ل<em&gt; في المختبر</em&gt; الخمول نموذج من الاستروجين تراعي سرطان الثدي في نخاع العظام: أداة للدراسات الآلية الجزيئية والجيل الفرضية

Summary

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Abstract

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Introduction

خلايا سرطان الثدي metastasize إلى نخاع العظم قبل المرض قابلا للاكتشاف ^1، في أقرب وقت تتطور الاورام الصغيرة الأوعية الدموية ^2،3. عملية النقيلي سريعا ولكن غير فعالة. الخلايا تدخل الأوعية الدموية الجديدة بسرعة، في ملايين في اليوم الواحد ⁴ ولكن قلة البقاء على قيد الحياة في رحلة إلى أعضاء بعيدة ^5. ومع ذلك، فإن بعض micrometastases البقاء على قيد الحياة في العظام ويمكن العثور عليها كما الخلايا واحد أو كتل الخلايا الصغيرة في شفاطات نخاع العظام من المرضى الذين شخصت حديثا ^1. هذه الخلايا تقاوم العلاج الكيميائي المساعد، والتي تدار لغرض جدا القضاء عليها ^6. وهبت هذه المقاومة، إلى حد كبير، من خلال بقاء الإشارات التي بدأها التفاعل مع نخاع العظام المكروية ^7،8. Micrometastases يمكن العثور عليها في حوالي ثلث النساء المصابات بسرطان الثدي الموضعي وتمثل مؤشرا مستقلا من البقاء على قيد الحياة عند تحليلها عن طريق التحليل وحيد المتغير ^9. بعض micrometastases ل بنمو بدأت، ولكن تعتمد أنماط تكرار على نوع من الخلايا. المرضى الذين يعانون من سرطان الثدي ثلاثي السلبية تميل إلى تتكرر بين 1-4 سنوات، مما يشير إلى ضعف السيطرة على حالة سبات. أنواع الخلايا الأخرى، بما في ذلك ER / PR + الخلايا، يمكن أن تظل كامنة لمدة تصل إلى 20 عاما، مع مطرد وبمعدل المستمر من تكرار ^10. في حين الاختلافات في السكون التوقيعات التعبير الجيني بين ER + وER- خطوط خلايا الثدي والأورام تعكس إمكانات السكون مختلفة ^11، والتفاعلات مع نخاع العظم سدى المرجح تمثل مساهمة كبيرة في السكون.

دراسة السكون في الجسم الحي هي صعبة للغاية بسبب micrometastases نادرة وفاق عدد من الخلايا المكونة للدم بأكثر من 10 ⁶ أضعاف. وبالتالي، لا بد من إنشاء النماذج ذات الصلة التي تقدم في بيانات المختبر التي يمكن اقتراح آليات وتوليد فرضيات قابلة للاختبار في الجسم الحي. وهناك عدد من النماذج السكون، بما في ذلك ماثينماذج matical ^12،13، في المختبر نماذج ^{7،8،14،15،} في النماذج الحية طعم أجنبي ^16، مزيج من في المختبر ونماذج طعم أجنبي ^17،18 والورم والانبثاث نماذج عفوية ^19، وقد أسفرت بعض التبصر الخلايا السرطانية السكون ²⁰ . كل هذه النماذج لدينا القيود الخاصة بها وهي في حد ذاتها مفيدة في المقام الأول لتوليد الفرضيات بشأن الإشارات الجزيئية والتفاعلات التي تحكم السكون لفحصها في أكثر النماذج ذات الصلة بيولوجيا.

مع الهدف العام المتمثل في تحديد الآليات الجزيئية من السكون، والتفاعل مع المكروية التي تؤدي إلى اعتقال دورة، عودة التمايز والمقاومة والآليات العلاجية التي تؤدي إلى تكرار في ER + الخلايا، وضعنا نموذجا في المختبر أن يوفر اختيار العناصر ذات الصلة من انسجة المكروية ^7. هذا النموذج، في حين متفرق نسبيا في كومبو لnents، هو قوي بما فيه الكفاية للسماح للمحققين لاستخلاص الآليات الجزيئية المحددة التي تؤثر على وظائف كبيرة من السكون. هذه التجارب تولد الفرضيات التي يمكن اختبارها بشكل مباشر في الجسم الحي. ويعتمد هذا النموذج على عدد قليل من العناصر الرئيسية التي أثبتنا أن تكون ذات صلة في السكون. وهي تشمل استخدام خلايا سرطان الثدي تعتمد على هرمون الاستروجين والثقافة من الخلايا في مناطق ذات كثافة مولد الرمع حيث تفاعلها هو في المقام الأول مع التحتية ومكونات قابلة للذوبان من المتوسط، وهو التحتية فبرونيكتين وجود عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية (FGF-2) في المتوسط.

