Un<em&gt; In Vitro</em&gt; Latencia Modelo de cáncer de mama estrógeno-sensibles en la médula ósea: una herramienta de Estudios mecanismo molecular y Hipótesis Generación

Resumen

We developed an in vitro model of dormancy in the bone marrow for estrogen-sensitive breast cancer cells. The goal of this protocol is to demonstrate use of the model for the study of the molecular and cellular biology of dormancy and for generation of hypotheses for subsequent testing in vivo.

Resumen

The study of breast cancer dormancy in the bone marrow is an exceptionally difficult undertaking due to the complexity of the interactions of dormant cells with their microenvironment, their rarity and the overwhelming excess of hematopoietic cells. Towards this end, we developed an in vitro 2D clonogenic model of dormancy of estrogen-sensitive breast cancer cells in the bone marrow. The model consists of a few key elements necessary for dormancy. These include 1) the use of estrogen sensitive breast cancer cells, which are the type likely to remain dormant for extended periods, 2) incubation of cells at clonogenic density, where the structural interaction of each cell is primarily with the substratum, 3) fibronectin, a key structural element of the marrow and 4) FGF-2, a growth factor abundantly synthesized by bone marrow stromal cells and heavily deposited in the extracellular matrix. Cells incubated with FGF-2 form dormant clones after 6 days, which consist of 12 or less cells that have a distinct flat appearance, are significantly larger and more spread out than growing cells and have large cytoplasm to nucleus ratios. In contrast, cells incubated without FGF-2 form primarily growing colonies consisting of >30 relatively small cells. Perturbations of the system with antibodies, inhibitors, peptides or nucleic acids on day 3 after incubation can significantly affect various phenotypic and molecular aspects of the dormant cells at 6 days and can be used to assess the roles of membrane-localized or intracellular molecules, factors or signaling pathways on the dormant state or survival of dormant cells. While recognizing the in vitro nature of the assay, it can function as a highly useful tool to glean significant information about the molecular mechanisms necessary for establishment and survival of dormant cells. This data can be used to generate hypotheses to be tested in vivo models.

Introducción

Células de cáncer de mama metástasis en la médula ósea antes de la enfermedad es detectable ^1, tan pronto como los tumores se desarrollan pequeños vasos sanguíneos ^2,3. El proceso metastásico es rápida pero ineficiente. Las células entran en los vasos sanguíneos nuevos rápidamente, en millones por día ⁴ pero pocos sobreviven el viaje a órganos distantes ^5. Sin embargo, algunos micrometástasis sobrevivir en el hueso y se pueden encontrar como células individuales o grupos de células pequeñas en aspirados de médula ósea de los pacientes recién diagnosticados ^1. Estas células resisten a la quimioterapia adyuvante, que es administrado con el propósito de eliminarlas ^6. Esta resistencia está dotado, sustancialmente, por la supervivencia de señalización iniciada por la interacción con el microambiente de la médula ósea ^7,8. Las micrometástasis se pueden encontrar en aproximadamente un tercio de las mujeres con cáncer de mama localizado y representan un indicador independiente de la supervivencia cuando se analizaron por análisis univariado ^9. Algunos micrometastases son el crecimiento iniciado, pero los patrones de recurrencia dependen del tipo de célula. Los pacientes con cáncer de mama triple negativo tienden a repetirse entre 1 a 4 años, lo que sugiere un mal control sobre el estado de latencia. Otros tipos de células, incluyendo las células ER / PR +, pueden permanecer latentes durante un máximo de 20 años, con un ritmo constante y continua de recurrencia ^10. Mientras que las diferencias en la latencia firmas de expresión génica entre ER + y ER- líneas celulares de mama y tumores reflejan diferentes potenciales de latencia ^11, las interacciones con estroma de la médula ósea probablemente representan una contribución significativa a la latencia.

El estudio de la latencia in vivo es excepcionalmente difícil debido a micrometástasis son raros y son superados en número por las células hematopoyéticas en más de un 10 ⁶ -fold. Por lo tanto, los modelos relevantes se deben generar que proporcionan datos in vitro que puede sugerir mecanismos y generar hipótesis comprobables en vivo. Un número de modelos de latencia, incluyendo mathemodelos matemá- ^12,13, en modelos in vitro, in vivo ^7,8,14,15 modelos de xenoinjerto ^16, combinaciones de in vitro y modelos de xenoinjerto ^17,18 y tumoral y la metástasis modelos espontáneos ^19, han producido una cierta penetración en la latencia de células de cáncer ²⁰ . Cada uno de estos modelos tienen sus propias limitaciones y son en sí mismos principalmente útil para generar hipótesis sobre la señalización molecular y las interacciones que rigen la latencia a ensayar en modelos más biológicamente relevantes.

