23,24. דפוסים אלה יכולים לשקף מינים ספציפיים הגלומים הבדלים במאפייני רקמת עצם, הבדלים הנובעים מאוכלוסיות מח העצם שינו בעכברי חיסון לקוי 11, ו / או גיל צעיר יחסית של עכברים המשמש בניסויים, שכולן עשויים גורמים של העצם מייקרו-סביבה.

במבחנה גישות ללימוד תאי סרטן השד בשיתוף תרבויות עצם אנושיות התמקד בדרך כלל על סוגי תאי עצם ספציפיים כגון osteoblasts-נגזר מח עצם או תאי סטרומה מתורבתים כמו monolayers או בתוך מערכות מודל 3 ממדים מהונדסים 25-35. למרות שמודלי תרבית תאים 2 ממדים יצרו עמוד התווך של במבחנה גישות לחקר סרטן, זה כבר זמן רב הכיר בכך שהתנהגות התא משתנה מן היסוד במ 'onolayer מערכות תרבות 18,36,37. זה הוביל לפיתוח של מייקרו-סביבות מהונדסות המחקות את המורכבות של רקמות חיות 3 ממדים, כולל מטריצה ​​ומודלים מבוססי פיגום המורכב מחומרים טבעיים כמו קולגן, או פולימרים סינטטיים שנזרעו עם סוגי תאים מסוימים ליצירת מייקרו-סביבות כמו רקמה- 36-41. גם גישות מהונדסות כללו שימוש בפלטפורמות bioreactor לשלוט וללמוד את הסביבה ההורמונלית של מייקרו-הסביבה 18,19,41-43. למרות שמודלים וbioreactors biomimetic לספק אלמנטים רבים של מייקרו-סביבת רקמה מורכבת בסביבה מבוקרת, ויושמו בהצלחה על מנת לקדם את המחקר של גרורות סרטן השד לעצם 18,19,35,42,43, מערכות מודל מהונדסות בדרך כלל אינן לשלב הספקטרום המלא של סוגי תאים ורכיבי מטריצה ​​תאיים הנוכחיים בסביבת עצם הילידים.

עד לאחרונה, סרטן השדתאים לא נחקרו במייקרו-הסביבה המקומית, שלם, 3 ממדים של רקמות עצם אנושיות. לאחרונה דיווחו על ההתפתחות של מודל שיתוף תרבות באמצעות שברי רקמה אנושיים עצם מבודד מסך החלפת מפרק ירך ניתוח (THR) דגימות 44. דגימות אלה נמל שני תאי mineralized ומח הצורך ללמוד מנגנוני מיקרו-גרורות בתרבות טווח קצרה. בעבודה קודמת הקמנו הוכחה של עיקרון לשימוש בהדמית פליטת אור (BLI) כדי לפקח על ההתפשטות של תאים (מד"א MB-231-fLuc) שיתוף תרבותי עם שברי עצמות 44 להביע לוציפראז סרטן השד. כאן אנו מציגים מפורטים פרוטוקולי ניסוי ללימוד התפשטות תאי סרטן שד, קולוניזציה, והגירה בהקשר של מייקרו-הסביבה המקומית באמצעות explants רקמת עצם אנושי.

ראשית אנו מציגים פרוטוקול לתאי סרטן שד שיתוף culturing סמוכים לברי עצמות למדוד שדהתפשטות תאים באמצעות BLI. בסעיף זה, השעיות תא שד הם זורעים ככתמי תא 6 צלחות גם בסמוך לברי עצמות, שהם משותקים על ידי חתיכות של שעוות עצם. בארות בקרה מכילות שעוות עצם, אך לא שבר עצם. ברגע שכתמי תא לצרף, בינוני הוא הוסיף את הצלחת היא בתרבית למשך 24 שעות, לאחר שעוצמת אות bioluminescent (הקשורים במספר תא) נמדדת עם BLI. בשלב הבא אנו מציגים שיטות לתאי סרטן שד culturing-שיתוף זרע ישירות על גבי שברי עצמות ללמוד קולוניזציה ושגשוג. כאן השעיות תא השד pipetted ישירות על גבי שברי רקמת העצם, שנמצאים תחת פיקוח בתרבות על ידי BLI ומיקרוסקופ פלואורסצנטי לאורך זמן כדי לעקוב אחר קולוניזציה ומספר תא. בשיטה זו, תא מוח יכול להיות סמוק מברי עצמות בכל נקודה לניתוח של תאי סרטן השד יישבו על ידי זרימת זמן cytometry, או מבחני כדאיות מח.

