Ein<em&gt; In-vitro-</em&gt; Winterruhe Model of Östrogen-sensitiven Brustkrebs im Knochenmark: Ein Werkzeug für Molecular Mechanism Studien und Hypothesengenerierung

Zusammenfassung

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Zusammenfassung

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Einleitung

Brustkrebszellen zu metastasieren in das Knochenmark vor der Erkrankung nachweisbar ^1, sobald kleine Tumore entwickeln Blutgefße ^2,3. Die metastasierendem Verfahren ist schnell, aber ineffizient. Zellen, geben Sie die neuen Blutgefäße schnell, zu Millionen pro Tag ^4, aber nur wenige überleben die Reise zu entfernten Organen ^5. Dennoch gibt es einige Mikrometastasen zu überleben in den Knochen und kann als einzelne Zellen oder kleine Zellklumpen in Knochenmarkaspirate von neu diagnostizierten Patienten ¹ gefunden werden. Diese Zellen wider adjuvante Chemotherapie, die für den Zweck der Beseitigung von ihnen ⁶ verabreicht wird. Dieser Widerstand wird dotiert, im Wesentlichen durch das Überleben Signalisierung durch Wechselwirkungen mit dem Knochenmark-Mikroumgebung ^7,8 eingeleitet. Mikrometastasen in etwa ein Drittel der Frauen mit lokalem Brustkrebs gefunden werden und stellen ein unabhängiges Indikator für das Überleben, wenn sie von univariaten Analyse ⁹ analysiert. Einige micrometastases sind Wachstum eingeleitet, aber Wiederholungsmuster sind abhängig von Zelltyp. Patienten mit triple negativem Brustkrebs neigen dazu, zwischen 1 bis 4 Jahre wiederkehren, was auf schlechte Kontrolle über die schlafenden Zustand. Andere Zelltypen, einschließlich ER / PR + Zellen können für bis zu 20 Jahre ruhend bleiben, mit einem stetigen, kontinuierlichen Rezidivrate ^10. Während Unterschiede in der Keimruhe Genexpressionssignaturen zwischen ER + und ER- Brustzelllinien und Tumoren spiegeln unterschiedliche Ruhepotentiale ^11, Interaktionen mit Knochenmarkstroma wahrscheinlich einen bedeutenden Beitrag zur Keimruhe.

Das Studium der Keimruhe in vivo ist außerordentlich schwierig, weil Mikrometastasen sind selten und werden zahlenmäßig von blutbildenden Zellen um mehr als 10 ⁶ -fach. Daher müssen entsprechende Modelle erzeugt werden, die in-vitro-Daten, die Mechanismen vorschlagen, und erzeugen überprüfbare Hypothesen in vivo unterbieten sind. Eine Reihe von Ruhe Modelle, darunter matheatika Modelle ^12,13, in-vitro-Modellen ^7,8,14,15, in vivo-Xenotransplantat-Modelle ^16, Kombinationen von in vitro und Xenotransplantatmodellen ^17,18 und spontaner Tumormetastasen und Modelle ^19, haben einen Einblick in Krebszellruhe ²⁰ ergab . Jedes dieser Modelle haben ihre eigenen Grenzen und sind von sich selbst in erster Linie sinnvoll zur Erzeugung von Hypothesen zur molekularen Signal und Interaktionen, die Ruhephase, um in mehr biologisch relevanten Modellen getestet werden regieren.

Mit dem Gesamtziel definiert, die molekularen Mechanismen der Keimruhe, die Wechselwirkungen mit der Mikroumgebung, die in Zyklusarrest, Redifferenzierung und Therapieresistenz und Mechanismen führt, die in Rückfällen bei ER + Zellen führen, ein in vitro-Modell, das ausgewählt relevanten Elemente der bietet entwickelten wir Stroma-Mikroumgebung ^7. Dieses Modell, während in seiner Kompo relativ spärlichenten, ist robust genug, um die Ermittler zu ermöglichen, spezifische molekulare Mechanismen, die signifikante Funktionen der Keimruhe beeinträchtigen abzuleiten. Diese Experimente erzeugen Hypothesen, die direkt in vivo getestet werden können. Das Modell stützt sich auf einige Schlüsselelemente, die wir gezeigt, in Keimruhe relevant. Sie umfassen die Verwendung von Östrogen-abhängigen Brustkrebs-Zellen, der Kultur von Zellen in einem klonogenen Dichte wo ihre Wechselwirkung ist hauptsächlich mit der Erde und die löslichen Bestandteile des Mediums, einer Fibronektin-Substrat und das Vorhandensein von basischem Fibroblastenwachstumsfaktor (FGF-2) im Medium.

