على الفحص لقياس آثار الإيثانول على سرعة تحرك من<em&gt; انواع معينة ايليجانس</em

Summary

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Abstract

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C. elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C. elegans.

Introduction

Alcohol use disorders (AUD) are widespread and produce serious health, social, and economic problems. In humans, the susceptibility to developing an AUD is heavily influenced by both genetics and the environment^1,2. A strong physiological predictor of abuse liability is the initial level of response (LR) to alcohol (ethanol) that is exhibited by naïve drinkers^3-5. This LR phenotype is influenced by genetics and non-genetic components⁶. Determining the molecular mechanisms that influence the LR to ethanol is an important goal of the study of ethanol response behaviors.

The nematode, Caenorhabditis elegans, has been increasingly used as a model for studying the effects of ethanol on behavior^7-9. There is strong molecular conservation in the machinery of nervous system function between worms and mammals, and several genes that have been shown to influence the LR to ethanol in worms have been shown to influence LR to ethanol in mammals^10-16, and have been implicated in abuse liability in humans^17-19.

Ethanol intoxicates worms, which is reflected in a decrease in their locomotion speed. Several different laboratories have developed behavioral assays that differ in several ways, for example, the locomotion behavior that they study (crawling versus swimming^{11,12,14,20,21}) or in the composition of the solutions in which the assays are performed (nematode growth medium versus Dent’s saline^20,22). Interestingly, these diverse assays have yielded somewhat different dose response profiles for the effects of ethanol. These results have pointed to important differences in the underlying behaviors of crawling and swimming^9,23, as well as a role for the environmental variable osmolarity in ethanol responses²⁰, and have highlighted the importance of describing experimental detail of the various assays.

An assay to measure the acute effects of ethanol on crawling behavior is presented here. This assay has been used extensively to study the genetic and environmental influences on the LR to ethanol^{8,10,20,24,25}. The mammalian LR phenotype is a composite of at least two components, initial sensitivity to ethanol and acute functional tolerance to ethanol^26,27. In worms, the LR phenotype has been shown to be separable into these two components through the use of this behavioral assay. The influences of genetic and environmental manipulations on both phenotypes can be examined using this single assay. Importantly, these two phenotypes are genetically separable.

Protocol

1. خطوات لتنفيذ يوم قبل الفحص

1. اختيار L4 مرحلة الديدان إلى الطازجة المتوسطة النمو الخيطية (NGM) لوحات مع المصنف حشيش OP50 E. القولونية، والثقافة لهم في 20 CO / N. كل شرط الفحص يتطلب 10 الديدان. اختيار وجود فائض من الديدان للسماح O / N فقدان الديدان.
   1. الحيوانات الفحص فقط التي هي البالغين اليوم الأول؛ العديد من المسوخ تنمو بسرعة أبطأ من النوع البري. ضبط توقيت التقاط لسلالات التي لديها تأخر في النمو حتى يتسنى لجميع الحيوانات المختبرة هم من البالغين اليوم الأول.