Con el objetivo general de la definición de los mecanismos moleculares de la inactividad, las interacciones con el microambiente que da lugar a la detención del ciclo, rediferenciación y resistencia terapéutica y mecanismos que dan lugar a la recurrencia en las células ER +, hemos desarrollado un modelo in vitro que proporciona selecciona los elementos pertinentes de la estroma microambiente ^7. Este modelo, si bien es relativamente escasa en su componentes, es suficientemente robusto para permitir a los investigadores a derivar mecanismos moleculares específicos que afectan a las funciones significativas de latencia. Estos experimentos generan hipótesis que se pueden probar directamente in vivo. El modelo se basa en una serie de elementos clave que hemos demostrado ser relevante en la latencia. Estos incluyen el uso de células de cáncer de mama dependientes de estrógenos, cultivo de células a una densidad clonogénico donde su interacción es principalmente con el sustrato y los componentes solubles del medio, un sustrato de fibronectina y la presencia de factor de crecimiento básico de fibroblastos (FGF-2) en el medio.

Hemos caracterizado los mecanismos que gobiernan el sistema in vitro, incluyendo la inducción de la detención del ciclo celular por FGF-2 ^21, mediada a través de TGF ^22, la supervivencia de señalización a través de PI3 quinasa ERK ^7,8 y ⁸ y la diferenciación morfogénica a un fenotipo epitelial, que dependía de RhoA inactivación, la integrina45; 5β1 upregulation y la ligadura de la fibronectina del estroma para la supervivencia ^7,15 (Figura 1). Los efectos del ciclo celular in vitro de FGF-2 en células MCF-7 células comienzan a concentraciones al menos un log por debajo de 10 ng / ml ^21,23. La razón se basa en el control temporal de FGF-2 expresión que rige la morfogénesis ductal mamario, la expansión cíclica y la recesión en un número de sistemas de mamíferos ^24-27. Hemos demostrado que el FGF-2 induce la diferenciación, incluyendo la morfogénesis ductal en la cultura 3D ^28, y que el FGF-2 de expresión se pierden generalmente con la transformación maligna de los tumores humanos ^29. La expresión de FGR1 permaneció intacta en los carcinomas de mama encuestados ²⁹ y MCF-7 células continúan para expresar todos los 4 receptores de FGF ^30. En el contexto de la latencia, FGF-2 se exporta por y fuertemente deposita sobre estroma de médula ósea ^31,32 donde funciona en la preservación de las células madre hematopoyéticas ^33. Nos demonstrated que FGF-2 induce un estado latente en cáncer de mama ER + células cultivadas sobre sustratos de fibronectina, también abundante en la médula ósea, donde se induce la diferenciación morfogénica ^7. En el modelo, las células de cáncer de mama son el crecimiento inhibido, inactivar Rho A través de la RhoGAP GRAF, redifferentiate a un fenotipo epitelial y re-expresa lost integrinas α5β1 con la progresión maligna. Ellos se unen a través de fibronectina α5β1 integrina y activan la supervivencia de señalización que hacerlos resistentes a la terapia citotóxica ^7,8,15 (Figura 1). La inhibición de la Rho GTPasas de clase se ha demostrado previamente para inducir un fenotipo inactivo ^34.

Aquí vamos a esbozar los procedimientos específicos que permitan a los investigadores a establecer el modelo y estudiar los mecanismos moleculares y celulares específicas que regulan la latencia de las células de cáncer de mama ER +. En los experimentos presentados aquí para ilustrar el uso del modelo, Nos centramos en la vía PI3K (Figura 1B) con un inhibidor de Akt y un inhibidor de PI3K y todos los miembros de la familia Rho (Figura 1B) con un inhibidor pan-Rho y un (ROCK) inhibidor de Rho quinasa.