בנוסף, אנו מבטליםסופר שתי גישות שונות למדידת נדידת תאי סרטן השד. בשיטה הראשונה צעדים מפורטים למדידת הגירה כלפי supernatants תרבית רקמת עצם. בפרוטוקול זה תאי סרטן השד הם זורעים על גבי המשטחים הפנימיים, העליונים של Transwell להכניס קרומים עם גודל נקבובית 8 מיקרומטר (כפי שמוצגים באיור 1 א). לאחר מכן מוסיף ממוקמים לתוך צלחת מקלט עם בארות המכילות supernatant רקמת עצם או בינוני שליטה. במהלך תקופת דגירה 20 שעות, מספר קטן של תאי סרטן השד להעביר דרך הממברנות להכניס לתוך בארות תרבית הרקמה הנמוכות שבו הם מייחסים לגילוי על ידי BLI. בשיטה השנייה הגירת תאי סרטן השד הם זורעים על גבי המשטחים התחתונים, החיצוניים של קרומים להוסיף Transwell. שברי רקמת עצם ממוקמים לתוך הכוסות להוסיף ותאי סרטן השד להעביר דרך ממברנות ליישב את שברי עצמות (כפי שמוצגים באיור 1), שלאחר מכן צילם באמצעות BLI.

Protocol

ראש עצם הירך נאסף מחולים שעברו ניתוח THR בחירה במחלקה לכירורגיה אורטופדיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד. כל הרקמות נאספו כדגימות זוהתה de בהתאם לתקנות של משרד Compliance מחקר באוניברסיטת סטנפורד.

1. בחירת שורת תאי סרטן השד (ים)

  1. להשיג או transfect הקו הרצוי תאי סרטן השד (ים) עם מבנה כתב בלוציפראז-GFP. הניסויים הבאים בוצעו באמצעות מד"א MB-231 וקווי MCF-7 בסרטן שד תא מהונדס עבור הביטוי היציב של לוציפראז גחלילית (fLuc) וחלבון משופר ירוק ניאון (EGFP) על ידי transfection עם הפלסמיד transposon היפיפה הנרדם pKT2 / LuBiG וPK פלסמיד transposase / hUbiC-SB11 45,46.
    הערה: שורות תאי transfected מכונות מד"א MB-231-fLuc-EGFP, וMCF-7-fLuc-EGFP.

2. רקמות בידוד Fragments מראשי הירך

  1. לאחר ניתוח THR, לאסוף את ראש עצם הירך שהושלך במכל סטרילי המלא בתמיסת מלח פיסיולוגי. העבר את הדגימה למעבדה ולעבד אותו בתוך 1-3 שעות של ניתוח. הערה: אם יש עיכוב בעיבוד, הנח את הדגימה על 4 מעלות צלזיוס.
  2. הכן אזור עבודה על ידי הצבת את הפריטים הבאים על מחצלת סופגת בברדס בתרבית רקמת זרימה למינרית: כפפות סטריליות, rongeur כירורגית, מלקחיים, כוס עם isopropanol 70% כדי לשטוף כלים, וכלי תרבית הרקמה כמפורט להלן עבור כל סוג של ניסוי .
  3. לובש כפפה כירורגית סטרילית להחזיק את הראש עצם הירך העגולה ביד אחת, להשתמש בrongeur ביד השנייה כדי לחלץ עצמות trabecular של גודל רצוי (~ 2-5 מ"מ) מהפיר העליון החשוף של עצם הירך. העבר את שברי עצם לתוך כלי התרבות (למשל, 6, 12, או 24 גם צלחת תרבית רקמה או תא הגירה), בהתאם לסוג של הפצה, colניסוי onization או הגירה, כפי שתואר בשלבי 3, 4 או 5.
    הערה: שברי רקמת עצם צריך להיות שנקטפו כמתואר לעיל לאחר השלמת השלבים הראשוניים של כל assay שגשוג, קולוניזציה או הגירה ספציפית. שברים ינועו בגודל כפי שמוצג באיור 2. אפשר לשקול שברים לפני או אחרי ניסויים לצורך התקינה.