2. خطوات إلى تنفيذ يوم من الفحص

1. التحضير للفحص:
   1. أداء المقايسات على القياسية غير المصنف 60 × 15 ملم لوحات NGM. تجف كل من لوحات لاستخدامها في 37 مئوية لمدة 2 ساعة، مع أغطية قبالة. لكل محاكمة التجريبية، استخدم أربع لوحات NGM المجففة. هذه ستكون ملي و 400 ملي 0 لوحات الإيثانول فحص والمرافق لوحات التأقلم الخاصة بهم.
      ملاحظة:استخدام لوحات NGM مهم هنا. الاختلافات في تكوين لوحات، وبخاصة الأسمولية، ويمكن أن تؤثر بقوة على الاستجابة للجرعة من الايثانول على السلوك، وهذا هو الواجب، جزئيا على الأقل، إلى تغيرات في كمية الإيثانول التي تراكمت لدى الحيوانات ^20. NGM أجار 160 الميلي أسمول.
   2. بعد التجفيف، وتزن كل واحدة من لوحات NGM غير المصنف لاستخدامها في مقايسة ولاحظ الوزن. تحديد حجم وسائل الإعلام في لوحات على أساس الوزن من لوحة فارغة. لتقريب تحويل الوزن من أجار للحجم، افترض أن وسائل الإعلام يزن نفس حجم مساو من الماء.
      ملاحظة: تم العثور على نتائجنا أكثر اتساقا مع وسائل الإعلام NGM التي المجففة بما فيه الكفاية أن حجم الأصلي 10 مل لديه حجم ما بعد التجفيف بين 8،3-8،9 مل. بديلا للفي الوقت الجافة 2 ساعة هو لتجف حتى تصل لوحات هذا النطاق حجم لحساب الفروق في حاضنات.
   3. تذوب 4 حلقات النحاس (القطر الداخلي من 1.6 سم) في سطح كل من لوحات ليكون بمثابة حظائر للتراكيب وراثية مختلفة أو مجموعات العلاج من worms.Grasp كل حلقة مع ملقط، والحرارة في لهب (لهب قوي من موقد بنسن يعمل بشكل جيد) لحوالي 3 ثانية. وضع على الفور الطوق على طبق من ذهب وهو لا يزال يشغل الحلبة مع ملقط لمنعه من "تخطي".
      1. تأكد من أن عصابة تقع شقة ضد سطح أجار عن طريق الضغط برفق مع ملقط في عدة نقاط على الحلبة. عند وضع الحلبة، وتوخي الحذر من ترك مساحة لثلاث حلقات إضافية.
      2. إذابة النحاس حلقات إضافية ثلاثة إلى السطح من لوحة، مع الحرص على وضعها باعتبارها قريبة من بعضها البعض ممكن حتى يتسنى لجميع أربعة سوف تكون في مجال الرؤية من الكاميرا.
         ملاحظة: جعل ختم جيدة مع آغار ضروري للحفاظ على الديدان في الحلقات خلال الفحص. من غير المرجح أن جعل ختم الصحيح مع أجار الحلقات التي تخطي حول على لوحة وقد ندبة آغار، والذي يسمح لتحفر الديدان وتتعارض مع الرؤية والديدان.
      3. لكل لوحة الفحص إعداد المرفقة لوحة "التأقلم"، والتي ينبغي أن تجفف وغير المصنف ولن تحصل على أي الإيثانول. وضع أربع حلقات من النحاس على هذه اللوحات.
   4. تسمية الجزء السفلي من لوحات بجوار كل حلقة مع سلالة دودة لاستخدامها في الحلقة، مع الحرص على عدم الكتابة في مجال الرؤية من الحلبة نفسها. تطابق العلامات على لوحة فحص مع المرافقين لوحة التأقلم لها.
   5. حساب كمية الإيثانول بنسبة 100٪ لتضيف إلى كل لوحة الفحص بحيث التركيز النهائي هو 0 ملم أو 400 ملم الإيثانول (الوزن للحجم). لكل تجربة (ن = 1)، سوف يكون هناك واحد 0 ملي واحد 400 ملي لوحة الإيثانول. لوحات التأقلم لا يحصلون الايثانول. إضافة الإيثانول، pipetting لفي جميع أنحاء سطح اللوحة. استخدام فيلم مختبر لختم لوحة والسماح لها لكي تتوازن على أعلى مقاعد البدلاء لمدة 2 ساعة.
   6. عندما انقضت 1.5 ساعة، تبدأ الخطوة التأقلم للمقايسة، خطوة 2.2.
2. أداء تنقل الفحص: لوحات الفحص
   1. نقل بعناية 10 الديدان من كل مجموعة التجريبية لمركز خاتم من النحاس على لوحة التأقلم. إزالة أي طعام غير مرئية على أجار في هذه المرحلة عن طريق كشط بلطف مع اختيار دودة. تختلف الترتيب الذي يتم وضع المجموعات التجريبية على لوحات عبر التجارب التجريبية بحيث لا يتم وضع نفس الضغوط على لوحات في نفس الترتيب عبر المحاكمات.
      ملاحظة: إن الهدف هو نقل الحيوانات إلى لوحة مع كميات ضئيلة من الطعام، لأنه إذا كان يتم نقل الطعام على لوحة التأقلم على لوحة فحص والديدان تجميع حول الغذاء وتأثير المخدرات على تنقل سيتم حجبه.
   2. يجب الحرص على عدم كسر سطح أجار مع اختيار، وهذا سوف يسمح الديدان إلى الجحر وسوف تعطيل الفحص. احتضان الديدان في RT لمدة 30 دقيقة.