Protocolo

1. Ensayo clonogénico

1. Preparar un solo suspensiones de células de líneas celulares de cáncer de mama estrógeno-dependientes células MCF-7 y T47D utilizando los pasos descritos a continuación
   1. Aspirar el medio de cultivo (DMEM / 10% inactivado por calor suero fetal de ternera / glutamina y penicilina / estreptomicina) a partir de una placa de cultivo de tejido de 10 cm que es no confluente más de 50% con las células T-47D MCF-7 o. Enjuague con PBS. Incubar con tripsina 0,25% / EDTA 2,21 mM disuelto en DMEM de alta glucosa a 37 ° C durante 1-4 min.
   2. Compruebe células a intervalos de 1 min bajo un microscopio de contraste de fase para asegurar una distribución de una sola célula. Resuspender las células con una pipeta 2 ml pipeteando arriba y abajo varias veces para interrumpir el contacto célula-célula para lograr una, el estado de célula única casi invariable.
   3. Continuar incubar células en tripsina a 37 ° C durante un máximo de 4 minutos si observa grupos de células después de sólo 2 minutos de incubación. No utilizar estas células para estudios clonogénicos si permanecen adheridos al correoach otra después de 4 minutos de tripsinización porque el error se introducirá en el rendimiento número de colonias.
      NOTA: Si se agrupan las células, el número de colonias formadas reflejará el producto de menor número de células que el número se incubaron. Si las células se tratan con tripsina en exceso, su potencial clonogénico puede verse disminuida.
   4. Preparar una suspensión de células de 1.500 células / ml de medio de cultivo para placas de 24 pocillos, o menos, (+ 500 células / ml, dependiendo del tipo de célula o número de pases), mediante diluciones en serie en un tubo maestro que contienen todo el volumen necesario para todas las variables en el experimento.
      NOTA: El objetivo es una densidad final de células de 800 células / cm ² (rango de aproximadamente 500 a 1100 células / cm ^2). El objetivo es producir aproximadamente 100 + 50 colonias, que permite relativamente fácil de contar, evita el hacinamiento y permite colonias suficientes para dar lugar a diferencias estadísticas significativas cuando las colonias se aumentan o disminuyen por perturba experimentalciones.
2. Se incuban las células en Clonigénicas densidad utilizando pasos descritos a continuación
   1. Se incuban las células en pocillos por cuadruplicado en 24 placas recubiertas de fibronectina pocillos a una densidad clonogénico de 1500 células / pocillo de un tubo de suspensión de células individuales maestro de 1500 células / ml. Se tritura el medio que contiene células con una pipeta 5 ml mediante la elaboración de 3 ml y dispensación de 1 ml de medio en cada uno de 2 pozos.
      NOTA: recubiertos de fibronectina placas se deben comprar pre-recubierto de un proveedor comercial. Placas de revestimiento fuera de una calidad controlada, los resultados de proceso automatizado en una superficie desigual inadecuado para este ensayo.
   2. Mezclar la suspensión pipeteando arriba y abajo con una pipeta de 5 ml, elaborar 3 ml de suspensión celular y llenar 2 pozos con 1 ml cada una. Llenar sólo 2 pozos en un momento dado de una pipeta. Devuelva el volumen restante en la pipeta a la suspensión de células en el tubo principal, volver a suspender las células de nuevo pipeteando arriba y abajo y elaborar otros 3 ml para llenar otro 2 wells con 1 ml cada uno.
      NOTA: La mezcla continua del tubo principal es necesaria porque las células se sedimentar continuamente. La elaboración de un volumen suficiente para llenar sólo 2 pozos es necesario añadir el número de células similares a cada pocillo porque las células sedimentan en la pipeta también.
   3. Trabajar rápidamente para distribuir los grandes volúmenes de células porque las células permitiendo a los sientan en suspensión a temperatura ambiente y CO ₂ concentración modulará sus clonogénicas potenciales (observaciones no publicadas).