3. תאי סרטן שד culturing-Co בסמוך לברי עצמות כדי למדוד התפשטות תאי שד באמצעות BLI

  1. לפני הניסוי, להכין השעיה המכילה 2 x 10 5 תאי סרטן השד / 50 μl, ולהכין את התקעים של שעוות עצם ללשתק שברי עצמות בתרבות. לחתוך קצה micropipette P200 ל -3 חלקים ולהשתמש בקצה הצר של החתיכה בגודלה באופן "עוגייה מחתך" לחתוך חתיכות קטנות (~ מ"ג 35) של שעוות עצם. השתמש בקצה הרחב של החתיכה הקטנה ביותר כדי להוציא את תקעי שעוות עצם לתוך צלחת פטרילאחסון.
  2. מניחים פיסת שעוות עצם בכיוון השעה 12 כל טוב ולחץ בעדינות כלפי מטה עם אצבע עטויה בכפפה סטרילית-.
  3. פיפטה 50 μl של השעיה תא המכילה 1 x 10 5 תאי סרטן השד בDMEM-10 FBS% + פן-דלקת במרכז היטב בכל צלחת 6-היטב. (לחלופין, תאי זרע בדפוס פיזר אם תרצה בכך.) מניחים את הצלחת בתרבית רקמת חממת 37 ° C במשך 45 דקות כדי לקדם מצורף תא.
  4. הנח בר עצם 1 על 1 חתיכה של שעוות עצם לכל גם ניסיוני ולהפעיל לחץ עדין עם rongeur כדי לאבטח אותו. לבצע ניסויים בשלושה עותקים כך ש3 שברי עצמות מדגימת THR נתון מונחים לשלוש בארות העליונים, בעוד שלוש הבארות התחתונה מכילות שעוות עצם רק כפקדים.
  5. בעזרת פיפטה 5 מיליליטר, בעדינות ובאיטיות לספק 5 מיליליטר של DMEM-10% FBS לצד השני של כל היטב כדי למנוע פירוק תאי שד או שברי עצמות. מניחים את הצלחת ב-3776; תרבית רקמת חממת C עבור 20-24 שעות.
  6. כדי לבצע הדמיה פליטת אור (BLI) להסיר את הצלחת מן החממה ולהוסיף מצע luciferin (כדי להשיג ריכוז של 300 מיקרוגרם / מיליליטר) היטב כל אחד. תמונת הצלחת מייד על IVIS הדמיה פלטפורמה באמצעות הפרמטרים הבאים: f-stop של 1, binning הקטנה, זמן חשיפה של 1 שניות, רמת ד מדוד את עוצמת האות של כל כן זוהר ממוצע (פוטונים / שני / סנטימטר מרובע / סטרדיאן).
  7. השתמש בתוכנת הדמיה להגדיר אזורים של העניין (ROI) לכמת את זוהר הממוצע לכל בארות הניסיוניות ושליטה. ערכי זוהר ממוצע יצוא לגיליון Excel כדי לבצע סטטיסטיקה וליצור גרפים.

4. תאי סרטן שד culturing-Co זרע ישירות על גבי שברי עצמות לחקר התיישבות ומספר נייד

  1. שימוש במלקחיים למקום שברי עצמות ישירות לתוך הבארות הריקות של צלחת תרבית רקמת 24 גם (בר 1 / טובים).
  2. פְּעִיםette אגל השעיה תא 50 μl של DMEM-10% FBS המכיל 1 X 03-6 אוקטובר תאי סרטן השד באופן ישיר על גבי כל בר עצם. מניחים את הצלחת בתרבית רקמת חממת 37 ° C במשך 45 דקות כדי לקדם מצורף תא. בעדינות להוסיף 1-2 מיליליטר DMEM-10% FBS לצד השני של כל גם כזה שהבר הוא שקוע כולו במדיום. דגירה את הצלחת בתרבית רקמת חממת 37 ° C 20-24 שעות.
  3. לאחר דגירה, להשתמש במלקחיים כדי להעביר כל קטע רקמת עצם לצלחת 24 גם טרי המכילה 1 מיליליטר DMEM-10% FBS בכל טוב. כדי לבצע BLI, בצע את השלבים 3.6-3.7 לעיל. בנוסף, ניתן לראות שברים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי, או סמוק להשיג את אוכלוסיית מח לניתוחים של מספרי תאי סרטן השד ומאפיינים כמתואר בשלב 6.
  4. כדי להכין את שברים שלמים להערכה איכותית על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי הבא BLI, פיפטה 5 μl של פתרון תיוג בביספוספונטים ניאון (מראשpared על פי הוראות היצרן) לכל אחד גם לתייג spicules mineralized של שברי העצמות. דגירה את הצלחת בתרבית רקמת החממה לשעת 24 נוספת.
  5. בעקבות 24 שעות של התרבות בפתרון תיוג בביספוספונטים ניאון, להשתמש במלקחיים כדי להעביר את שברי צלחות תרבית רקמה המכילות בינוני פנול אדום-חופשית ונוף באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי המוגדר GFP תמונה (485 ננומטר) ותווית בביספוספונטים (680 ננומטר).

