Bir<em&gt; In Vitro</em&gt; Kemik İliği östrojen duyarlı Meme Kanseri Dormansi Model: Moleküler Mekanizması Çalışmaları ve Hipotez Üretimi için A Takım

Özet

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Özet

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Giriş

Hastalık kısa sürede küçük tümörler kan damarlarını ^2,3 geliştirmek olarak saptanabilir ¹ önce meme kanseri hücrelerinin kemik iliğine metastaz. Metastatik sürecin hızlı ama verimsiz. Hücreler günde ⁴ başına milyonlarca hızla yeni kan damarları girmek ancak birkaç uzak organlara ⁵ gezi hayatta. Bununla beraber, bazı mikrometastazlar kemik hayatta ve tek hücre veya yeni tanı konmuş hastaların ¹ kemik iliği aspiratlarında küçük hücreli kümeleri olarak bulunabilir. Bu hücreler, onları ⁶ ortadan kaldırmak çok amaç için uygulanır adjuvan kemoterapi, karşı. Bu direnç kemik iliği mikroçevresindeki ^7,8 ile etkileşimler tarafından başlatılan sinyalizasyon canlılığında, esasen, sahip olduğunu. Mikrometastaz lokalize meme kanseri olan kadınların yaklaşık üçte birinde bulunabilir ve tek değişkenli analizde ⁹ tarafından bakıldığında sağkalım bağımsız göstergesi temsil edilebilir. Bazı micromeyıda metastaz yapmış büyüme başlatılan, ancak nüks hücre türüne bağlıdır. Üçlü negatif meme kanserli hastalar uykuda devlet üzerinde kötü kontrol düşündüren, 1 ila 4 yıl arasında tekrarlama eğilimindedir. ER / PR + hücreleri de dahil olmak üzere diğer hücre tipleri, nüks ¹⁰ sabit, sürekli oranı ile en fazla 20 yıl boyunca uykuda kalabilir. ER + ve ER- meme hücre hatları ve tümörler arasında dinlenme gen ifadesi imzaları farklılıklar farklı dinlenme potansiyelleri ¹¹ yansıtmak iken, kemik iliği stroma ile etkileşimleri olası dinlenmesi önemli bir katkı oluşturmaktadır.

mikrometastazlar nadirdir ve 10'dan fazla ⁶ kat ile hematopoetik hücreler tarafından sayıca az, çünkü in vivo uyuşukluk çalışma son derece zordur. Bu nedenle, ilgili modelleri mekanizmaları önermek ve in vivo test edilebilir hipotezler üretebilir in vitro verilere sağladığı oluşturulmalıdır. MATHE içeren dinlenme modellerinin bir sayımatical modeller ^12,13, in vitro modeller ^7,8,14,15, in vivo ksenograft modelleri ^16, in vitro kombinasyonları ve ksenograft modelleri ^17,18 ve spontan tümör ve metastaz modelleri ^19, kanser hücresi dinlenmesi ²⁰ içine bazı bilgiler vermiştir . Bu modellerin her biri, kendi sınırlamaları vardır ve kendileri moleküler sinyalizasyon ve dormansi daha biyolojik ilgili modelleri test edilmesi yöneten etkileşimler ile ilgili hipotezler üretme için öncelikle yararlıdır.

Dormansinin moleküler mekanizmaları, ER + hücreleri nüks neden döngüsü tutuklama, redifferentiation ve tedavi direnci ve mekanizmalar ile sonuçlanan mikroçevresinin ile etkileşimleri tanımlayan genel hedefi ile, ilgili unsurları seçilmiş sağlayan bir in vitro model geliştirdi stromal mikroçevresinin ^7. Kendi bilefleninde ise nispeten seyrek Bu model,alınan parçaları, dormansi önemli fonksiyonlarını etkileyen spesifik moleküler mekanizmaları elde etmek için araştırmacılar izin yeterince sağlamdır. Bu deneyler, doğrudan in vivo test edilebilir hipotezler üretir. Model biz dormansi ilgili olduğu gösterilmiştir birkaç temel unsuru dayanır. Bunlar etkileşimi alt tabakası ve orta çözünür bileşenler, bir fibronektin alt tabaka ve bazik fibroblast büyüme faktörünün varlığı ile öncelikle bir klonojenik yoğunlukta estrojene bağlı meme kanseri hücrelerinin, hücre kültürünün kullanımı (FGF-2) ortam içinde.