نحن تتميز الآليات التي تحكم النظام في المختبر، بما في ذلك تحريض اعتقال دورة الخلية التي كتبها FGF-2 ^21، بوساطة من خلال TGFβ ²² والبقاء يشير من خلال PI3 كيناز ^7،8 و ⁸ ERK والتمايز morphogenic إلى النمط الظاهري الظهارية، التي تعتمد على RhoA تعطيل، إنتغرين45؛ 5β1 upregulation وربط فبرونيكتين انسجة من أجل البقاء ^7،15 (الشكل 1). الآثار في المختبر دورة الخلية من FGF-2 على MCF-7 الخلايا تبدأ في تركيزات سجل واحد على الأقل أقل من 10 نانوغرام / مل ^21،23. واستند المبرر على السيطرة الزمنية للFGF-2 التعبير التي تحكم الثديية التشكل الأقنية، والتوسع دوري والركود في عدد من النظم الثدييات ^24-27. أثبتنا أن FGF-2 يدفع التمايز، بما في ذلك التشكل الأقنية في الثقافة 3D ^28، والتي تضيع عادة مع التحول السرطاني للأورام الإنسان ²⁹ FGF-2 التعبير. بقي التعبير عن FGR1 سليمة في سرطان الثدي التي شملتها الدراسة ²⁹ و MCF-7 الخلايا الاستمرار في التعبير عن كل مستقبلات FGF 4 ^30. في سياق السكون، ويتم تصدير FGF-2 التي وأودعت بشكل كبير على نخاع العظم سدى ^31،32 حيث أنه يعمل في الحفاظ على الخلايا الجذعية المكونة للدم ^33. نحن ماركاonstrated أن FGF-2 يؤدي الى حالة سبات في ER + سرطان الثدي الخلايا المستزرعة على الطبقات التحتية فبرونيكتين، وفيرة أيضا في نخاع، حيث يدفع التمايز morphogenic ^7. في هذا النموذج، خلايا سرطان الثدي ل بنمو مستعمل، تعطيل رو A من خلال RhoGap غراف، redifferentiate إلى النمط الظاهري الظهارية وإعادة اكسبريس integrins α5β1 lost مع تطور خبيث. أنها تربط الفيبرونكتين من خلال إنتغرين α5β1 وتفعيل البقاء على قيد الحياة مما يشير إلى أن تجعلها مقاومة للعلاج السامة للخلايا ^7،8،15 (الشكل 1). وقد تجلى تثبيط GTPases الدرجة رو سابقا للحث على النمط الظاهري نائمة ^34.

ونحن هنا سوف الخطوط العريضة لإجراءات محددة من شأنها أن تسمح للمحققين لإنشاء نموذج ودراسة الآليات الجزيئية والخلوية المحددة التي تحكم السكون من ER + سرطان الثدي الخلايا. في التجارب المقدمة هنا لتوضيح استخدام نموذج، نحن استهدف مسار PI3K (الشكل 1B) مع مثبط AKT ومثبط PI3K وجميع أفراد الأسرة رو (الشكل 1B) مع مثبط لعموم رو رو وكيناز (ROCK) المانع.