5. מדידת הגירה של תאי סרטן השד לברי רקמת עצם והעצם בתרבית שבר Supernatants

  1. הגירה לכיוון supernatant תרבית רקמת עצם.
    הערה: בצע ניסויים בשלושה עותקים כך ש3 ברים מדגימת THR נתון משמשות ליצירת 3 supernatants. עבור כל ניסוי, הגירה היא בהשוואה על פני שלוש בארות המכילות supernatants עצם לעומת שלוש בארות המכילות מדיום שליטה בלבד.
    1. צור tis עצםלתבוע supernatants על ידי הנחת שברי עצמות לתוך הבארות של צלחת 12-היטב המכילה 2.2 מיליליטר DMEM-10% FBS בכל טוב. תרבות בתרבית רקמת חממת 37 ° C למשך 24 שעות. לסגת הבינוני ב 24 שעות ולהחליף עם 2.2 מיליליטר טרי FBS% DMEM-10. בארות שליטת פינוק המכילות DMEM-10% FBS באותה הדרך.
      הערה: הבינוני משתנה ב 24 שעות כדי להסיר גורמים מופרשים בתגובה לטראומה לרקמות כתוצאה מניתוח. בגלל supernatants רקמת עצם נוצרת בFBS המכיל בינוניות, בארות המכילות מדיום FBS המכיל רק כלולים לשלוט על תרומתם של FBS לנדידת תאי סרטן שד.
    2. ב 48 שעות, לאסוף 0.9 מיליליטר של כל supernatant / בינוני שליטה ופיפטה לתוך הבארות של צלחת מקלט. מוסיף מאוחר יותר להציב לתוך בארות אלה. דגירה את צלחת המקלט בתרבית רקמת החממה תוך זריעה מוסיף. הערה: supernatant הנותר (~ 1 מיליליטר לאחר אידוי) ניתן לאסוף עבור ניתוח של secretome פקטוrs אם תרצה בכך 44.
    3. זרע מוסיף Transwell, להכניס אותם לתוך סטנדרטי, צלחת תרבית רקמת 24 גם ריקה. ההשעיה פיפטה 350 μl תא המכילה 1 x 10 5 תאי סרטן השד בDMEM-10% FBS על פני השטח העליונים, פנימי קרום של להכניס כל אחד כפי שמוצג באיור 1 א. מניחים את צלחת 24 גם מכילה מוסיף זרע לתרבית רקמת חממת 37 ° C במשך 45 דקות כדי לקדם קובץ מצורף.
    4. ברגע שהתאים מחוברים למוסיף, להשתמש במלקחיים כדי להעביר מוסיף לצלחת המקלט בהתאם להוראות היצרן. זווית להכניס כל אחד בעת ביצוע אותה למקלט גם כדי למנוע היווצרות בועה בין הקרום להוסיף והמקלט גם supernatant. דגירה את צלחת המקלט עם מוסיף במשך 20 שעות בתרבית רקמת חממת 37 ° C.
      הערה: בדוק את הצד התחתון של צלחת המקלט לבועות בין הקרום להוסיף והמקלט גם supernatant. אם בועות גלויות, להסיר את מוסיף הספציפי ומניח אותם שוב לתוך השפופרת היטב עד שאין בועות נמצאות.
    5. אחרי 20 מלקחיים שימוש hr להסיר מוסיף מצלחת המקלט. שימוש בהליכים בצעדים 3.6-3.7 לבצע BLI לתמונת התאים שהגרו ולמחוברים לחלק התחתון של בארות צלחת מקלט.
  2. הגירה לברי רקמת עצם.
    הערה: בצע ניסויים בשלושה עותקים כך ש3 ברים מדגימת THR ניתנה ממוקמות לתוך 3 מוסיף נפרד, ו- 3 חרוזי זכוכית ממוקמים לתוך 3 מוסיף נפרדים כפקדים.
    1. הכן את צלחת המקלט על ידי pipetting 0.9 מיליליטר FBS% DMEM-10 לכל אחד. הנח אותו לתרבית רקמת החממה בעת הכנה מוסיף.
    2. הזרע מוסיף, להפוך אותם על פני השטח של תיבת צינור microfuge פלסטיק שיש לו מכסה. פיפטה טיפת השעיה תא 50 μl של FBS% DMEM-10 המכיל 1 x 10 5 תאי סרטן שד דirectly על פני השטח החיצוניים, תחתית כל קרום כנס (שהוא פונה כלפי מעלה במוסיף ההפוך). לכסות את תיבת צינור microfuge עם המכסה הסדוק פתוחה ולהעביר אותו לחממת רקמת 37 ° C במשך 45 דקות כדי לקדם מצורף תא.
    3. העבר את תיבת צינור microfuge למכסה מנוע תרבית רקמה, ולהשתמש במלקחיים כדי להפוך את מוסיף זרע צד ימין למעלה ולהעביר אותם לתוך הבארות של צלחת המקלט. FBS 0.450 מיליליטר DMEM-10% פיפטה לכל כוס להוסיף. בעזרת מלקחיים, להעביר בר רקמת עצם אחד (~ 3 מ"מ) לכל כוס להכניס מוכנה. לחלופין, להשתמש בחרוזי זכוכית בקרות שליליות כמו בבארות נוספות. מניחים את הצלחת בתרבית רקמת חממה במשך 20 שעות.
    4. כדי למדוד הגירה, להכין צלחת תרבית רקמה סטנדרטית 24 גם המכילה 1 מיליליטר DMEM-10% FBS בכל טוב. הסר את צלחת המקלט מהחממה ולהשתמש במלקחיים כדי להעביר את שברי עצמות וחרוזים מכל להכניס לתוך בארות נפרדות של הצלחת סטנדרטית. להוסיף luciferinמצע (כדי להשיג ריכוז סופי של 300 מיקרוגרם / מיליליטר) היטב כל אחד ולבצע BLI תוך שימוש בנהלים בצעדים 3.6-3.7.