Biz, TGFβ ²² aracılık FGF-2 ²¹ ile hücre döngüsü tutuklama indüksiyon dahil olmak üzere in vitro sistemi yöneten mekanizmalar, karakterize bağlıydı bir epitel fenotip için PI3 Kinaz ^7,8 ve ERK ⁸ ve morfojenik farklılaşma yoluyla sinyal sağkalım RhoA inaktivasyonu integrin45; 5β1 upregülasyonu ve hayatta kalma için ^7,15 stromal fibronektin ligasyonu (Şekil 1). MCF-7 hücreleri üzerinde FGF-2, in vitro hücre döngüsü etkileri konsantrasyonlarda 10 ng / ml ^21,23 altında en az bir günlük başlar. mantık memeli sistemlerinde ^24-27 bir dizi meme kanalı morfojenezi siklik genişleme ve durgunluk yöneten FGF-2 ifadesinin zamansal kontrol dayanıyordu. Biz FGF-2 duktal 3D kültür ²⁸ morfogenez ve genellikle insan tümörlerinin ²⁹ malign transformasyonu ile kaybolur FGF-2 ifadesi de dahil olmak üzere, farklılaşmasını uyardığı gösterilmiştir. FGR1 ifadesi, tüm 4 FGF alıcılarını ³⁰ ifade etmeye devam ²⁹ ve MCF-7 hücreleri incelenen göğüs karsinomalarında bozulmadan kalmıştır. Uyuşukluk bağlamında, FGF-2 tarafından verilen ve ağır hematopoetik kök hücrelerin ³³ korunmasında fonksiyonları, kemik iliği stroma ^31,32 üzerine bırakılır. Biz demFGF-2 o morfojenik farklılaşmasını ⁷ indükler kemik iliğinde, ayrıca bol fibronektin Tabakasındaki, kültüre ER + meme kanseri hücrelerinde sönmüş bir devlet uyardığı belirlenmiütir. Modelde, göğüs kanseri hücrelerinin büyümesi inhibe edilir, RhoGap GRAF ile Rho A inaktive epitelyal fenotipe redifferentiate ve habis ilerlemesi ile integrinleri α5β1 lost-ekspres yeniden. Bu integrin α5β1 ile fibronektin bağlanan ve bu sitotoksik tedavi ^7,8,15 (Şekil 1), karşı dirençli hale sinyal hayatta aktive eder. Rho sınıfı GTPases inhibisyonu atıl bir fenotip ³⁴ uyarılması için, daha önce ortaya konmuştur.

Burada modelini kurmak ve ER + meme kanseri hücrelerinin dormansi düzenleyen spesifik moleküler ve hücresel mekanizmaları incelemek için araştırmacılar izin verecektir belirli prosedürleri açıklayacağım. Burada yer alan deneylerde modeli kullanımını göstermek içinBiz bir Akt inhibitörü ve bir PI3K inhibitörü ve bir pan-Rho inhibitörü ve bir Rho Kinaz (ROCK) inhibitörü ile Rho ailesi (Şekil 1B) tüm üyeleri ile PI3K yolu (Şekil 1B) hedef aldı.

