Assay למדידת ההשפעות של אתנול במהירות התנועה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Summary

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Abstract

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C. elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C. elegans.

Introduction

Alcohol use disorders (AUD) are widespread and produce serious health, social, and economic problems. In humans, the susceptibility to developing an AUD is heavily influenced by both genetics and the environment^1,2. A strong physiological predictor of abuse liability is the initial level of response (LR) to alcohol (ethanol) that is exhibited by naïve drinkers^3-5. This LR phenotype is influenced by genetics and non-genetic components⁶. Determining the molecular mechanisms that influence the LR to ethanol is an important goal of the study of ethanol response behaviors.

The nematode, Caenorhabditis elegans, has been increasingly used as a model for studying the effects of ethanol on behavior^7-9. There is strong molecular conservation in the machinery of nervous system function between worms and mammals, and several genes that have been shown to influence the LR to ethanol in worms have been shown to influence LR to ethanol in mammals^10-16, and have been implicated in abuse liability in humans^17-19.

Ethanol intoxicates worms, which is reflected in a decrease in their locomotion speed. Several different laboratories have developed behavioral assays that differ in several ways, for example, the locomotion behavior that they study (crawling versus swimming^{11,12,14,20,21}) or in the composition of the solutions in which the assays are performed (nematode growth medium versus Dent’s saline^20,22). Interestingly, these diverse assays have yielded somewhat different dose response profiles for the effects of ethanol. These results have pointed to important differences in the underlying behaviors of crawling and swimming^9,23, as well as a role for the environmental variable osmolarity in ethanol responses²⁰, and have highlighted the importance of describing experimental detail of the various assays.

An assay to measure the acute effects of ethanol on crawling behavior is presented here. This assay has been used extensively to study the genetic and environmental influences on the LR to ethanol^{8,10,20,24,25}. The mammalian LR phenotype is a composite of at least two components, initial sensitivity to ethanol and acute functional tolerance to ethanol^26,27. In worms, the LR phenotype has been shown to be separable into these two components through the use of this behavioral assay. The influences of genetic and environmental manipulations on both phenotypes can be examined using this single assay. Importantly, these two phenotypes are genetically separable.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Protocol

1. צעדים לביצוע ביום לפני Assay

1. בחרו תולעי שלב L4 למדיום גידול נמטודות טרי צלחות (NGM) זורעים עם דשא של OP50 E. coli, ותרבותם בשיתוף 20 / N. כל מצב assay דורש 10 תולעים; לאסוף עודף של תולעים, כדי לאפשר O / הפסד N של תולעים.
   1. בעלי חיים רק assay כי הם מבוגרים ראשון-יום; מוטציות רבות לגדול במהירות איטית יותר מאשר סוג בר. התאם את עיתוי קטיף לזנים שיש לי עיכובים התפתחותיים, כך שכל בעלי החיים שנבדקו הם מבוגרים ראשון-יום.