Protocol

1. فحص مولد الرمع

1. إعداد تعليق خلية واحدة من خطوط خلايا سرطان الثدي تعتمد على هرمون الاستروجين خلايا MCF-7 وT47D باستخدام الخطوات المبينة أدناه
   1. نضح مستنبت (DMEM / 10٪ الحرارة المعطل مصل العجل الجنين / الجلوتامين والقلم / بكتيريا) من 10 سم الأنسجة صحن الثقافة وهو لا يزيد عن 50٪ متموجة مع MCF-7 أو خلايا T-47D. شطف مع برنامج تلفزيوني. احتضان مع التربسين 0.25٪ / 2.21 ملي EDTA الذائبة في DMEM ارتفاع نسبة الجلوكوز عند 37 درجة مئوية لمدة 1-4 دقيقة.
   2. تحقق الخلايا في 1 دقيقة فترات تحت المجهر النقيض من المرحلة لضمان توزيع خلية واحدة. resuspend الخلايا مع ماصة 2 مل من قبل pipetting صعودا وهبوطا عدة مرات لتعطيل خلية خلية الاتصال لتحقيق، ووضع خلية واحدة ثابت تقريبا.
   3. الاستمرار في احتضان الخلايا في التربسين عند 37 درجة مئوية لمدة تصل إلى 4 دقيقة إذا لاحظت كتل من الخلايا بعد 2 دقيقة فقط من الحضانة. لا تستخدم هذه الخلايا للدراسات مولد الرمع إذا كانت لا تزال ملتصقة على البريدمنظمة العمل ضد الجوع أخرى بعد 4 دقائق من trypsinization لأنه سيتم عرض الخطأ في العائد عدد مستعمرة.
      ملاحظة: إذا تجمعت الخلايا، وعدد من المستعمرات شكلت تعكس نتاج خلايا أقل من عدد المحتضنة. إذا تم trypsinized الخلايا بشكل مفرط، قد تتضاءل قدرتها مولد الرمع.
   4. إعداد تعليق خلية واحدة من 1500 خلية / مل مستنبت لمدة 24 لوحات جيدا، أو أقل، (+ 500 خلية / مل، وهذا يتوقف على نوع من الخلايا أو رقم المرور)، من خلال مسلسل التخفيفات في أنبوب رئيسي واحد يحتوي على وحدة التخزين بالكامل اللازمة ل كافة المتغيرات في التجربة.
      ملاحظة: إن الهدف هو كثافة الخلية النهائية من 800 خلية / سم ² (مجموعة من حوالي 500 إلى 1100 خلية / سم ^2). والهدف من ذلك هو لانتاج ما يقرب من 100 + 50 المستعمرات، والذي يسمح السهل نسبيا العد، ويمنع الازدحام ويسمح مستعمرات كافية لتؤدي إلى فروق ذات دلالة إحصائية عند زيادة المستعمرات أو انخفضت بنسبة perturba تجريبيستعقد.
2. احتضان خلايا في مولد الرمع الكثافة عن طريق الخطوات المذكورة أدناه
   1. احتضان الخلايا في الآبار quadruplicate على 24 لوحات المغلفة فبرونيكتين جيدا في مناطق ذات كثافة مولد الرمع من 1500 خلية / جيدا من سيد واحد أنبوب تعليق خلية من 1500 خلية / مل. يسحن والمتوسطة التي تحتوي على الخلايا مع ماصة 5 مل من خلال وضع 3 مل والاستغناء 1 مل المتوسطة في كل من 2 الآبار.
      ينبغي شراء فيبرونكتين] المغلفة لوحات ما قبل المغلفة من بائع التجاري: ملاحظة. لوحات طلاء خارج لمراقبة الجودة، ونتائج عملية مؤتمتة في سطح متفاوتة غير ملائمة لهذا الاختبار.
   2. مزيج تعليق من قبل pipetting صعودا وهبوطا مع ماصة 5 مل، ووضع 3 مل من تعليق خلية وملء 2 الآبار مع 1 مل لكل منهما. ملء فقط 2 الآبار في وقت واحد من ماصة واحدة. عودة حجم المتبقية في ماصة للتعليق الخلية في أنبوب رئيسي، Resuspend الخلايا مرة أخرى عن طريق pipetting صعودا وهبوطا، ووضع 3 مل آخر لشغل 2 أهلا وسهلا أخرىليرة سورية مع 1 مل لكل منهما.
      ملاحظة: الخلط المستمر من الأنبوب الرئيسي ضروري لأن الخلايا والرواسب بشكل مستمر. وضع كمية كافية لملء فقط 2 الآبار من الضروري إضافة أرقام الهواتف المحمولة مماثلة إلى كل بئر لأن الخلايا الرواسب في ماصة كذلك.
   3. العمل بسرعة لتوزيع كميات كبيرة من الخلايا لخلايا السماح للجلوس في تعليق في درجة حرارة الغرفة وCO ₂ التركيز سوف تعدل المحتملة (الملاحظات غير منشورة) مولد الرمع الخاصة بهم.