Protokol

1. clonogenic Deneyi

1. Adımları kullanarak MCF-7 ve T47D hücreleri aşağıda belirtilen estrojene bağlı meme kanseri hücre çizgilerinin bir tek hücre süspansiyonlarının hazırlanması
   1. MCF-7 ya da T-47D hücreleri ile en fazla% 50 konfluent bir 10 cm'lik bir doku kültürü kabı kültür ortamı (DMEM /% 10 ısı ile inaktive edilmiş fetal dana serumu / glutamin ve pen / strep) aspire. PBS ile durulayın. 1-4 dakika boyunca, 37 ° C'de% 0.25 / 2.21 mM EDTA DMEM yüksek glukoz içinde çözüldü tripsin kuluçkalayın.
   2. Tek bir hücre dağılımı sağlamak için faz kontrast mikroskop altında 1 dakika aralıklarla hücreleri kontrol edin. Hemen hemen değişmez, tek hücre durumunu elde etmek için, hücre-hücre teması bozmak için birkaç kez pipetleme ve aşağı 2 mi pipet ile tekrar süspansiyon hücreleri.
   3. Inkübasyon sadece 2 dakika sonra, hücre kümeleri gözlemlemek halinde en fazla 4 dakika boyunca 37 ° C'de tripsin hücreleri inkübe devam edin. Onlar e yapışık kalırsa clonogenic çalışmalar için bu hücreleri kullanmayıntrypsinization 4 dakika sonra diğer ach hata koloni sayısı veriminde tanıtılacak çünkü.
      NOT: Hücreler clumped ise, oluşan kolonilerin sayısı kuluçkaya sayısından daha az hücre ürünü yansıtacaktır. Hücreler aşırı tripsinize edilir ise, bunların klonojenik potansiyeli azalabilir.
   4. Için gerekli olan tüm birimi ihtiva eden bir ana tüp içinde seri seyreltmeler ile, (hücre türü ya da geçiş sayısına bağlı olarak, + 500 hücre / ml) 24 yuvalı plakalar ya da daha az, / ml kültür ortamı 1500 hücrelerinin tek bir hücre süspansiyonu hazırlamak deneyde tüm değişkenler.
      Not: Amaç 800 hücre / ^cm2 (yaklaşık 500 1.100 hücre / ^cm2 aralığında) bir nihai hücre yoğunluğu. amacı, nispeten kolay sayma izin veren, yaklaşık 100 ± 50 koloniler elde etmek için olan engellerse ve koloniler artan ya da deneysel perturba azalmıştır zaman istatistiksel olarak anlamlı farklar ile sonuçlanması için yeterli koloniler izin verirleri.
2. Adımlar Kullanma Clonogenic Yoğunluk inkübe Hücreler Aşağıda Outlined
   1. 1500 hücre / ml'lik bir ana tek bir hücre süspansiyonu tüp / oyuk 1500 hücre klonojenik yoğunlukta 24 yuvalı fibronektin kaplı plakalar üzerine dört kere ölçülen kuyucuklardaki hücreleri inkübe edin. 3 ml hazırlanması ve 2 kuyu her 1 ml ortam dağıtma ile 5 ml pipet olan hücreleri içeren bir ortam Karışım.
      Not: fibronektin kaplı plakalar önceden kaplanmış satın alınması gereken bir ticari bir satıcıdan. Kontrollü bir kalite dışında Kaplama tabaklar, pürüzlü bir yüzeyde otomatik işlem sonuçları bu deney için elverişsiz.
   2. , 5 ml pipet ile pipetleme ve aşağı süspansiyon karıştırın hücre süspansiyonu 3 ml hazırlamak ve 1 ml her biri 2 kuyu doldurun. Tek pipet herhangi bir anda sadece 2 kuyu doldurun. Aşağı yukarı pipetleme ve tekrar ana tüp içinde hücre süspansiyonu pipet tekrar süspansiyon hücreleri kalan hacim dönün ve başka bir 2 wel doldurmak için başka 3 ml hazırlamak1 ml her biri ls.
      NOT: Hücreler sürekli tortu çünkü ana borusunun sürekli karıştırma gereklidir. Sadece 2 kuyu doldurmak için yeterli sesini Çizim hücrelerin yanı sıra pipet tortu, çünkü her bir kuyunun benzer hücre sayıları eklemek gerekir.
   3. Izin hücreler clonogenic potansiyel (yayınlanmamış gözlemler) modüle edecek oda sıcaklığında ve CO ₂ konsantrasyonunda süspansiyon oturup çünkü hücrelerin geniş hacimli dağıtmak için hızla çalışın.