   3. ضمان وجود فاصل زمني مناسب بين المبدئية من كل لوحة. مجرب ذوي الخبرة يمكن ان تتحرك الحيوانات 40، 10 / حلقة لمدة 4 حلقات في <1.5 دقيقة، ولكن أي فترة تصل إلى 2 دقيقة غير مقبول. الفحص القياسية ديه الأفلام تسجيل في 10-12 دقيقة و30-32 دقيقة من التعرض لكلا 0 ملي و 400 ملي الايثانول.
   4. بدء لوحة التأقلم لالتعرض 0 مم والتأقلم لوحة لتعرض 400 ملي حوالي 2 دقيقة و 30 ثانية بعيدا للسماح لانقاذ من ملف الفيلم الأول قبل يجب أن يبدأ الفيلم الثاني.
   5. بعد فترة التأقلم 30 دقيقة، ونقل الديدان من لوحات التأقلم لوحات الفحص. نقل الديدان لوحات الفحص (0 ملم أو 400 ملم الإيثانول) في نفس الترتيب الذي تمت إضافتها إلى لوحة التأقلم، تتبع توقيت بين الاكمال من كل لوحة. ختم لوحة مع فيلم مختبر لتقليل الخسائر في الإيثانول لتبخير.
   6. Uحد ذاتها حركة شفط مع اختيار دودة بالارض فوز رقيقة لجمع الديدان على رأس المعول بالارض. أداء نقل الديدان من لوحة التأقلم غير المصنف على لوحة الفحص دون استخدام البكتيريا، والذي يستخدم عادة في نقل الديدان لأنها تساعد على الغراء الدودة لبيك.
      ملاحظة: السرعة التي يتم نقل الحيوانات في هذه الخطوة مهمة جدا لأنه سيتم يتعرض الأولى الديدان على لوحة لالإيثانول أطول من الديدان مشاركة تضاف الى لوحة، ويمكن أن تظهر نقطة زمنية سابقة بعض الآثار التي تعتمد على الوقت. هذا هو السبب الرئيسي لالدورية التي توضع سلالات على طبق من ذهب لأول مرة عبر مكررات التجريبية.
3. أداء تنقل الفحص: التصوير
   1. استخدام مزيج المجهر / الكاميرا التي تسمح للتصوير المتزامن لجميع الحلقات الأربع في مجال الرؤية (حوالي 42x42 مم ² مربع)، مثل الهدف المجهر 0.5X، 0.8x التكبير وكاميرا مع 2048x2048 7.481؛ م بكسل CCD.
   2. استخدام الإضاءة حتى عبر مجال الرؤية، والذي يساعد في التعرف على الكائن في الخطوة عتبة شدة (انظر أدناه). A 3 "X3" الخلفية يعمل بشكل جيد.
   3. صورة الديدان على طبق من ذهب وضعه من جانب وسائل الإعلام حتى (غطاء أسفل)، والذي يولد المقابل أن يتم فقدان عند استخدام الإضاءة الخلفية مقارنة مع المجهر التقليدية التي تنتقل عن طريق مصدر الضوء.
   4. تحضير صورة برامج التحليل لالتقاط الأفلام الوقت الفاصل بين الديدان تتحرك. تعيين البرنامج لالتقاط 12 بت الصور الرمادية النطاق كل 1 ثانية، كفيلم 2-مين (120 الإطار). للحد من حجم ملف الإخراج، في حين لا يزال الإبقاء على دقة وضوح الصورة كافيا، استخدم وضع binning 2X2 إلى التقاط الصور 1024x1024 بكسل.
   5. تسجيل الأفلام. بدء تسجيل فيلم 120 إطار لوحة الأولى (0 ملي الإيثانول) وضعت 10 دقيقة بعد الديدان الأخيرة على أن اللوحة. حفظ ملف الفيلم.
   6. تسجيل لوحة الثانية (400 ملي الإيثانول). كرر هذه العملية لوضعت كل من لوحات ابتداء 30 دقيقة بعد الديدان الأخيرة على لوحة الأولى (0 ملي الإيثانول) لالتقاط 30-32 نقطة زمنية دقيقة لكل التعرض.
      ملاحظة: السماح الوقت الكافي لحفظ ملفات الصور بعد كل دورة التقاط قبل البدء في تسجيل لوحة القادمة ليتم تحليلها.
   7. من أجل مستقبل التدقيق من الأفلام المحفوظة وللسماح لهذه الأفلام ليتم فتحه وتحليلها من قبل برامج أخرى المجال العام البرمجيات المفتوحة المصدر والتصوير، مثل يماغيج ^28، وتحويل نسخة من كل فيلم إلى 256 ملفات TIFF مقياس الرمادية 8 بت.
      ملاحظة: البرنامج تحليل الصور الموصوفة هنا يستخدم تنسيق ملف الملكية.
4. تحليل الأفلام باستخدام برنامج ImagePro.
   1. مرة واحدة القبض، وتحليل الأفلام باستخدام صورة-برو بلس البرامج أو ما يعادلها.
      ملاحظة: مجموعة متنوعة من البرامج الأخرى تتبع الكائن يتوفر التي تم استخدامها لتعقب متعددة C. بنجاح ايليجانس في وقت واحد ²⁹ و مثلالبرنامج يمكن أن تكون بديلا معقول لذلك توصف هنا تستند الخطوات تحديد الكائن على مبادئ مماثلة. الطريقة الموصوفة يتصل-صورة برو بلس إصدارات البرامج 6،0-6،3 و 7.0 إصدارات أحدث من صورة برو بلس البرامج قد يكون الاختلافات الطفيفة.