2. צעדים לביצוע ביום Assay

1. הכנה לassay:
   1. לבצע מבחני על צלחות unseeded סטנדרטיים 60 x 15 מ"מ NGM. ייבש את כל הצלחות לשימוש ב 37 צלזיוס למשך 2 שעות, עם מכסים מ. לכל ניסוי ניסוי, להשתמש בארבע צלחות NGM מיובשות; אלה יהיו 0 מ"מ ו -400 מ"מ צלחות assay אתנול וצלחות ההסתגלות אשר נלוו אליהם.
      הערה:השימוש בצלחות NGM הוא חשובה כאן; הבדלים בהרכב של הצלחות, בosmolarity בפרט, יכולים מאוד להשפיע על תגובת המינון של אתנול על התנהגות, וזאת בשל, לפחות בחלקו, לשינויים בכמות של אתנול שנצברה על ידי בעלי החיים ^20. אגר NGM הוא 160 mOsm.
   2. לאחר ייבוש, שוקל כל אחת מצלחות NGM unseeded לשימוש בassay ושם לב במשקל. לקבוע את עוצמת הקול של מדיה בצלחות המבוססות על המשקל של צלחת ריקה. כקירוב להמרת משקל של אגר להיקף, מניח שהתקשורת שוקלת כמו נפח שווה של מים.
      הערה: התוצאות עקביות ביותר שלנו כבר נמצאה עם תקשורת NGM שייבש מספיק שיש לו מקורי 10 מיליליטר נפח פוסט-ייבוש בין 8.3-8.9 מיליליטר נפח. אלטרנטיבה לזמן היבש 2 hr היא להתייבש עד הצלחות להגיע לטווח כרך זה כדי להסביר את הבדלים בחממות.
   3. להמס 4 טבעות נחושת (קוטר פנימי של 1.6 סנטימטרים) לתוך השטח של כל אחת מהצלחות לפעול כמכלאות לגנוטיפים או קבוצות טיפול של worms.Grasp כל טבעת עם מלקחיים, וחום השונים בלהבה (להבה חזקה ממבער בונזן עובדת היטב) למשך כ 3 שניות. מייד למקם את הטבעת על צלחת ועדיין מחזיק את הטבעת עם המלקחיים כדי למנוע ממנה 'דילוג'.
      1. ודא שהטבעת נשענת שטוחה נגד פני השטח של אגר על ידי לחיצה בעדינות עם המלקחיים במספר נקודות על הטבעת. בעת ביצוע הטבעת, להיות זהיר כדי להשאיר מקום לשלוש טבעות נוספות.
      2. ממסים שלוש טבעות נחושת נוספות לתוך השטח של הצלחת, דואג למקם אותם כקרוב זה לזה ככל האפשר, כך שכל ארבעת יהיו בשדה הראייה של המצלמה.
         הערה: ביצוע חותם טוב עם אגר הוא חיוני כדי לשמור על התולעים בטבעות במהלך assay. טבעות שלדלג סביב על הצלחת צפויים להפוך את החותם הנכון עם אגר וייתכן ויהיה הצלקת אגר, המאפשר תולעים להתחפר ומפריע לדמיין את התולעים.
      3. לכל צלחת assay להכין צלחת נלווית "הסתגלות", שאמור להיות יבשה וunseeded ויקבל שום אתנול. הנח ארבע טבעות נחושת על צלחות אלה.
   4. תווית התחתונה של הצלחות ליד כל טבעת עם מתח התולעת לשימוש בטבעת, נזהרת שלא לכתוב בשדה הראייה של הטבעת עצמה. התאם את התוויות על צלחת assay עם צלחת ההסתגלות הנלווית אליה.
   5. לחשב את הסכום של 100% אתנול להוסיף לכל צלחת assay כך שהריכוז הסופי הוא 0 מ"מ או 400 מ"מ אתנול (משקל לנפח). עבור כל ניסוי (n = 1), יהיה אחד 0 מ"מ וצלחת אתנול מ"מ אחד 400; צלחות הסתגלות אינן מקבלות אתנול. הוסף את אתנול, pipetting אותו סביב פני השטח של הצלחת. השתמש בסרט מעבדה כדי לאטום את הצלחת ולאפשר לו לאזן על גבי הספסל עבור שעה 2.
   6. כאשר 1.5 שעות חלפו, מתחיל שלב ההסתגלות של assay, שלב 2.2.
2. בצע assay תנועה: צלחות Assay