Wir gekennzeichnet Mechanismen, die das System in vitro regeln, einschließlich der Induktion von Zellzyklusarrest von FGF-2 ^21, durch TGFß ²² vermittelt wird, das Überleben Signalgebung durch PI3 Kinase ERK ^7,8 und ⁸ und morphogenic Differenzierung zu einer epithelialen Phänotyp, die auf abhing RhoA Inaktivierung Integrin45; 5β1 Hochregulierung und die Ligation von Stromazellen Fibronektin Überleben ^7,15 (Abbildung 1). Die in-vitro-Zellzykluseffekte von FGF-2 auf die MCF-7 Zellen beginnen bei Konzentrationen mindestens einer Protokoll unter 10 ng / ml ^21,23. Die Begründung wurde auf die zeitliche Steuerung von FGF-2-Expression über Brust-duktales Morphogenese, zyklische Expansion und Rezession in einer Reihe von Säugetiersystemen ^24-27 basiert. Wir haben gezeigt, dass FGF-2 induziert die Differenzierung, einschließlich duktalen Morphogenese in 3D-Kultur ^28, und dass FGF-2-Expression in der Regel verlor mit malignen Transformation von menschlichen Tumoren ^29. Die Expression von FGR1 blieb intakt in befragten ²⁹ und MCF-7 Zellen Mammakarzinomen weiterhin alle 4 FGF-Rezeptoren ³⁰ zum Ausdruck bringen. Im Kontext der Dormanz wird FGF-2 durch exportiert und stark auf Knochenmarkstroma ^31,32, wo es bei der Konservierung von Blutstammzellen ³³ fungiert abgeschieden. Wir DMonstrated, dass FGF-2 induziert einen Ruhezustand in ER + Brustkrebszellen zu Fibronektin Substraten, auch im Knochenmark, wo es morphogenic Differenzierung ⁷ induziert reichlich kultiviert. Im Modell Brustkrebszellen sind Wachstum gehemmt wird, inaktivieren Rho A durch die RhoGap GRAF, Redifferenzierung zu einer epithelialen Phänotyp und Re-express Integrine α5β1 lost mit malignen Progression. Sie binden Fibronektin durch Integrin α5β1 und aktiviere das Überleben signalisiert, dass sie resistent gegen zytotoxischen Therapie ^7,8,15 (Abbildung 1) zu machen. Hemmung der Rho-GTPasen Klasse wurde bereits gezeigt, dass eine Ruhe Phänotyp ³⁴ induzieren.

Hier werden wir die spezifischen Verfahren, die Ermittler erlauben wird, um das Modell zu etablieren und zu studieren spezifischen molekularen und zellulären Mechanismen, die Ruhephase der ER + Brustkrebszellen zu skizzieren. In den Experimenten hier dargestellt, um die Verwendung des Modells veranschauGezielte wir den PI3K-Weg (1B) mit einem Akt-Inhibitor und einem PI3K-Inhibitor und alle Mitglieder der Rho-Familie (1B) mit einem pan-Rho-Inhibitor und einem Rho-Kinase (ROCK) Inhibitor.