   4. Koloni deneyleri için kuyulara içine pipetleme eylemi sırasında hücrelerin mekansal dağılımını optimize edin. Yavaş yavaş kuyunun ortasına nihai hücre konsantrasyonu içeren süspansiyonu pipetleme bunu. Hücreler dibe önce hareket ilerletmek için plaka maruz bırakmayın. Dairesel karıştırma etkin bir 6 gün iyi yaratarak yüksek hücre yoğunlukları ve sayılamayan konfluen kolonilerinin çevresine hücreleri santrifüj çünkü plaka girdap etmeyin.
      NOT: Bu tüm süspansiyon hücreleri ile ses tanıttıktan sonra hiçbir karıştırma daha az tercih edilir çünkü gerekli olmadıkça karıştırmayın. Bu hücrelerin karışımı için gerekli ise, düz bir yüzeye duruyor ise dik yönlerde ileri geri hareket ettirerek plakayı bunu.
   5. 6 gün süre ile ortam değişikliği olmadan, 37 ° C'de% 5 _CO2 ile inkübe hücreleri. iyi 6 gün sonra hücrelerin sayısının az ölçüde besin veya sitokin kompozisyonu ne de orijinal ortamın pH etkisi olmayacaktır.
   6. Analiz aşağıda belirtildiği gibi zaman sürecini Tasarım: 1 ml taze ortam ve taze ortam içeren ortam, mevcut yerine 1. günde fibronektin kaplı alt tabakalarının üzerinde hücrelerin inkübe FGF-2 aşağıdaki 6. günde 0. günde Leke hücreleri üzerinde 10 ng / ml 1.4). ) 1.3 olarak aşağıda, 3. günde herhangi bir deneysel tedirginlikler yürütün.
3. Moleküler Sinyali veya Adezyon Molekülleri Kurma Deneysel pertürbasyonlarının
   1. 3 gün, 100 eklemek56; kuyularda 1 mi ortamına bozucu maddenin nihai amaçlanan konsantrasyonu 10x ihtiva eden bir çözeltiye, l. Karıştırma. İlave bir 3 gün için 37 ° C,% 5 _CO2 inkübe hücreleri devam edin.
      Not: maddeler rahatsızlık vermesini atıl durumunu desteklemek rol oynayabilir bir önleyicileri çeşitli ve yapışma moleküllerinin, reseptör veya diğer yüzey proteinleri, hücre içi sinyal yolları, moleküller, faktör, kofaktörler veya yapısal proteinlerin inhibitörleri bloke edici ajanlar içerebilir.
   2. 6. günde leke koloniler, aşağıdaki gibi.
4. Leke Koloniler
   1. % 2 etanol / 10 mM sodyum borat taze yapılmış bir% 0.1 kristal violet (pH 9.0) çözeltisi ile kültür içinde 6 gün sonra leke hücreleri. Aspire ortam ve 20 dakika boyunca her bir göze bir ml kristal viyole çözeltisi ilave edilir.
   2. Bir buz kovası içine dar bir açıyla aşağı bakacak kuyu açıklıklar sürekli çalışan musluk ile taşan onları daldırarak plakaları yıkayınlavabo su. Kez sualtı yatay açı plaka yatırın kuyuya açarak ve bir yumuşak akan hareket çıkarırken daha sonra bir dar açıda geri yatırın.
   3. Kuyuların dibinde su artık mavi olana kadar daldırma 2 ya da 3 kez tekrarlayın. Güçlü yıkama sayma ve veri hata önemli ölçüde katkı, deneysel müdahale daha az yapışkan olan hücreler ya da koloniler kaldırabilir.
   4. Baş aşağı bunlara karşılık gelen etiketli kapakları bitişik tezgah üstünde havlu yerleştirerek gecede Kuru plakalar.
5. Koloni Sayısı
   1. İnkübasyon, boyama ve kurutma her iyi sonra 6 gün büyüyen ve uykuda kolonilerin sayısını. Bir ters faz kontrast mikroskop optimal 40X büyütmede kolonileri sayın. Hücreler büyüdükten büyük expa kıyasla çok büyük boyutta morfolojik görünüşü ile, büyüyen ve 12 ya da daha az hücre koloniler olarak> 30 hücre kolonileri sayınBüyük sitoplazmalı NDED sitoplazma Şekil 1'de ^7,15 gösterilen oranları, çekirdeğe.
      NOT: basit uyuşukluk tayinlerde çok sık değil gibi 13-29 hücre kümeleri normal sayılmaz. Tedirginlikler ya büyüyen ya da durağan hücrelerin büyüme potansiyelini vardiya halinde Onlar sayılabilir. Bu sonuçlar, daha sonra biyolojik öneme sahip ilişki gerekecektir.