   4. تحسين التوزيع المكاني للخلايا أثناء فعل pipetting للهم في الآبار لفحوصات مستعمرة. تفعل ذلك من قبل pipetting ببطء تعليق يحتوي على تركيز الخلية النهائي في منتصف البئر. لا تعرض لوحة لمزيد من الحركة قبل خلايا تترسب في القاع. لا دوامة لوحة لخلط دائري سوف الطرد المركزي بشكل فعال في الخلايا إلى محيط خلق جيدا كثافة عالية الخلية والمستعمرات متموجة لا تحصى في 6 أيام.
      ملاحظة: لا تخلط ما لم يكن ضروريا لأن هذا هو أقل من المرغوب فيه من عدم وجود خلط في كل بعد إدخال حجم مع الخلايا في التعليق. إذا كان ذلك ضروريا لخلط الخلايا، القيام بذلك عن طريق تحريك لوحة ذهابا وإيابا في اتجاهات متعامدة في حين أنها تقوم على سطح مستو.
   5. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية 5٪ CO ₂ دون تغير وسائل الاعلام لمدة 6 أيام. وعدد قليل من الخلايا في بئر بعد 6 أيام لن يؤثر بشكل كبير على المواد الغذائية أو خلوى تكوين ولا الأس الهيدروجيني للوسط الأصلي.
   6. تصميم مدار الساعة من الفحص على النحو التالي: احتضان الخلايا على فبرونيكتين المغلفة الطبقات التحتية في يوم 1. استبدال المتوسطة القائمة مع 1 مل متوسطة جديدة أو متوسطة جديدة تحتوي على 10 نانوغرام / مل في اليوم 0. الخلايا وصمة عار في يوم 6 على النحو التالي 2 FGF- في 1.4). إجراء أي اضطرابات التجريبية في اليوم 3، على النحو التالي في 1.3).
3. إعداد اضطرابات التجريبية من اشارة الجزيئية أو التصاق جزيئات
   1. في يوم 3، إضافة 10056؛ لتر من محلول يحتوي على 10X تركيز المقصود النهائي للعامل إقلاق إلى المتوسطة 1 مل في الآبار. لا تخلط. الاستمرار في احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية، و 5٪ CO ₂ لمدة 3 أيام إضافية.
      ملاحظة: يمكن إقلاق كلاء تشمل مجموعة متنوعة من مثبطات وكلاء حجب جزيئات الالتصاق، والمستقبلات أو البروتينات السطحية الأخرى، مثبطات مسارات الإشارات بين الخلايا، والجزيئات، والعوامل، العوامل المساعدة أو البروتينات الهيكلية، التي قد تلعب دورا في دعم حالة سبات.
   2. المستعمرات وصمة عار في يوم 6 على النحو التالي.
4. المستعمرات وصمة عار
   1. خلايا وصمة عار بعد 6 أيام في الثقافة مع تقدم طازجة 0.1٪ الكريستال البنفسجي في 2٪ من الإيثانول / 10 ملي بورات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 9.0) حل. وسائل الاعلام نضح وإضافة مل حل واحد الكريستال البنفسجي إلى كل بئر لمدة 20 دقيقة.
   2. غسل الأطباق عن طريق غمر لهم الفتحات جيدا أسفل بزاوية حادة إلى دلو الجليد تفيض مع تشغيل مستمر الصنبورالماء في الحوض. إمالة لوحة لزاوية أفقية مرة واحدة تحت الماء، وكذلك فتح أسفل، ثم إمالة ظهر في زاوية حادة عند إزالة في اقتراح واحد المتدفقة لطيف.
   3. تكرار غمر 2 أو 3 مرات حتى الماء في الجزء السفلي من الآبار لم يعد الأزرق. يغسل قوية قد يزيل الخلايا أو المستعمرات التي هي أقل تمسكا بسبب التدخل التجريبي، مضيفا إلى حد كبير في الخطأ في العد والبيانات.
   4. لوحات الجافة بين عشية وضحاها عن طريق وضعها رأسا على عقب على المناشف على أعلى مقاعد البدلاء بجوار الموافق أغلفتها المسمى.
5. عد المستعمرات
   1. حساب عدد من النمو ونائمة المستعمرات في كل بئر بعد 6 أيام من الحضانة، وتلطيخ والتجفيف. عد المستعمرات على النحو الأمثل في 40X التكبير في المجهر النقيض من المرحلة مقلوب. عد مستعمرات> 30 الخلايا كما تزايد والمستعمرات من 12 أو أقل الخلايا، مع ظهور الصرفي من الحجم الكبير جدا مقارنة مع نمو الخلايا، تنمية الصادرات الكبيرةالسيتوبلازم nded مع السيتوبلازم كبير لنواة النسب، كما هو موضح في الشكل رقم 1 ^7،15.
      ملاحظة: لا يتم حساب مجموعات من 13-29 الخلايا عادة لأنها ليست متكررة جدا في فحوصات السكون مباشرة. ويمكن عدها إذا اضطرابات تحول إمكانات النمو في النمو أو نائمة الخلايا. وهذه النتائج بعد ذلك تحتاج إلى أن تكون مرتبطة مع الأهمية البيولوجية.