6. ניתוח לפני ואחרי ניסוי נוסף

  1. ניתוח של מח סמוק.
    1. העבר את בר עצם לתוך מסננת תא 70 מיקרומטר ממוקמת בחלק העליון של צינור חרוטי 50 מיליליטר. השתמש במזרק 10 מיליליטר עם מחט 25 G כדי לשטוף נמרצות הבר עם 10 מיליליטר של PBS לקבל השעיה של תאים במח בצינור חרוטי. צנטריפוגה ההשעיה התא 3 דקות ב 300 XG ו -21 מעלות צלזיוס, לשאוב supernatant ו resuspend תאי pelleted בPBS או הפתרון רצוי אחר לזרימה cytometry.
      הערה: כרכי Resuspension ישתנו בהתאם לגודל של התא גלולה לאחר צנטריפוגה, ויישום.
    2. עבור מבחני כדאיות ~ 75-300 כרכי μl של PBS מתאימים, וניתן לנתח השעיות אלה באמצעות fluorescenc זמין מסחרימבחני כדאיות מבוססות דואר על פי הוראות היצרן, pipetted לתוך hemocytometer קונבנציונלי, וספרו באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי הפוך.
    3. לניתוח cytometric זרימה או מיון המבוסס על זיהוי של תאי סרטן שד GFP חיובי, resuspend התא גלולה ב 1 מיליליטר PBS המכיל 2% FBS, 2 המ"מ EDTA, ו -10 מ"מ HEPES כך שהריכוז הוא 1 x 10 6 תאים / מיליליטר.
  2. H & E מכתים ואימונוהיסטוכימיה.
    1. כדי לעבד את שברים לhematoxylin & eosin (H & E) מכתים ו / או אימונוהיסטוכימיה, למקם את הברים בקלטות פלסטיק שכותרתו עם עיפרון מספר 2, ולצלול במכל המלא עם 10% שנאגרו פורמלין למשך 24 שעות.
    2. רקמות תהליך להטבעת פרפין, חתך ומכתים תוך שימוש בפרוטוקולים שיגרתי הכוללים צעד decalcification כדי להסביר את spicules mineralized בתוך כל בר.

תוצאות

בידוד ברי רקמה מראשי הירך

ראש עצם הירך נאסף ממספר שווה של גברים ונשים חולים (44-90 שנים) שעבר ניתוח להחלפת מפרק ירך בחירה במחלקה לכירורגיה אורטופדיים בבית הספר לרפואה של אוניברסיטת סטנפורד. כל ראש עצם הירך הושלך מכיל חלק קטן של עצם ה...