İmmünofloresan Çalışmaları 2. clonogenic Kuluçka

1. Sayılar / 24 yuvalı deneylere benzer bir yüzey alanı hücre karşılık, 6 oyuklu plakalarda / oyuk yaklaşık 7,500-8,000 hücrelere hücre sayısını ayarlar.
2. Hücre eklenmesinden önce görüntüleme çalışmaları için 6 oyuklu plakaların her bir oyuğa tabanına yuvarlak steril, fibronektin kaplı kapak kayma yerleştirin. ) 1.2 yukarıda clonogenic deneyler için tarif edildiği gibi, her kuyuya 3 ml hacminde Pipetleyin hücreleri konsantrasyonlarda bir anda 2 kuyu, ana hatlarıyla.
3. Inkübe hücreleriYukarıdaki 1.2.4 ve 1.2.5, 6 gün için. 1,3 koloni deneyi prosedürleri de tarif edildiği gibi), 300 ul hacminde 10 x konsantrasyonda günde 3 bozucu etkenler ekleyin.
4. Antikorlarla 6. günde Leke hücreleri, örneğin integrinler α4, α5, α6, β1, β3, örneğin fokal yapışma karmaşık moleküllerdir FAK, paxillin ve vinkülin olarak hücre yapıştırma moleküllerine, örneğin α-tubulin motilitesinde karışan proteinler, örneğin, fosfo-Akt, fosfo-ERK, fosfo-p38, fosfo-JNK, örneğin, ya da uyuşukluk rolü için araştırmanın hedefi, doğrudan ya da dolaylı olarak ilişkin standart teknikler kullanılarak, herhangi bir başka protein gibi sinyal yolu üyeleri immünofloresan boyama.
   1. Aseton forseps gün 6. Fix slaytları çıkarın / metanol 1: 1 -20 ° C'de 20 dakika ve kuru hava için ° C. Alternatif bir sabitleyici, gerektiğinde paraformaldehid gibi, kullanılabilmektedir. 2 dakika f% 0.1 Triton X-100,% 0.1 sodyum sitrat ile Permeabilize hücrelerihücre içi antijenlere ya da tespiti. Hücrelerin PBS ile yıkayın.
   2. Dolaylı immunofluorecence boyama,% 5 BSA ile oda sıcaklığında 1 saat süre ile ya da ikincil bir antikor elde edildiği türe% 10 preimmün serum blok slaytlar için.
   3. Yol üyeleri veya PBS içinde üretici tarafından tavsiye edilen özel dilüsyonları seyreltilmiş uyuşukluk rolü için araştırmanın hedefi olan herhangi bir başka protein sinyalizasyon, yapışma molekülleri, fokal moleküllerin hücre primer antikorlar ile 4 ° C'de gece boyunca inkübe% 0.1 TRİTON X- -100.
   4. 3 kez PBS ile yıkayın. 2 st için oda sıcaklığında florofor-konjuge antikor ile kapak slipi inkübe edin. Bir örnek olarak, Alexa Fluor 488 eşek anti-fare IgG antikoru murin monoklonal primer antikorları tespit etmek için kullanılabilir. Dağı Dapi ile antifade madde kullanılarak cam slaytlar aşağı hücre tarafı lamelleri. Oje ile çevrelerinin Seal.
   5. Doğrudan Immünofloresan için, BSA yürütmekYukarıdaki 2.4.2) bloke 4 ° C'de gece boyunca florofor ile konjüge primer antikor ile inkübe edin. 3 kez PBS ile yıkayın. Oje ile bir antifade ajan ve Dapi ve mühür ile slaytlar kuluçkaya yatmaktadır.
   6. 4 ° C'de alüminyum folyo ve mağaza ile Kapak slayt tepsiler Görüntüleme ve fotoğrafçılık zaman kadar birkaç hafta sonra C °. 1,000x büyütmede bir kamera ile donatılmış herhangi bir floresan mikroskobik görüntüleme sistemlerini kullanarak görüntüleme ve fotoğraf hücreleri.
   7. Fibril aktin boyama için,% 1 sığır serum albümini (BSA), blok slaytlar, 30 dakika ve 20 dakika boyunca oda sıcaklığında BODIPY FL-Phallacidin (yeşil) ya da Rhodamine phalloidin (kırmızı) inkübe edilir. Bir antifade maddesi ekleyin ve yukarıdaki gibi mühür.