Protokoll

1. Klonogentest

1. Bereiten Sie eine Einzelzellsuspensionen von Östrogen-abhängigen Brustkrebs-Zelllinien MCF-7 und T47D-Zellen unter Verwendung der unten angegebenen Schritte,
   1. Saugen Sie das Kulturmedium (DMEM / 10% hitzeinaktiviertem fötalem Kälberserum / Glutamin und Pen / Strep) von einer 10 cm Gewebekulturschale, die nicht mehr als 50% konfluent mit MCF-7 oder T-47D-Zellen ist. Spülen mit PBS. Inkubieren mit Trypsin 0,25% / 2,21 mM EDTA in DMEM mit hohem Glucose gelöst bei 37 ° C für 1-4 min.
   2. Prüfzellen in 1-Minuten-Intervallen unter einem Phasenkontrastmikroskop, um eine einzelne Zellverteilung zu gewährleisten. Resuspendieren der Zellen mit einer 2 ml-Pipette durch Auf- und Abpipettieren mehrmals, um Zell-Zell-Kontakt unterbrechen, um eine fast unveränderlich, einzelne Zelle Status zu erreichen.
   3. Weiterhin Zellen bei 37 ° C für 4 min inkubieren in Trypsin, wenn Sie Zellklumpen nach nur 2 min Inkubation zu beobachten. Verwenden Sie diese Zellen für die klonogenen Studien, wenn sie haft e bleibenach andere nach 4 min von Trypsinierung, weil Fehler in der Kolonie Nummer Ertrag eingebracht werden.
      HINWEIS: Wenn Zellen verklumpten, wird die Anzahl der gebildeten Kolonien des Produkts von weniger Zellen als die Anzahl inkubiert reflektieren. Wenn Zellen übermßig trypsiniert, kann ihr klonogenen Potential vermindert.
   4. Vorbereitung einer Einzelzellsuspension von 1.500 Zellen / ml Kulturmedium für 24-Well-Platten oder weniger (+ 500 Zellen / ml, abhängig von dem Zelltyp oder einen Durchgang-Zahl), durch serielle Verdünnungen in einem Master Rohr das gesamte Volumen von Nöten alle Variablen in dem Experiment.
      ANMERKUNG: Das Ziel ist eine endgültige Zelldichte von 800 Zellen / cm ² (im Bereich von ca. 500 bis 1.100 Zellen / cm ^2). Das Ziel ist, auf etwa 100 + 50 Kolonien zu erhalten, die relativ einfach Zählung ermöglicht, verhindert Verdrängung und ermöglicht ausreichend Kolonien in statistisch signifikanten Differenzen im Kolonien werden erhöht oder verringert experimentellen perturbagen.
2. Inkubieren Zellen bei Klonogene Density Mit skizzierten Schritte
   1. Zellen in vierfachen Vertiefungen auf 24-Well-Fibronektin-beschichtete Platten bei einem klonogenen Dichte von 1500 Zellen / Well von einer Master-Einzelzellsuspension Rohr von 1.500 Zellen / ml. Man reibt das Medium, das Zellen mit einer 5 ml Pipette durch Aufziehen 3 ml und Abgabe 1 ml Medium in jeder der 2 Brunnen.
      HINWEIS: Fibronectin-beschichteten Platten sollten gekauft vorbeschichtet werden von einem kommerziellen Anbieter. Lackplatten außerhalb eines Qualitäts gesteuert automatisierten Prozess führt zu einer unebenen Oberfläche ungeeignet für diesen Test.
   2. Mischen Sie die Suspension durch Auf- und Abpipettieren mit einer 5 ml Pipette erarbeiten 3 ml Zellsuspension und füllen 2 Brunnen mit je 1 ml. Füllen Sie nur 2 Brunnen zu einem beliebigen Zeitpunkt von einer Pipette. Schicken Sie das Restvolumen in der Pipette zu der Zellsuspension in der Master-Rohr, Die Zellen wiederum durch Auf- und Abpipettieren und stellt weitere 3 ml, um eine andere 2 wel füllenls mit je 1 ml.
      HINWEIS: Das kontinuierliche Mischen des Masterrohr ist erforderlich, da Zellen kontinuierlich zu sedimentieren. Die Zusammenstellung einer ausreichenden Menge, um nur 2 Brunnen zu füllen ist notwendig, um ähnliche Zellzahlen in jede Vertiefung hinzufügen, weil Zellen sedimentieren in der Pipette als auch.
   3. Arbeiten schnell, um die großen Mengen an Zellen zu verteilen, da ermöglicht den Zellen in Suspension bei Raumtemperatur und der CO _{2 -Konzentration} sitzen ihre klonogenen Potential (unveröffentlichte Beobachtungen) modulieren.