Discussion

Mehra et al. תיאר בעבר את אוסף הנתיחה שלאחר המוות וניתוח של דגימות עצם של חולי סרטן ערמונית גרורתי שנקטפו בעת הנתיחה שלאחר המוות, חושף רקמות באיכות גבוהות ואימות של השימוש בדגימות עצמות אדם ללמוד את התהליך גרורתי 47. כאן יש לנו תארנו פרוטוקולים לאיסוף, עיבוד ושימ...

Disclosures

No disclosures to report.

Acknowledgements

מחקרים אלו מומנו, בין שאר, על ידי מענקים מהאלטרנטיביים למחקר ופיתוח (107,588), המכון הלאומי לבריאות (1U54CA136465-04S1), ותכנית לחקר סרטן שד קליפורניה (201B-0141). אנו מודים בני הזוג. אנדרו וילבר ור 'סקוט McIvor לתרומתם הנדיבה שלהם פלסמידים transposase transponson וPK / hUbiC-SB11. הכרת תודה אנו מודים ג'ון Tamaresis, Ph.D. לקבלת ייעוץ על שיטות סטטיסטיות, טימותי בראון לביצוע cytometry זרימה, ג'ורג'ט היינריך לקבלת ייעוץ על מבחני הגירה, וננסי Bellagamba להקלה על האוסף של דגימות THR.

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
DMEM (1X) + GlutaMAX-lLife Technologies10569-010Supplement all DMEM with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
McCoy's 5A Medium (1X)Life Technologies16600-082Supplement all McCoy's  with 10% fetal bovine serum and 1% Pen/Strep
Fetal bovine serumLife Technologies16000-044
Penicillen StreptomycinLife Technologies15140-122
Blastocidin (10 mgl/ml)InvivoGen ant-blSupplement media used for transfected cell lines.
Falcon® Cell Culture Inserts for 24 Well Plate with Transparent PET Membrane (8.0 μm pore size)Corning Incorporated353097
Falcon® 24 Well TC-Treated Polystyrene Cell Culture Insert Companion PlateCorning Incorporated353504
LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit *for mammalian cells*Invitrogen Detection TechnologiesL-3224
FluoroBrite DMEMLife TechnologiesA18967-01
D-luciferin firefly, potassium salt 5 g (30 mg/ml)Life TechnologiesL-8220
Sterile Cell Strainer 70 μmFisher Scientific22363548
6 Well TC-Treated Cell Culture ClusterCorning Incorporated3516
12 Well TC-Treated Cell Culture ClusterCorning Incorporated3513
24 Well TC-Treated Cell Culture ClusterCorning Incorporated3526
Friedman-Pearson RongeurFine Science Tools16021-14
Bone waxSurgical Specialties Corporation903
IVIS 50 Imaging PlatformCaliper Life Sciences/PerkinElmer
Living Image Software Program Caliper Life Sciences/PerkinElmer133026
EVOS FL Imaging SystemLife TechnologiesVersion 4.2
OsteoSense 680 EXPerkinElmerNEV10020EX
MCF-7 breast cancer cellsATCCHTB-22
MDA-MB-231 breast cancer cellsATCCHTB-26
Monoclonal mouse anti-human cytokeratin antibodyDAKO CytomationClone (AE1/AE3)