   1. זהירות להעביר 10 תולעים של כל קבוצת ניסוי למרכז טבעת נחושת על צלחת ההסתגלות. הסר את כל מזון המופיע על אגר בשלב זה על ידי גירוד עדין עם בחירת התולעת. להשתנות את הסדר שבו שמו את קבוצות ניסוי על הצלחות על פני ניסויים ניסיוניים, כך שאותו הזנים לא לשים על הצלחות באותו סדר על פני ניסויים.
      הערה: המטרה היא להעביר את בעלי החיים לצלחת עם כמויות מזעריות של מזון, כי אם אוכל על צלחת ההסתגלות מועבר לצלחת assay התולעים לצבור סביב האוכל ואת ההשפעה של התרופה על תנועה יהיה מוסתרת.
   2. היזהר שלא לשבור את פני השטח של אגר עם הבחירה, כפי שזה יאפשר התולעים להתחפר וישבש את assay. דגירה התולעים ב RT למשך 30 דקות.
   3. ודא שיש מרווח מתאים בין החניכות של כל צלחת. הנסיין מנוסה יכול להעביר 40 בעלי חיים, 10 / טבעת במשך 4 טבעות ב< 1.5 דקות, אבל כל מרווח של עד 2 דקות מקובל. יש assay הסטנדרטי סרטי הקלטה ב 10-12 דקות ו30-32 דקות של חשיפה לשני מ"מ 0 ו -400 מ"מ אתנול.
   4. ליזום את צלחת ההסתגלות לחשיפת 0 מ"מ וצלחת ההסתגלות לחשיפה של 400 מ"מ כ 2 דקות ו- 30 שניות לגזרים כדי לאפשר חיסכון של קובץ הסרט הראשון לפני חייב להתחיל את הסרט השני.
   5. לאחר תקופת ההסתגלות של 30 דקות, להעביר את התולעים מצלחות ההסתגלות לצלחות assay. העבר את התולעים לצלחות assay (0 מ"מ או 400 מ"מ אתנול) באותו סדר שבו נוספו לצלחת ההסתגלות, שמירה על המסלול של התזמון בין הגמר של כל צלחת. חותם את הצלחת עם סרט מעבדה כדי להקטין את איבוד של אתנול לאידוי.
   6. Use תנועה גורף עם בחירת תולעת שטוחה עם קצוות דקות כדי לאסוף תולעים על גבי הטנדר השטוח. לבצע את ההעברה של תולעים מצלחת הסתגלות unseeded לצלחת assay ללא השימוש בחיידקים, המשמש בדרך כלל בהעברת תולעים כמו זה עוזר להדביק את התולעת לבחירה.
      הערה: המהירות שבה בעלי החיים מועברים בשלב זה היא חשובה מאוד, כי התולעים הראשונים על הצלחת יהיו חשופים לאתנול יותר מהתולעים האחרונים שנוספו לצלחת, ונקודות זמן קודמות עשויות להראות כמה תופעות תלויות זמן. זו הסיבה העיקרית למסתובב אשר זנים מונחים על צלחת ראשונה על פני משכפל ניסיוני.
3. בצע תנועת Assay: צילומים
   1. השתמש בשילוב מיקרוסקופ / מצלמה המאפשר הדמיה בו זמנית של כל ארבע הטבעות בשדה הראייה (כ ² מ"מ המרובע 42x42), כגון מטרת מיקרוסקופ 0.5x, הגדלת 0.8x ומצלמה עם 2048x2048 7.481; CCD פיקסל מ '.
   2. השתמש אפילו תאורה על פני שדה הראייה, אשר מסייע בזיהוי אובייקט בשלב סף עוצמה (ראה להלן). תאורה אחורית "x3" 3 עובדת היטב.
   3. תמונת התולעים בתקשורת בצד את צלחת מיקום (מכסה למטה), אשר מייצר ניגוד כי הוא איבד בעת השימוש בתאורה האחורית לעומת מיקרוסקופ מסורתי מועבר מקור אור.
   4. הכן את תוכנת ניתוח תמונה כדי ללכוד זמן לשגות סרטים של התולעים נעו. הגדר את התוכנה לצילום תמונות בגוונים אפורים 12-bit כל 1 שניות, כסרט 2-דקות (120 מסגרת). כדי להקטין את הגודל של קובץ הפלט, תוך שמירה על רזולוציית תמונה מספיק, להשתמש במצב binning 2x2 כדי ללכוד תמונות 1024x1024 פיקסלים.
   5. רשום את הסרטים. להתחיל בהקלטת סרט 120-מסגרת של הצלחת הראשונה (0 אתנול מ"מ) 10 דקות לאחר התולעים שעבר הונחו על צלחת ש. שמור את קובץ הסרט.