Moleküler Çalışmaları 3. clonogenic Kuluçka

1. Western blot
   1. Fibronec 20.000 hücre / 60 mm levha ve 50,000 hücre / 100 mm plaka klonojenik yoğunluklarda ER + meme kanseri hücreleri, MCF-7 ya da T47D inkübekalay kaplı% 5 _CO2 içinde 37 ° C'de plakalar.
   2. Lizatlanndan protein mg miktarlarda gerektiren moleküler çalışmalar için 75.000 hücre / 100 mm plaka biraz daha yüksek yoğunluklarda hücreleri inkübe. Western lekeleri kullanılarak molekül çalışmalar ya da Northern blotlar için RNA izolasyonu için yeterli protein toplamak için deney noktası için on plakalara kullanın.
   3. Hücre sayısı göre jel yükleme çok farklı büyüklükte büyüyen ve durağan hücrelerde protein ifadesini karşılaştırmak için gerekli bir ilave maddedir. Trypsinizing hücreleri toplamak ve yerine tek kenar bıçak ile hücrelerin kapalı kazıma Western lekeleriyle için lizatları hazırlanması için% 0.2 Tripan Mavi bir hemositometrede bir kısım saymak.
   4. Santrifüj hücreler 2 dakika için 10,000 x g'de, aspirasyon ile ortamını çıkarın 200 ul liziz tamponu ilave lizis tampon hücreleri sonikasyon ve protein konsantrasyonu belirlenir.
   5. Hücrelerin sayısına göre protein verimi bölünmesiyle hücre başına protein miktarını hesaplayıno miktarda üretilir. Eşdeğer hücre sayıları temsil protein) eşdeğer miktarlarda ve B) protein miktarları hem de temsil eden ayrı bir poliakrilamid jeller her kuyuya lizat yükleyin. En az 25 ug protein, her bir kuyunun içine yüklenmiş olması gerekir.
      NOT: Bu boyut ve protein içeriği (şekil 1) önemli ölçüde farklı olan büyüyen ve uykuda hücreleri arasında karşılaştırmalar izin verir.
2. Akış sitometrisi
   1. 3.1 gibi, tripsinizasyon ile 100 mm tabak hücreleri toplamak ve 2.4 de tarif edilen hücre içi ya da hücre dışı antijenlere ya birincil veya ikincil immünofloresan boyama ile (FACS) protokollerini ayırma, standart floresan aktive hücre tarafından analiz eder.
      Not: Antikor etiketleme ile belirlendiği gibi tripsinizasyon ile doku kültürü plakalarından hücrelerin ayrılması membran proteinlerinin konsantrasyonu etkilemez.

Sonuçlar

Deneyler tahlili özetlemek için yürütülmüştür. Deney zaman süreci Şekil 2A'da gösterilmiştir. Hücreler, gün -1 'de klonojenik yoğunlukta inkübe edilir, FGF-2, taze ortam içinde 0. günde ilave edilir ve boyanmış ve koloniler sayılmıştır, hücreler 6 gün kadar kültürlenir. Sistem için herhangi bir pertürbasyonlar 10 X son konsantrasyonda 100 ul hacim içinde 3. günde tatbik edilmektedir, istenen. Şekil 2B büyüyen ve atıl kolonilerin tipik bi...

Tartışmalar

Bizim modeli kemik iliğindeki uyuşukluk birkaç anahtar unsurlarından oluşur. O fibronektin, kemik iliği önemli bir yapı elemanının, FGF-2, bir büyüme faktörü bol kemik iliği stroma ile sentezlenebilir oluşur, östrojen uzun süreler için ¹⁰ iliğinde atıl kalması muhtemel tip duyarlı hücreler, oluşmaktadır ve ağır etkileşimleri alt tabaka ile öncelikle klonojenik yoğunlukta hücrelerin kemik iliğinden ^31,32 ve inkübasyon dışı matriks içinde yatırılır. Kemik ili?...

Malzemeler

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
T47D cells	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin	Corning	354088
6 Well tissue culture plate	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid	Corning	25-005-CI
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase	Cytoskeleton	CTO3	Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)	Molecular Probes	B607	Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)	Molecular Probes	R415	Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent	Molecular Probes	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P-36931