References

  1. Place, A. E., Jin Huh, S., Polyak, K. The microenvironment in breast cancer progression: biology and implications for treatment. Breast Cancer Res. 13, 227 (2011).
  2. Joyce, J. A., Pollard, J. W. Microenvironmental regulation of metastasis. Nat Rev Cancer. 9, 239-252 (2009).
  3. Bissell, M. J., Radisky, D. Putting tumours in context. Nat Rev Cancer. 1, 46-54 (2001).
  4. Coleman, R. E., Rubens, R. D. The clinical course of bone metastases from breast cancer. British journal of cancer. 55, 61-66 (1987).
  5. Mundy, G. R. Metastasis to bone: causes, consequences and therapeutic opportunities. Nat Rev Cancer. 2, 584-593 (2002).
  6. Hess, K. R., et al. Metastatic patterns in adenocarcinoma. Cancer. 106, 1624-1633 (2006).
  7. Clarke, B. Normal bone anatomy and physiology. Clin J Am Soc Nephrol. 3, S131-S139 (2008).
  8. Weatherholt, A. M., Fuchs, R. K., Warden, S. J. Specialized connective tissue: bone, the structural framework of the upper extremity. Journal of hand therapy : official journal of the American Society of Hand Therapists. 25, 123-131 (2012).
  9. Travlos, G. S. Normal structure, function, and histology of the bone marrow. Toxicologic pathology. 34, 548-565 (2006).
  10. Casimiro, S., Guise, T. A., Chirgwin, J. The critical role of the bone microenvironment in cancer metastases. Molecular and cellular endocrinology. 310, 71-81 (2009).
  11. Patel, L. R., Camacho, D. F., Shiozawa, Y., Pienta, K. J., Taichman, R. S. Mechanisms of cancer cell metastasis to the bone: a multistep process. Future Oncol. 7, 1285-1297 (2011).
  12. Goldstein, R. H., Weinberg, R. A., Rosenblatt, M. Of mice and (wo)men: mouse models of breast cancer metastasis to bone. Journal of bone and mineral research : the official journal of the American Society for Bone and Mineral Research. 25, 431-436 (2010).
  13. Kim, I. S., Baek, S. H. Mouse models for breast cancer metastasis. Biochemical and biophysical research communications. 394, 443-447 (2010).
  14. Fantozzi, A., Christofori, G. Mouse models of breast cancer metastasis. Breast Cancer Res. 8, 212 (2006).
  15. Thibaudeau, L., et al. Mimicking breast cancer-induced bone metastasis in vivo: current transplantation models and advanced humanized strategies. Cancer metastasis reviews. 33, 721-735 (2014).
  16. Schiller, K. R., et al. Secretion of MCP-1 and other paracrine factors in a novel tumor-bone coculture model. BMC Cancer. 9, 45 (2009).
  17. Curtin, P., Youm, H., Salih, E. Three-dimensional cancer-bone metastasis model using ex-vivo co-cultures of live calvarial bones and cancer cells. Biomaterials. 33, 1065-1078 (2012).
  18. Krishnan, V., et al. Dynamic interaction between breast cancer cells and osteoblastic tissue: comparison of two- and three-dimensional cultures. Journal of cellular physiology. 226, 2150-2158 (2011).
  19. Krishnan, V., Vogler, E. A., Sosnoski, D. M., Mastro, A. M. In vitro mimics of bone remodeling and the vicious cycle of cancer in bone. Journal of cellular physiology. 229, 453-462 (2014).
  20. Bussard, K. M., Venzon, D. J., Mastro, A. M. Osteoblasts are a major source of inflammatory cytokines in the tumor microenvironment of bone metastatic breast cancer. Journal of cellular biochemistry. 111, 1138-1148 (2010).
  21. Sosnoski, D. M., Krishnan, V., Kraemer, W. J., Dunn-Lewis, C., Mastro, A. M. Changes in Cytokines of the Bone Microenvironment during Breast Cancer Metastasis. International journal of breast cancer. 2012, 160265 (2012).
  22. Bussard, K. M., et al. Localization of osteoblast inflammatory cytokines MCP-1 and VEGF to the matrix of the trabecula of the femur, a target area for metastatic breast cancer cell colonization. Clinical & experimental metastasis. 27, 331-340 (2010).
  23. Kuperwasser, C., et al. A mouse model of human breast cancer metastasis to human bone. Cancer research. 65, 6130-6138 (2005).
  24. Rosenblatt, M. A tale of mice and (wo)men: development of and insights from an 'all human' animal model of breast cancer metastasis to bone. Transactions of the American Clinical and Climatological Association. 123, 135-150 (2012).
  25. Oh, H. S., et al. Bone marrow stroma influences transforming growth factor-beta production in breast cancer cells to regulate c-myc activation of the preprotachykinin-I gene in breast cancer cells. Cancer research. 64, 6327-6336 (2004).
  26. Moharita, A. L., et al. SDF-1alpha regulation in breast cancer cells contacting bone marrow stroma is critical for normal hematopoiesis. Blood. 108, 3245-3252 (2006).