2. مولد الرمع الحضانة للدراسات المناعي

1. ضبط أعداد الخلايا إلى ما يقرب من 7،500-8،000 خلايا / جيد في 6 لوحات جيدا، لتتوافق مع الخلية الأرقام / مساحة مماثلة ل24 تجارب جيدا.
2. وضع الجولة، عقيم، المغلفة فبرونيكتين زلة تغطية في كل قاعدة جيدا من 6 لوحات جيدا للدراسات التصوير قبل إضافة الخلية. الخلايا الماصة في 3 مل مجلدات في كل بئر 2 الآبار في وقت بتركيزات الخطوط العريضة، كما هو موضح في التجارب مولد الرمع أعلاه في 1.2).
3. احتضان خلايالمدة 6 أيام، على النحو الوارد أعلاه في 1.2.4 و1.2.5. إضافة عوامل مشوشة في يوم 3 في 10X التركيزات في 300 مجلدات ميكرولتر، كما هو موضح في إجراءات الفحص في مستعمرة 1.3).
4. خلايا وصمة عار في يوم 6 مع الأجسام المضادة إلى الخلية جزيئات الالتصاق مثل integrins α4، α5، α6، β1، β3، على سبيل المثال، التصاق التنسيق الجزيئات المعقدة FAK، paxillin وvinculin، على سبيل المثال، والبروتينات المشاركة في الحركة مثل α تويولين، على سبيل المثال، يشير أعضاء المسار مثل الفوسفات-AKT، الفوسفات، ERK، الفوسفات-P38، الفوسفات، JNK، على سبيل المثال، أو أي بروتين آخر وهذا هو الهدف من التحقيق لدورها في السكون، وذلك باستخدام تقنيات قياسية لمباشرة أو غير مباشرة تلوين المناعي.
   1. إزالة الشرائح مع ملقط يوم 6. الإصلاح في الأسيتون / الميثانول 1: 1 في -20 ° C لمدة 20 دقيقة والهواء الجاف. وتثبيتي بديل، مثل امتصاص العرق، يمكن أن تستخدم، إذا لزم الأمر. خلايا Permeabilize مع 0.1٪ تريتون X-100، 0.1٪ سيترات الصوديوم لمدة 2 دقيقة وأو الكشف عن مستضدات الخلايا. غسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
   2. لتلطيخ immunofluorecence غير مباشر، والشرائح كتلة لمدة 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة مع 5٪ BSA أو مع 10٪ مصل preimmune من الأنواع التي تم فيها إنشاء الأجسام المضادة الثانوية.
   3. احتضان بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الأجسام المضادة الأولية إلى الخلية التصاق جزيئات، والجزيئات المعقدة التنسيق، مما يشير أعضاء ممرا أو أي بروتين آخر وهذا هو الهدف من التحقيق لدورها في السكون المخفف لالتخفيفات محددة موصى بها من قبل الشركة المصنعة في برنامج تلفزيوني 0.1٪ تريتون X -100.
   4. يغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. احتضان زلات غطاء مع الأجسام المضادة fluorophor مترافق في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة. وكمثال على ذلك، فلور اليكسا 488 حمار المضادة للماوس مفتش الأضداد يمكن استخدامها للكشف عن الأجسام المضادة وحيدة النسيلة الأولية الفئران. جبل coverslips الجانب الخلية أسفل على الشرائح الزجاجية باستخدام وكيل antifade مع دابي. ختم محيط بطلاء الأظافر.
   5. لالمناعي المباشر، تنفيذ BSAمنع على النحو الوارد أعلاه في 2.4.2)، واحتضان مع fluorophor مترافق الأجسام المضادة الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية. يغسل 3 مرات مع برنامج تلفزيوني. احتضان الشرائح مع وكيل antifade ودابي وختم بطلاء الأظافر.
   6. صواني غطاء الشريحة بورق الألمنيوم وتخزينها في 4 ° C للتصوير والتصوير في أي وقت حتى بعد عدة أسابيع. عرض وتصوير الخلايا باستخدام أي أنظمة التصوير المجهري مضان مجهزة بكاميرا في 1،000x التكبير.
   7. لييفي الأكتين تلطيخ، والشرائح كتلة في 1٪ ألبومين المصل البقري (BSA) لمدة 30 دقيقة واحتضان في BODIPY FL-Phallacidin (الأخضر) أو رودامين phalloidin (الأحمر) في درجة حرارة الغرفة لمدة 20 دقيقة. إضافة كيلا antifade وختم على النحو الوارد أعلاه.