   4. Optimizar la distribución espacial de las células durante el acto de pipeteado ellos en pocillos para ensayos de colonias. Hacerlo pipeteando lentamente la suspensión que contiene la concentración final de células en el medio de la bien. No exponga la placa para promover el movimiento antes de las células depositan en el fondo. No girar el plato porque mezcla circular centrifugar efectivamente las células al perímetro de las así creando altas densidades de células y colonias confluentes incontables a los 6 días.
      NOTA: No mezcle menos que sea necesario ya que esto es menos deseable que ninguna mezcla en absoluto después de la introducción del volumen con las células en suspensión. Si es necesario mezclar las células, hacerlo moviendo la placa hacia atrás y adelante en direcciones perpendiculares mientras descansa sobre una superficie plana.
   5. Se incuban las células a 37 ° C 5% de CO ₂ sin cambio de medio durante 6 días. El pequeño número de células en un pozo después de 6 días no impactará significativamente la composición de nutrientes o de citoquinas ni el pH del medio original.
   6. Diseñar el curso de tiempo del ensayo como sigue: Se incuban las células en la fibronectina recubierto de sustratos en el día 1. Reemplazar medio existente con 1 ml de medio fresco o medio fresco que contiene 10 ng / ml en el día 0. células mancha en día 6 como debajo de 2 FGF- en 1.4). Realizar cualquier perturbaciones experimentales en el día 3, ya continuación en 1.3).
3. Configurar perturbaciones experimentales de Molecular Signaling o moléculas de adhesión
   1. El día 3, añadir 10056; l de una solución que contiene 10 veces más de la concentración deseada final del agente perturbador al medio de 1 ml en los pocillos. No mezclar. Continuar incubar las células a 37 ° C, 5% de CO ₂ durante otros 3 días.
      NOTA: agentes Perturbar puede incluir una variedad de inhibidores y agentes de bloqueo de moléculas de adhesión, receptores u otras proteínas de superficie, inhibidores de las vías de señalización intracelulares, moléculas, factores, cofactores o proteínas estructurales, que pueden jugar un papel en el apoyo al estado latente.
   2. Colonias de la mancha en el día 6, de la siguiente manera.
4. Las colonias de la mancha
   1. Stain células después de 6 días de cultivo con un 0,1% de cristal violeta recién hecho en 2% de etanol / borato de sodio 10 mM (pH 9,0) solución. Medios Aspirar y añadir solución de cristal violeta uno ml a cada pocillo durante 20 min.
   2. Lavar platos sumergiéndolos con las aberturas así mirando hacia abajo en un ángulo agudo en un cubo de hielo que desborda con grifo abierto de forma continuaagua en el fregadero. Incline la placa a un ángulo horizontal una vez bajo el agua, así la apertura hacia abajo, y luego inclinarlo de nuevo a un ángulo agudo al retirar en un movimiento que fluye suave.
   3. Repita la inmersión 2 o 3 veces hasta que el agua en el fondo de los pozos ya no es de color azul. Lavados vigorosos pueden eliminar las células o colonias que son menos adherente debido a la intervención experimental, añadiendo de manera significativa al error en el conteo y los datos.
   4. Placas secas durante la noche colocándolos boca abajo sobre toallas en la mesa de trabajo junto a sus correspondientes tapas marcadas.
5. Cuente Colonias
   1. Contar el número de colonias que crecen y latentes en cada pocillo después de 6 días de incubación, la tinción y el secado. Recuento de las colonias de manera óptima a 40 aumentos en un microscopio de contraste de fase invertida. Contar las colonias de> 30 células como crecer y colonias de 12 o menos células, con la apariencia morfológica de gran tamaño en comparación con el cultivo de células, amplio expacitoplasma nded con gran citoplasma al núcleo proporciones, mostradas en la Figura 1 ^7,15.
      NOTA: Los racimos de 13-29 células normalmente no se cuentan como no son muy frecuentes en los ensayos de inactividad sencillas. Ellos se pueden contar si las perturbaciones desplazan el potencial de crecimiento de cualquiera de las células en crecimiento o latentes. Estos resultados entonces necesitará estar correlacionado con importancia biológica.