   2. تحليل الأفلام في 2 دقيقة (120 الإطار) قطاعات. أولا، تطبيق عامل تصفية الصور لشد الخلفية وتعزيز النقيض من الكائنات دودة. حدد مرشح على النحو التالي: القائمة> عملية> مرشحات> تعزيز> تسطيح: المعلمات: الخلفية = الظلام. ميزة العرض = 20 بيكسل.
   3. إعادة حفظ الأفلام بعد خطوة الترشيح ولكن الاحتفاظ دائما الفيلم الأصلي في شكله فلتر.
      1. تحليل تنقل الحيوانات في كل حلقة على حدة مع منطقة دائرية ذات الاهتمام (ROI) التي يتم وضعها والحجم لتتداخل مع خاتم من النحاس. تحديد وتتبع الديدان مع القائمة> قياس> المسار كائنات ... القيادة؛ هذا إحضار تتبع Dآتا نافذة الجدول. الزر خيارات تتبع يسمح مسارات محددة لاستبعاد وتحد من أي التحف التجريبية.
   4. ضمن علامة التبويب تتبع السيارات، استخدم المعلمات التالية: المسار المعلمات: الحد السرعة (دائرة نصف قطرها البحث) = 400 ميكرون / الإطار، الحد تسريع = السيارات، الحد الأدنى للمجموع طول المسار = 400 ميكرون، سائدة نوع الحركة = الفوضى. الكائنات في المسارات المعلمات: السماح مسارات جزئية = نعم، مين طول = 21 الإطارات، وتتبع عمق التنبؤ = 1 الإطار.
   5. لبدء عملية تتبع، انقر فوق البحث عن جميع المسارات تلقائيا زر وظيفة لإظهار مربع الحوار عدد / خيارات الحجم ومربع الحوار تتبع. حدد الخيار يدوي لاختيار المدى كثافة في مربع الحوار عدد / الحجم، والذي يوفر خطوة عتبة مهمة يستخدم كثافة مقياس الرمادية للبكسل دودة لتسليط الضوء على وجوه دودة للتحليل وتجاهل أخف بكسل الخلفية.
      1. ضبط سلي عتبة كثافةDERS (واحد لضبط الحد الأعلى، واحدة لتعيين الحد الأدنى) لإنشاء مجموعة شاملة تسلط الضوء على كافة الكائنات المظلمة. وهناك مجموعة من 0-1،500 على مقياس من 0-4،095 هو نقطة انطلاق جيدة لضبط الدقيقة.
      2. تطبيق عامل تصفية حجم استبعاد الأشياء التي هي أكبر وأصغر من كائن دودة واحد، مثل خاتم من النحاس وأي حطام على لوحات. تعيين معلمتين حجم للقيام بذلك التي تغطي الأحجام للديدان الفردية في مجموعة متنوعة من المواقف مع قياس> تحديد قياسات عنصر القائمة في مربع الحوار خيارات الكونت / الحجم. (المدى المساحة: 28،000-120،000 ميكرون ² ومجموعة محيط: 600-2،500 ميكرون).
      3. إذا سلالة متحولة هو أصغر بكثير أو أكبر من غيرها من الحيوانات على لوحة ليتم تحليلها، وتوسيع نطاق إعدادات التصفية للاعتراف الكائن لاستيعاب أحجام مختلفة من سلالات أولا قبل تتبع الحيوانات بحيث الإعدادات لا تحتاج إلى تغيير منتصف التحليل.
   6. إتمام عملية تتبع عن طريق النقر متابعة في مربع الحوار تتبع. مقارنة بصريا المسارات الإخراج مع التقدم المحرز في كل دودة في الفيلم لضمان أن كل دودة ويمثل ما لم يكن هناك سبب وجيه لاستبعاده بناء على إعدادات التصفية التلقائية. حذف المسارات التي تم إنتاجها من خلال وجود أكدت الأجسام غير الدودة التي التقى معايير التصفية حجم يدويا.
   7. استخدام البرنامج لحساب سرعة كل دودة بين كل إطار (المسافة المقطوعة للالنقطه الوسطى من كائن في 1 ثانية بين الإطارات) وعرض متوسط ​​السرعة لكل مسار ومتوسط ​​السرعة في جميع المسارات للسكان من الديدان في خاتم من النحاس. النظر في هذا المعدل النهائي ليكون ن = 1 من حيث التجارب التجريبية. تصدير البيانات إلى برنامج جدول بيانات للالتحليلات الإحصائية وحفظ البيانات.
   8. مرة واحدة وقد تم تسجيل البيانات للحلقة الأولى على لوحة، ونقل ROI إلى الحلبة القادمة وتكرار عملية تتبع، من دون تغيير أي من المعلمات.
   9. حساب السرعة النسبية للتنقل من خلال:
   10. السرعة النسبية (٪) = المعالجة (400 ملم) سرعة / غير المعالجة (0 مم) سرعة × 100.
       ملاحظة: التلاعب الجيني مختلفة غالبا ما يغير معدل تنقل القاعدية من الحيوانات. من أجل تحديد تأثير الايثانول على سرعة تنقل الحيوانات وأن تكون قادرة على مقارنة هذه الآثار عبر المورثات أو ظروف مختلفة، وحساب السرعة النسبية.