   6. רשום את הצלחת השנייה (400 אתנול מ"מ). חזור על תהליך זה עבורשני הצלחות מתחילות 30 דקות לאחר התולעים שעבר הונחו על הצלחת הראשונה (0 אתנול מ"מ) כדי ללכוד את נקודות הזמן דק '30-32 לכל חשיפה.
      הערה: אפשר מספיק זמן כדי לשמור את קבצי תמונה לאחר כל פגישת לכידה לפני תחילת הקלטה של ​​הצלחת הבאה כדי להיות מנותחות.
   7. לעתיד-הגהה של סרטי ארכיון ולאפשר את הסרטים האלה שייפתחו ונותחו על ידי תוכנת הדמיה תוכניות אחרות ברשות הציבור בקוד פתוח, כגון ²⁸ ImageJ, להמיר עותק של כל סרט עד 8 ​​סיביות 256 קבצי TIFF בקנה מידה אפורה.
      הערה: תוכנת ניתוח תמונה המתוארת כאן משתמשת בפורמט קובץ קניינית.
4. ניתוח של סרטים באמצעות תוכנת ImagePro.
   1. ברגע שנתפס, לנתח את הסרטים באמצעות תמונה-Pro Plus תוכנה או שווה ערך.
      הערה: מגוון רחב של תוכנות מעקב אובייקט אחרות זמינה שנעשה שימוש כדי לעקוב אחר הצלחה מרובה C. elegans בפעם אחת ²⁹ וכאלהתוכנה יכולה להחליף באופן סביר לזה שתואר כאן כצעדי זיהוי אובייקטים מבוססים על עקרונות דומים. השיטה המתוארת מתייחסת לגרסאות תמונה-Pro Plus תוכנת 6.0-6.3 ו 7.0, גרסאות חדשות יותר של תמונה-Pro Plus תוכנה עשוי להיות הבדלים קלים.
   2. לנתח סרטים ב2-דקות (120 מסגרת) מגזרים. ראשית, להחיל מסנן לתמונות כדי לשטח את הרקע ולשפר את הניגודיות של אובייקטי התולעת. בחר את המסנן באופן הבא: תפריט> תהליך> מסננים> שיפור> לרדד: פרמטרים: רקע = Dark; כוללים רוחב = 20 Pix.
   3. Re-להציל את הסרטים לאחר שלב הסינון אבל תמיד לשמור את הסרט המקורי בצורה לא המסוננת שלה.
      1. לנתח את התנועה של בעלי חיים בכל טבעת בנפרד עם אזור מעגלי של העניין (ROI) הממוקם בגודל וחפיפה עם טבעת הנחושת. לזהות ולעקוב אחר התולעים עם התפריט> מדוד> לעקוב אחר אובייקטים ... הפקודה; זה מעלה את המעקב Dחלון טבלת אתא. לחצן אפשרויות המעקב מאפשר מסלולים ספציפיים שנכללו ולהגביל כל חפצים ניסיוניים.
   4. תחת הלשונית האוטומטית המעקב, השתמש בפרמטרים הבאים: פרמטרי מסלול: מגבלת מהירות (רדיוס חיפוש) = 400 מיקרומטר / מסגרת, גבול ההאצה = Auto, הכולל אורך מסלול מינימאלי = 400 מיקרומטר, סוג תנועה שולט = כאוטי; אובייקטים בפרמטרי מסלולים: אפשר מסלולים חלקיים = כן, אורך Min = 21 מסגרות, מעקב עומק חיזוי = 1 מסגרת.
   5. כדי להתחיל בתהליך המעקב, לחץ על הציגו את כל המסלולים באופן אוטומטי לתפקד כפתור כדי להעלות את ספירה / תיבת הדו-שיח אפשרויות גודל ותיבת הדו-שיח המעקב. בחר באפשרות ידנית לבחירת טווח עצימות בתיבת הדו-שיח רוזן / גודל, אשר מספקת את צעד הסף החשוב שמשתמש בעוצמה האפורה בקנה המידה של פיקסלים התולעת כדי להדגיש אובייקט תולעת לניתוח ולהתעלם פיקסלים רקע הבהירים יותר.
      1. התאם את SLI סף העצמהders (אחד כדי לקבוע את הגבול העליון, אחד כדי לקבוע את הגבול התחתון) כדי ליצור מגוון כולל שמדגיש אובייקטים כל חושך. מגוון של 0-1,500 בסולם של 0-4,095 הוא נקודת התחלה טובה לכוונון עדין יותר.