2. Clonigénicas Incubación de Estudios de inmunofluorescencia

1. Ajustar el número de células a aproximadamente 7,500-8,000 células / pocillo en placas de 6 pocillos, para corresponder a la celda / números de área de superficie análoga a 24 experimentos bien.
2. Coloque una ronda,, cubierta de resbalón fibronectina recubierto estéril en cada base pocillo de placas de 6 pocillos para los estudios de imagen antes de la adición de células. Células de pipeta en 3 ml volúmenes en cada pocillo 2 pozos en un momento en concentraciones describen, como se describe para los experimentos clonogénicas más arriba en 1.2).
3. Se incuban las célulasdurante 6 días, como anteriormente en 1.2.4 y 1.2.5. Añadir factores perturbadores en días 3 a 10x concentraciones en 300 volúmenes mu l, como se describe en los procedimientos de ensayo colonia en 1.3).
4. Células mancha en día 6 con anticuerpos para moléculas de adhesión celular tales como integrinas α4, α5, α6, β1, β3, por ejemplo, de adhesión focal moléculas complejas FAK, paxillin y vinculina, por ejemplo, proteínas implicadas en la motilidad tales como α-tubulina, por ejemplo, los miembros de la vía de señalización tales como fosfo-Akt, fosfo-ERK, fosfo-p38, fosfo-JNK, por ejemplo, o cualquier otra proteína que es el objetivo de la investigación por su papel en la latencia, utilizando técnicas estándar para directo o indirecto la tinción de inmunofluorescencia.
   1. Eliminar diapositivas con fórceps día 6. Fijar en acetona / metanol 1: 1 a -20 ° C durante 20 min y secar al aire. Un fijador alternativo, tal como paraformaldehído, se puede utilizar, si es necesario. Permeabilizar las células con 0,1% Triton X-100, 0,1% de citrato de sodio para 2 min fo la detección de antígenos intracelulares. Lavar las células con PBS.
   2. Para la tinción immunofluorecence indirecto, las diapositivas de bloque para 1 hr a temperatura ambiente con 5% de BSA o con 10% de suero preinmune de la especie en la que se generó el anticuerpo secundario.
   3. Incubar durante la noche a 4 ° C con anticuerpos primarios a la célula moléculas de adhesión, moléculas complejas focales, señalización de los miembros de la vía o cualquier otra proteína que es el objetivo de la investigación por su papel en la latencia diluido a diluciones específicas recomendadas por el fabricante en PBS 0,1% de Triton X -100.
   4. Lavar 3 veces con PBS. Incubar cubreobjetos con anticuerpos-fluoróforo conjugado a temperatura ambiente durante 2 hr. Como un ejemplo, Alexa Fluor 488 burro anti-IgG de ratón de anticuerpos puede ser utilizado para detectar anticuerpos primarios monoclonales murinos. Monte cubreobjetos células hacia abajo sobre portaobjetos de vidrio utilizando un agente antifade con DAPI. Selle los perímetros con esmalte de uñas.
   5. Por inmunofluorescencia directa, llevar a cabo la BSAbloqueo como anteriormente en 2.4.2), incubar con el anticuerpo primario-fluoróforo conjugado durante la noche a 4 ° C. Lavar 3 veces con PBS. Incubar los portaobjetos con un agente antifade y Dapi y sello con el esmalte de uñas.
   6. Bandejas deslizantes cubierta con papel de aluminio y se almacena a 4 ° C para formación de imágenes y la fotografía en cualquier momento hasta varias semanas más tarde. Ver y fotografiar las células utilizando cualquier sistema de formación de imágenes microscópicas de fluorescencia equipado con una cámara en 1.000 x magnificación.
   7. Para la tinción de actina fibrilar, diapositivas de bloque en 1% de albúmina de suero bovino (BSA) durante 30 min y se incuban en BODIPY FL-Phallacidin (verde) o rodamina faloidina (rojo) a temperatura ambiente durante 20 min. Añadir un agente antifade y sellar el anterior.