النتائج

وتعرض بيانات تمثيلية (الشكل 1) من عدة تراكيب وراثية مختلفة، وضوابطها يقترن ^8،24. تم اختيار البيانات على وجه التحديد أن الاختلافات تسليط الضوء في الحيوانات يعاير. وتعتبر درجة من التأثير في 10 دقيقة من التعرض لحساسية الأولية للسلالة، والذي يظهر على المحاور...

Discussion

في بيولوجيا الأعصاب بسيطة والأدوات الوراثية متاحة في C. ايليجانس جعل دودة نموذجا ممتازا للدراسة الأسس الجزيئية لتأثير الايثانول على السلوك. هنا، نحن تصف مقايسة التي استخدمت لتحديد عدة وسطاء الجزيئية والبيئية للاستجابة سلوكية حادة لالإيثانول ^{8،10،20،24،25.} ه?...

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3g/L), agar (17g/L), peptone (2.5g/L), 1 mL cholesterol (5mg/mL in ethanol), 1 mL (1M) MgSO4, 1 mL (1M) CaCl2, 25 mL (1M) KPO4, pH=6, 975 mL H2O
Forceps	Various		e.g. Fisher Scientific #10300
37°C Incubator	Various		For drying agar
Digital balance	Various		For determining plate weights and agar volume
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.