   4. Optimieren Sie die räumliche Verteilung der Zellen während der Akt der Pipettieren sie in Brunnen für Kolonie-Assays. Dies geschieht durch langsam Pipettieren der Suspension, die die endgültige Zellkonzentration in der Mitte der Vertiefung. Die Platte, um die Bewegung weiterer Gegenstand nicht vor Zellen am Boden absetzen. Die Platte wirbeln Sie nicht, weil Kreismisch effektiv die Zellen, um den Umfang der auch die Schaffung hohe Zelldichten und unzählige konfluente Kolonien Zentrifuge bei 6 Tage.
      HINWEIS: wenn es nicht notwendig mischen, da dies überhaupt nach der Einführung die Lautstärke mit den Zellen in Suspension weniger wünschenswert als keine Vermischung. Wenn es notwendig ist, um Zellen zu mischen, dies durch Bewegen der Platte vor und zurück in senkrechten Richtungen, während es auf einer flachen Oberfläche aufliegt.
   5. Zellen bei 37 ° C 5% CO ₂ inkubieren ohne Medienwechsel für 6 Tage. Die geringe Zahl von Zellen in einem Bohrloch nach 6 Tagen nicht signifikant beeinflussen den Nährstoff oder Zytokin Zusammensetzung noch den pH-Wert des Originalmediums.
   6. Entwerfen der zeitliche Verlauf des Assays wie folgt: Zellen, die auf Fibronectin beschichteten Substrate am Tag 1. Inkubieren Ersetzen bestehender Medium mit 1 ml frischem Medium oder frischer Medium enthaltend FGF-2 10 ng / ml am Tag 0 Stain-Zellen am Tag 6 nach unten in 1.4). Durchzuführen keine experimentellen Störungen an Tag 3, wie unten in 1.3).
3. Einrichten Experimental Störungen der molekularen Signal oder Adhäsionsmoleküle
   1. An Tag 3 werden 10056; l einer Lösung, die 10-fach von dem geplanten Konzentration der störenden Mittels zu dem 1 ml Medium in den Vertiefungen. Nicht zu verwechseln. Weiterhin die Zellen bei 37 ° C, 5% CO ₂ für weitere 3 Tage inkubiert.
      HINWEIS: Stören Mittel können eine Vielzahl von Inhibitoren und Blockierungsmittel Adhäsionsmoleküle, Rezeptoren oder andere Oberflächenproteine, Inhibitoren der intrazellulären Signalwegen, Moleküle, Faktoren, Co-Faktoren oder strukturellen Proteinen, die Rollen bei der Unterstützung des Ruhezustand spielen können, umfassen.
   2. Flecken Kolonien am Tag 6, wie folgt.
4. Stain Colonies
   1. Flecken Zellen nach 6 Tagen in Kultur mit einer frisch hergestellten 0,1% Kristallviolett in 2% Ethanol / 10 mM Natriumborat (pH 9,0) Lösung. Saugen Sie Medien und fügen Sie eine ml Kristallviolett-Lösung in jede Vertiefung für 20 Minuten.
   2. Waschplatten, indem sie mit den Öffnungen nach unten und in einem spitzen Winkel in einem Eiskübel überfüllt mit kontinuierlich fließendem LeitungseintauchenWasser in der Spüle. Kippen Sie die Platte an einem horizontalen Winkel einmal unter Wasser, auch die Öffnung nach unten und dann nach hinten neigen, um einen spitzen Winkel beim Entfernen in einem sanften fließenden Bewegung.
   3. Wiederholen der Eint 2 oder 3 mal, bis das Wasser auf dem Boden der Vertiefungen ist nicht mehr blau. Kräftiges Waschen kann Zellen oder Kolonien, die aufgrund der experimentellen Eingriff weniger haft sind, was eine um wesentlich zu dem Fehler in Zählung und der Daten.
   4. Dry Platten über Nacht, indem sie den Kopf auf Handtücher auf der Tischplatte angrenzend an die entsprechenden markierten Abdeckungen.
5. Graf Colonies
   1. Zählen die Anzahl der wachsenden und ruhenden Kolonien in jeder Vertiefung nach 6 Tagen Inkubation Färbung und Trocknen. Graf Kolonien optimal bei 40-facher Vergrößerung in einem umgekehrten Phasenkontrastmikroskop. Zählen Kolonien von> 30 Zellen wachsen und Kolonien von 12 Zellen oder weniger, mit dem morphologischen Erscheinungsbild sehr groß im Vergleich zum Züchten von Zellen, große expaNDED Cytoplasma mit großen Cytoplasma in Verhältnissen, die in 1 gezeigten Kern ^7,15.
      HINWEIS: Cluster von 13 bis 29 Zellen werden in der Regel nicht gezählt, da sie nicht sehr häufig in einfachen Ruhe Assays. Sie können angerechnet werden, wenn Störungen verschieben das Wachstumspotenzial der entweder wachsen oder ruhenden Zellen. Diese Ergebnisse müssen dann mit biologischer Bedeutung korreliert werden.