3. Clonigénicas Incubación de Estudios Moleculares

1. Transferencias Western
   1. Incubar cáncer de mama ER + células MCF-7 o T47D a densidades clonogénicos de 20.000 células / 60 mm plato y 50.000 células / placa de 100 mm en fibroneclata-revestido placas a 37 ° C en 5% de CO _2.
   2. Se incuban las células a densidades ligeramente más altos de 75.000 células / placa de 100 mm para los estudios moleculares que requieren cantidades mg de proteína de lisados. Utilice un máximo de diez planchas por punto experimental para recoger suficientes proteínas para los estudios moleculares utilizando transferencias Western o para el aislamiento de ARN para transferencias Northern.
   3. El número de células de carga de gel con base es un complemento necesario para la comparación de la expresión de proteínas de muy diferentes tamaños células de cultivo y latentes. Recoger las células por tripsinización y contar una parte alícuota en un hemocitómetro en 0,2% de azul de tripano para la preparación de lisados ​​para transferencias de Western en lugar de raspado de las células con una sola pala de borde.
   4. Centrifugar las células a 10.000 xg durante 2 min, eliminar los medios por aspiración, añadir 200 l de tampón de lisis, sonicar las células en tampón de lisis y determinar la concentración de proteína.
   5. Calcular la cantidad de proteína por célula dividiendo el rendimiento de proteína por el número de célulasque genera esa cantidad. Cargar el lisado en cada pocillo de geles de poliacrilamida separadas que representa tanto una) cantidades equivalentes de proteína y b) las cantidades de proteínas que representan el número de células equivalentes. Al menos 25 g de proteína debe ser cargado en cada pocillo.
      NOTA: Esto permitirá comparaciones entre crecimiento y latentes células, que son significativamente diferentes en tamaño y contenido de proteína (Figura 1).
2. Citometría De Flujo
   1. Recoger las células de placas de 100 mm por tripsinización, como en 3.1 y analizar por células activadas por fluorescencia estándar (FACS) utilizando protocolos de tinción de inmunofluorescencia primaria o secundaria, ya sea para antígenos intracelulares o extracelulares, como se indica en 2.4.
      NOTA: Separación de células a partir de placas de cultivo de tejidos por tripsinización no afecta a la concentración de proteínas de membrana como se determina mediante el etiquetado de anticuerpos.

Resultados

Se realizaron experimentos para recapitular el ensayo. El curso de tiempo del experimento se muestra en la Figura 2A. Las células se incubaron a densidad clonogénico en el día -1, se añade FGF-2 en medio fresco en días 0 y las células se cultivan hasta el día 6 cuando se tiñen y se cuentan las colonias. Cualquier perturbaciones en el sistema se administran en el día 3 en 100 volúmenes mu l a 10x concentraciones finales deseadas. La Figura 2B muestra la apariencia típica...

Discusión

Nuestro modelo se compone de varios elementos clave de la latencia en la médula ósea. Se compone de células sensibles a estrógenos, que son el tipo propensos a permanecer en estado latente en la médula ósea durante períodos prolongados ^10, se compone de fibronectina, un elemento estructural clave de la médula ósea, FGF-2, un factor de crecimiento abundantemente sintetizado por el estroma de la médula ósea y fuertemente depositado en la matriz extracelular de la médula ósea ^31,32 y la i...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
MCF-7 cells	ATCC	HTB-22
T47D cells	ATCC	HTB-123
BD BioCoat Fibronectin 24 Well Clear Flat Bottom TC-Treated Multiwell Plate	Corning	354411
BD BioCoat Fibronectin 60 mm Culture Dishes	Corning	354403
BD BioCoat Fibronectin 100 mm Culture Dishes	Corning	354451
BD BioCoat 22x22mm #1 Glass Coverslip with a uniform application of human fibronectin	Corning	354088
6 Well tissue culture plate	CellTreat	229106
Dulbecco Modified Eagle Medium High Glucose 10X Powder	Corning Life Sciences	50-013-PB
Heat Inactivated, Fetal Bovine Serum	Serum Source International	FB02-500HI
0.25% Trypsin/2.21 mM EDTA	Corning	25-053-CI
Penicillin-Streptomycin Solution, 100X	Corning	30-002-CI
L-Glutamine, 100x, Liquid	Corning	25-005-CI
Recombinant Human FGF basic	R&D Systems	234-FSE-025
Akt Inhibitor (1L6-Hydroxymethyl-chiro-inositol-2-(R)-2-O-methyl-3-O-octadecyl-sn-glycerocarbonate)	CalBiochem	124005
LY294002	CalBiochem	19-142	Chenical PI3K inhibitor
C3 transferase	Cytoskeleton	CTO3	Inhibits RhoA, RhoB, and RhoC, but not related GTPases such as Cdc42 or Rac1
Y-27632 dihydrochloride	Santa Cruz Biotechnology	129830-28-2
BODIPY FL-Phallacidin (green)	Molecular Probes	B607	Fluorochrome for fibrillar actin staining
BODIPY FL-Rhodamine phalloidin (red)	Molecular Probes	R415	Fluorochrome for fibrillar actin staining
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Mouse IgG Antibody, ReadyProbes Reagent	Molecular Probes	R37114
ProLong Gold Antifade Mountant with DAPI	Molecular Probes	P-36931