      2. החל מסנן גודל שלא לכלול אובייקטים שגודלם וקטנים יותר מאשר אובייקט תולעת אחת, כגון טבעת הנחושת ופסולת כלשהי על הצלחות. להגדיר שני פרמטרים גודל לעשות את זה כי לכסות גדלים לתולעים בודדים במגוון תנוחות עם מדוד> פריט תפריט מדידות בחרו בתיבת הדו-שיח אפשרויות רוזן / גודל. (פינת טווח: 28,000-120,000 מיקרומטר ² ומגוון היקפי: 600-2,500 מיקרומטר).
      3. אם מתח מוטציה הוא קטן יותר באופן משמעותי או גדול יותר מבעלי חיים אחרים על הצלחת להיות מנותח, להרחיב את מגוון הגדרות המסנן לזיהוי אובייקט כדי להתאים את הגדלים השונים של הזנים הראשונים לפני מעקב אחר בעלי חיים, כך שהגדרות לא צריכים להיות שונה אמצע ניתוח.
   6. השלם את תהליך המעקב על ידי לחיצה על המשך בתיבת הדו-שיח המעקב. מבחינה ויזואלית להשוות מסלולי פלט עם ההתקדמות של כל תולעת בסרט על מנת להבטיח שכל תולעת מיוצגת, אלא אם יש סיבה טובה שלא לכלול אותו מבוסס על הגדרות מסנן אוטומטיות. מחקו באופן ידני מסלולים שהופקו על ידי הנוכחות של אובייקטים שאינם תולעת אישרו כי עמדו בקריטריוני מסנן הגודל.
   7. להשתמש בתוכנה כדי לחשב את המהירות של כל תולעת בין כל מסגרת (המרחק נסע לcentroid של אובייקט ל1 שניות בין מסגרות) ולהציג את המהירות ממוצעת לכל מסלול ומהירות הממוצעת על פני כל המסלולים לאוכלוסייה של תולעים טבעת נחושת. שקול ממוצע סופי זה להיות n = 1 במונחים של ניסויים ניסיוניים. לייצא את הנתונים לתכנית גיליון אלקטרוני עבור ניתוחים סטטיסטיים ונתונים בארכיון.
   8. ברגע שהנתונים כבר נרשמו לטבעת הראשונה על הצלחת, להעביר את ההחזר על ההשקעה לטבעת הבאה וחזור על תהליך המעקב, מבלי לשנות כל אחד מהפרמטרים.
   9. לחשב את המהירות היחסית של תנועה באמצעות:
   10. מהירות היחסית (%) = טופל (400 מ"מ) מהירות / מטופל (0 מ"מ) מהירות x 100.
       הערה: מניפולציות גנטיות שונות לעתים קרובות לשנות את שיעור התנועה הבסיסי של בעלי חיים. על מנת לקבוע את ההשפעה של אתנול על מהירות התנועה של בעלי חיים ולהיות מסוגל להשוות את ההשפעות הללו על פני גנוטיפים או תנאים שונים, לחשב את מהירות היחסית.

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

תוצאות

נציגי נתונים (איור 1) מכמה גנוטיפים שונים ובקרות לזווגם מוצגים ^8,24; הנתונים שנבחרו במיוחד שהבדלי גולת הכותרת בבעלי החיים assayed. מידת ההשפעה על 10 דקות של חשיפה נחשבת הרגישות הראשונית של מתח, אשר מוצג על הצירים שנותרו באיור 1 ב-G. זנים מוטנטים עם מהיר...

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Discussion

נוירוביולוגיה הפשוטה וכלים גנטיים זמינה ב C. elegans לעשות תולעת מודל מצוין שבו ללמוד את הבסיסים המולקולריים של ההשפעות של אתנול על התנהגות. כאן אנו מתארים assay שנעשה שימוש כדי לזהות כמה מתווכים מולקולריים וסביבתיים של התגובה התנהגותית החריפה כדי אתנול ^{8,10,20,24,25.}

Access restricted. Please log in or start a trial to view this content.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Digital balance	Various		For determining plate weights and agar volume
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.