2. Klonogene Inkubation für Immunfluoreszenz-Studien

1. Einzustellen Zellzahlen ungefähr 7,500-8,000 Zellen / Vertiefung in Platten mit 6 Vertiefungen zu entsprechen Nummern / Oberfläche analog 24 Vertiefungen Experimente Zelle.
2. Platzieren Sie einen runden, sterile, Fibronektin-beschichtete Deckglas in jede Vertiefung Basis des 6-Well-Platten für die bildgebenden Untersuchungen vor der Zelle hinaus. Pipette Zellen in 3 ml Volumina in jede Vertiefung 2 Vertiefungen in einer Zeit in Konzentrationen ausgeführt, wie bei den obigen Experimenten klonogenen in 1.2 beschrieben).
3. Inkubieren Zellenfür 6 Tage, wie oben in 1.2.4 und 1.2.5. Hinzuzufügen Störfaktoren am Tag 3 bei 10-facher Konzentration in 300 ul-Volumina, wie sie in den Kolonie-Assay-Verfahren in 1.3 beschrieben).
4. Stain-Zellen am Tag 6 mit Antikörpern gegen Adhäsionsmoleküle wie Integrine α4, α5, α6, β1, β3 zB focal adhesion komplexe Moleküle FAK, paxillin und Vinculin Zelle, zum Beispiel, Proteine ​​der Motilität beteiligt, wie α-Tubulin B. Signalweg Elemente, wie Phospho-Akt, Phospho-ERK, Phospho-p38, Phospho-JNK, zum Beispiel, oder jedes andere Protein, das das Ziel der Untersuchung für seine Rolle in der Ruhe ist, unter Verwendung von Standard-Techniken zur direkten oder indirekten Immunfluoreszenzfärbung.
   1. Folien mit einer Pinzette entfernen Tag 6. Fix in Aceton / Methanol 1: 1 bei -20 ° C für 20 min und der Luft trocknen. Eine alternative Fixiermittel wie Paraformaldehyd, verwendet werden, falls erforderlich. Permeabilisieren Zellen mit 0,1% Triton X-100, 0,1% Natriumcitrat 2 min foder den Nachweis von intrazellulären Antigenen. Zellen mit PBS waschen.
   2. Für indirekte immunofluorecence Färbung Blockobjektträger 1 Stunde bei Raumtemperatur mit 5% BSA oder mit 10% Serum vor der Immunisierung von der Spezies, in welcher der sekundäre Antikörper erzeugt wurde.
   3. Inkubieren über Nacht bei 4 ° C mit primären Antikörpern gegen Adhäsionsmoleküle Brenn komplexe Moleküle Zelle Signalweg Elemente oder andere Protein, das das Ziel der Untersuchung für seine Rolle in der Ruhe auf spezifische Verdünnungen vom Hersteller empfohlenen Verdünnung in PBS 0,1% Triton X -100.
   4. Mit PBS waschen 3 Mal. Deckgläser mit Fluorophor-konjugierten Antikörpern Inkubieren bei Raumtemperatur für 2 Stunden. Als ein Beispiel kann Alexa Fluor 488 Esel Anti-Maus-IgG-Antikörper verwendet, um Maus monoklonalen primären Antikörper nachzuweisen. Berg Deckgläser Zellseite nach unten auf Glasobjektträger unter Verwendung eines Antifade Mittel mit DAPI. Verschließen Sie die Umfänge mit Nagellack.
   5. Für direkte Immunfluoreszenz, die Durchführung der BSAwie oben in 2.4.2) Blockieren, Inkubation mit Fluorophor-konjugierte primäre Antikörper über Nacht bei 4 ° C. Mit PBS waschen 3 Mal. Inkubieren Sie die Objektträger mit einer Antifade Mittel und Dapi und Dichtung mit Nagellack.
   6. Schutzglasschalen mit Aluminiumfolie und bei 4 ° C für die Bildgebung und Fotografie jederzeit bis zu mehreren Wochen später. Ansehen und Foto-Zellen unter Verwendung beliebiger fluoreszenzmikroskopischen Bildgebungssysteme mit einer Kamera ausgestattet an 1,000x Vergrößerung.
   7. Für fibrilläres Aktinfärbung Block gleitet in 1% Rinderserumalbumin (BSA) für 30 Minuten und Inkubieren in BODIPY FL-Phallacidin (grün) oder Rhodamin-Phalloidin (rot) bei Raumtemperatur für 20 min. Fügen Sie einen Antifade Mittel und Dichtung wie oben.

3. Klonogene Inkubation für Molekulare Studien

1. Western Blots
   1. Inkubieren ER + Brustkrebszellen MCF-7 oder T47D auf klonogenen Dichten von 20.000 Zellen / 60 mm Platte und 50.000 Zellen / 100 mm Platte auf fibronecZinn-beschichteten Platten bei 37 ° C in 5% CO _2.
   2. Inkubieren Zellen bei etwas höheren Dichte von 75.000 Zellen / 100 mm Platte für molekulare Studien erfordern mg Mengen für Protein aus Lysaten. Verwenden Sie bis zu zehn Platten pro Versuchspunkt, um ausreichend Protein für molekulare Studien unter Verwendung von Western-Blots oder für RNA-Isolierung für Northern Blots zu sammeln.
   3. Zellzahl anhand Gelbeladung ist eine notwendige Ergänzung für den Vergleich der Proteinexpression in beträchtlichem Ausmaß unterschiedlich große wachsenden und ruhenden Zellen. Sammle die Zellen durch Trypsinisierung und zählen ein Aliquot in einem Hämozytometer in 0,2% Trypan Blau zur Herstellung von Lysaten für Westernblots statt Abschaben der Zellen mit einer einzigen Kante Klinge.
   4. Centrifuge Zellen bei 10.000 × g für 2 Minuten, entfernen Medien durch Aspiration, fügen Sie 200 ul Lysepuffer, beschallen die Zellen in Lysepuffer und bestimmen die Proteinkonzentration.
   5. Berechnen der Menge an Protein pro Zelle durch Teilen der Proteinausbeute durch die Anzahl der Zellendaß die Menge erzeugt. Laden des Lysates in jede Vertiefung einer separaten Polyacrylamidgelen, die sowohl a) äquivalente Mengen des Proteins, und b) Proteinmengen, die äquivalente Zellzahlen darstellt. Mindestens 25 ug Protein sollte in jede Vertiefung geladen.
      Hinweis: das Vergleichen zwischen wachsenden oder ruhenden Zellen, die in der Größe und der Proteingehalt (Figur 1) sind signifikant verschieden zu ermöglichen.
2. Durchflusszytometrie
   1. Sammeln Zellen von 100-mm-Platten durch Trypsinierung, wie in 3.1 und analysiert durch Standardfluoreszenzaktivierte Zellsortierung (FACS) Protokolle, die primäre oder sekundäre Immunfluoreszenzfärbung für entweder intrazelluläre oder extrazelluläre Antigene, wie in Abschnitt 2.4 beschrieben.
      HINWEIS: Abnehmen Zellen aus Gewebekulturplatten durch Trypsinisierung beeinflußt nicht die Konzentration von Membranproteinen, wie durch Antikörpermarkierung bestimmt.

Ergebnisse

Experimente wurden durchgeführt, um den Test zu wiederholen. Der Zeitverlauf des Experiments ist in 2A gezeigt. Die Zellen werden bei klonogenen Dichte am Tag -1 inkubiert wird FGF-2 in frischem Medium am Tag 0 gegeben und die Zellen werden bis zum Tag 6 kultiviert, wenn sie gefärbt sind, und die Kolonien gezählt. Jegliche Störungen in das System werden am Tag 3 in 100 ul-Volumina bei 10-facher Endkonzentration verabreicht gewünscht. 2B veranschaulicht das typische Erscheinun...

Diskussion

Unser Modell besteht aus mehreren Schlüsselelemente der Vegetationsruhe im Knochenmark besteht. Es besteht aus Östrogen empfindlichen Zellen, die die Art wahrscheinlich ruhend im Mark längere Zeiträume ¹⁰ zu bleiben, sie besteht aus Fibronectin, einem wichtigen Strukturelement der Mark, FGF-2, ein Wachstumsfaktor reichlich durch die Knochenmarkstroma synthetisierten und stark in der extrazellulären Matrix von Knochenmark ^31,32 und Inkubation der Zellen bei klonogenen Dichte wo ihre Wechselwirk...

Materialien

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
T47D cells	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin	Corning	354088
6 Well tissue culture plate	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid	Corning	25-005-CI
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase	Cytoskeleton	CTO3	Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)	Molecular Probes	B607	Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)	Molecular Probes	R415	Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent	Molecular Probes	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P-36931