3. مولد الرمع الحضانة للدراسات الجزيئية

1. البقع الغربية
   1. احتضان ER + خلايا سرطان الثدي MCF-7 أو T47D بكثافات مولد الرمع من 20000 خلية / 60 ملم لوحة و 50،000 خلية / 100 ملم لوحة على fibronecلوحات عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO ₂ المغلفة القصدير.
   2. احتضان الخلايا بكثافات أعلى قليلا من 75000 خلية / 100 ملم لوحة للدراسات الجزيئية التي تتطلب كميات ملغ من البروتين من لست]. استخدام ما يصل إلى عشر لوحات لكل نقطة التجريبية لجمع ما يكفي من البروتين للدراسات الجزيئية باستخدام البقع الغربية أو لعزل الحمض النووي الريبي لالبقع الشمالية.
   3. عدد الخلايا هلام مقرها التحميل هو مساعد ضروري لمقارنة تعبير البروتين في خلايا النمو ونائمة مختلفة الحجم إلى حد كبير. جمع الخلايا عن طريق trypsinizing والاعتماد قسامة في عدادة الكريات في 0.2٪ التريبان الأزرق لإعداد لست] عن البقع الغربية بدلا من كشط الخلايا مع حافة شفرة واحدة.
   4. خلايا الطرد المركزي في 10000 x ج لمدة 2 دقيقة، وإزالة وسائل الإعلام التي كتبها الطموح، إضافة 200 العازلة تحلل ميكرولتر، يصوتن الخلايا في تحلل العازلة وتحديد تركيز البروتين.
   5. حساب كمية البروتين في الخلايا عن طريق قسمة العائد البروتين عن طريق عدد الخلاياالتي ولدت هذا المبلغ. تحميل المحللة في كل بئر من المواد الهلامية بولي أكريلاميد منفصلة تمثل كل من أ) المبالغ المعادلة من البروتين وب) كميات البروتين التي تمثل أرقام الهواتف المحمولة مماثلة. يجب أن يتم تحميل 25 على الأقل من البروتين ميكروغرام في كل بئر.
      ملاحظة: هذا سوف يسمح مقارنات بين النمو ونائمة الخلايا، والتي تختلف بشكل كبير في حجم ومحتوى البروتين (الشكل 1).
2. التدفق الخلوي
   1. جمع الخلايا من 100 ملم لوحات من قبل trypsinization، كما هو الحال في 3.1 وتحليلها عن طريق معيار مضان خلية تنشيط الفرز (FACS) البروتوكولات باستخدام الابتدائي أو الثانوي تلطيخ المناعي للمستضدات إما داخل الخلايا أو الخلية، كما هو موضح في 2.4.
      ملاحظة: فك الخلايا من لوحات زراعة الأنسجة عن طريق trypsinization لا يؤثر على تركيز بروتينات الغشاء على النحو الذي يحدده وضع العلامات الأجسام المضادة.

النتائج

وأجريت التجارب أن ألخص الفحص. يظهر مدار الساعة من التجربة في الشكل 2A. يتم تحضين الخلايا في كثافة مولد الرمع يوم -1، يضاف FGF-2 في متوسطة جديدة في اليوم 0 ويتم استزراع خلايا حتى يوم 6 عندما الملون أنها وتحسب المستعمرات. تدار أي اضطرابات للنظام في يوم 3 في 100 مجلدا...

Discussion

يتكون لدينا نموذج من عدة عناصر أساسية من السكون في نخاع العظام. وهو يتألف من الاستروجين الخلايا الحساسة، والتي هي نوع من المرجح أن تظل كامنة في نخاع لفترات طويلة ^10، وتتكون من فبرونيكتين، وهو العنصر الهيكلي الرئيسي للنخاع، FGF-2، وهو عامل نمو توليفها بوفرة من قبل ?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
T47D cells	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin	Corning	354088
6 Well tissue culture plate	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid	Corning	25-005-CI
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase	Cytoskeleton	CTO3	Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)	Molecular Probes	B607	Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)	Molecular Probes	R415	Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent	Molecular Probes	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P-36931