  27. Koro, K., et al. Interactions between breast cancer cells and bone marrow derived cells in vitro define a role for osteopontin in affecting breast cancer cell migration. Breast cancer research and treatment. 126, 73-83 (2011).
  28. Pohorelic, B., et al. Role of Src in breast cancer cell migration and invasion in a breast cell/bone-derived cell microenvironment. Breast cancer research and treatment. 133, 201-214 (2012).
  29. Nicola, M. H., et al. Breast cancer micrometastases: different interactions of carcinoma cells with normal and cancer patients' bone marrow stromata. Clinical & experimental metastasis. 20, 471-479 (2003).
  30. Korah, R., Boots, M., Wieder, R. Integrin alpha5beta1 promotes survival of growth-arrested breast cancer cells: an in vitro paradigm for breast cancer dormancy in bone marrow. Cancer research. 64, 4514-4522 (2004).
  31. Martin, F. T., et al. Potential role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the breast tumour microenvironment: stimulation of epithelial to mesenchymal transition (EMT). Breast cancer research and treatment. 124, 317-326 (2010).
  32. Kapoor, P., Suva, L. J., Welch, D. R., Donahue, H. J. Osteoprotegrin and the bone homing and colonization potential of breast cancer cells. Journal of cellular biochemistry. 103, 30-41 (2008).
  33. Chen, X., Lu, J., Ji, Y., Hong, A., Xie, Q. Cytokines in osteoblast-conditioned medium promote the migration of breast cancer cells. Tumour biology : the journal of the International Society for Oncodevelopmental Biology and Medicine. 35, 791-798 (2014).
  34. Bersini, S., et al. A microfluidic 3D in vitro model for specificity of breast cancer metastasis to bone. Biomaterials. 35, 2454-2461 (2014).
  35. Marlow, R., et al. A novel model of dormancy for bone metastatic breast cancer cells. Cancer research. 73, 6886-6899 (2013).
  36. Yamada, K. M., Cukierman, E. Modeling tissue morphogenesis and cancer in 3D. Cell. 130, 601-610 (2007).
  37. Hutmacher, D. W., et al. Can tissue engineering concepts advance tumor biology research. Trends in biotechnology. 28, 125-133 (2010).
  38. Griffith, L. G., Swartz, M. A. Capturing complex 3D tissue physiology in vitro. Nature reviews. Molecular cell biology. 7, 211-224 (2006).
  39. Hutmacher, D. W. Biomaterials offer cancer research the third dimension. Nature. 9, 90-93 (2010).
  40. Kim, J. B. Three-dimensional tissue culture models in cancer biology. Seminars in cancer biology. 15, 365-377 (2005).
  41. Xu, X., Farach-Carson, M. C., Jia, X. Three-dimensional in vitro tumor models for cancer research and drug evaluation. Biotechnology advances. 32, 1256-1268 (2014).
  42. Dhurjati, R., Krishnan, V., Shuman, L. A., Mastro, A. M., Vogler, E. A. Metastatic breast cancer cells colonize and degrade three-dimensional osteoblastic tissue in vitro. Clinical & experimental metastasis. 25, 741-752 (2008).
  43. Mastro, A. M., Vogler, E. A. A three-dimensional osteogenic tissue model for the study of metastatic tumor cell interactions with bone. Cancer research. 69, 4097-4100 (2009).
  44. Contag, C. H., et al. Monitoring dynamic interactions between breast cancer cells and human bone tissue in a co-culture model. Molecular imaging and biology : MIB : the official publication of the Academy of Molecular Imaging. 16, 158-166 (2014).
  45. Multhaup, M., et al. Cytotoxicity associated with artemis overexpression after lentiviral vector-mediated gene transfer. Human gene therapy. 21, 865-875 (2010).
  46. Thorne, S. H., et al. CNOB/ChrR6, a new prodrug enzyme cancer chemotherapy. Mol Cancer Ther. 8, 333-341 (2009).
  47. Mehra, R., et al. Characterization of bone metastases from rapid autopsies of prostate cancer patients. Clin Cancer Res. 17, 3924-3932 (2011).
  48. Riccio, A. I., Wodajo, F. M., Malawer, M. Metastatic carcinoma of the long bones. Am Fam Physician. 76, 1489-1494 (2007).
  49. Ahmann, G. J., et al. Effect of tissue shipping on plasma cell isolation, viability, and RNA integrity in the context of a centralized good laboratory practice-certified tissue banking facility. Cancer epidemiology, biomarkers & prevention : a publication of the American Association for Cancer Research, cosponsored by the American Society of Preventive Oncology. 17, 666-673 (2008).

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

97osteotropismVivoexplant

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Contact Us

Recommend to library

JoVE NEWSLETTERS

Research

Education

Authors

Librarians

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved