Un test pour mesurer les effets de l&#39;éthanol sur la vitesse de Locomotion<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Résumé

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Résumé

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C. elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C. elegans.

Introduction

Alcohol use disorders (AUD) are widespread and produce serious health, social, and economic problems. In humans, the susceptibility to developing an AUD is heavily influenced by both genetics and the environment^1,2. A strong physiological predictor of abuse liability is the initial level of response (LR) to alcohol (ethanol) that is exhibited by naïve drinkers^3-5. This LR phenotype is influenced by genetics and non-genetic components⁶. Determining the molecular mechanisms that influence the LR to ethanol is an important goal of the study of ethanol response behaviors.

The nematode, Caenorhabditis elegans, has been increasingly used as a model for studying the effects of ethanol on behavior^7-9. There is strong molecular conservation in the machinery of nervous system function between worms and mammals, and several genes that have been shown to influence the LR to ethanol in worms have been shown to influence LR to ethanol in mammals^10-16, and have been implicated in abuse liability in humans^17-19.

Ethanol intoxicates worms, which is reflected in a decrease in their locomotion speed. Several different laboratories have developed behavioral assays that differ in several ways, for example, the locomotion behavior that they study (crawling versus swimming^{11,12,14,20,21}) or in the composition of the solutions in which the assays are performed (nematode growth medium versus Dent’s saline^20,22). Interestingly, these diverse assays have yielded somewhat different dose response profiles for the effects of ethanol. These results have pointed to important differences in the underlying behaviors of crawling and swimming^9,23, as well as a role for the environmental variable osmolarity in ethanol responses²⁰, and have highlighted the importance of describing experimental detail of the various assays.

An assay to measure the acute effects of ethanol on crawling behavior is presented here. This assay has been used extensively to study the genetic and environmental influences on the LR to ethanol^{8,10,20,24,25}. The mammalian LR phenotype is a composite of at least two components, initial sensitivity to ethanol and acute functional tolerance to ethanol^26,27. In worms, the LR phenotype has been shown to be separable into these two components through the use of this behavioral assay. The influences of genetic and environmental manipulations on both phenotypes can be examined using this single assay. Importantly, these two phenotypes are genetically separable.

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Protocole

1. Etapes à effectuer le jour avant la Assay

1. Choisissez les vers de la scène à L4 milieu de croissance des nématodes frais (NGM) plaques ensemencées avec une pelouse de OP50 E. coli, et de la culture eux à 20 CO / N. Chaque condition d'essai nécessite 10 vers; chercher un excès de vers pour permettre O / N perte de vers.
   1. Seuls les animaux dosage qui sont adultes premier jour; de nombreux mutants se développent à une vitesse plus lente que le type sauvage. Réglez le moment de la cueillette pour les souches qui ont des retards de développement, afin que tous les animaux testés sont adultes de la première jour.

2. Etapes à effectuer sur le jour de l'essai

1. Préparation pour le test:
   1. Effectuer des essais sur 60 x 15 mm plaques NGM non ensemencés standard. Sécher toutes les plaques à utiliser à 37 ° C pendant 2 heures, avec des couvercles de congé. Pour chaque essai expérimental, utilisez quatre plaques NGM séchées; ce seront les 0 et 400 mm plaques de dosage de l'éthanol et leurs plaques d'acclimatation d'accompagnement.
      NOTE:L'utilisation de plaques NGM est important ici; différences dans la composition des plaques, en particulier leur osmolarité, peuvent affecter fortement la réponse à la dose d'éthanol sur le comportement, ce est due, au moins en partie, à des changements dans la quantité d'éthanol accumulé par les animaux ^20. Agar NGM est de 160 mOsm.
   2. Après séchage, peser chacune des plaques NGM non ensemencés pour être utilisé dans l'essai et noter le poids. Déterminer le volume de milieu dans des plaques par rapport au poids d'une plaque vide. Pour estimer le poids de conversion de la gélose au volume, supposons que le support pèse le même qu'un volume égal d'eau.
      NOTE: Nos résultats les plus constants ont été trouvés avec les médias NGM qui a suffisamment déshydratés qu'un 10 volume d'origine ml a un volume post-séchage entre 8.3 à 8.9 ml. Une alternative au temps de séchage de 2 heures est de sécher jusqu'à ce que les plaques atteignent cette gamme de volume pour tenir compte des différences dans les incubateurs.
   3. Faire fondre 4 anneaux de cuivre (diamètre interne de 1.6 cm) dans la surface de chacune des plaques d'agir comme enclos pour les différents génotypes ou groupes de worms.Grasp chaque bague avec une pince, et le traitement thermique à flamme (une forte flamme d'un brûleur Bunsen fonctionne bien) pour environ 3 sec. Placer immédiatement l'anneau sur une plaque tout en maintenant la bague avec la pince pour l'empêcher de «sauter».
      1. Assurez-vous que l'anneau repose à plat sur la surface de la gélose en appuyant doucement avec la pince à plusieurs points sur l'anneau. Lorsque vous placez l'anneau, veillez à laisser de la place pour trois anneaux supplémentaires.
      2. Faire fondre les trois anneaux de cuivre supplémentaires dans la surface de la plaque, en prenant soin de les placer aussi près que possible de sorte que tous les quatre seront dans le champ de vision de la caméra.
         NOTE: Faire une bonne étanchéité à l'agar est essentiel de garder les vers dans les anneaux pendant l'essai. Anneaux qui sautent autour sur la plaque sont peu susceptibles de faire l'étanchéité correcte avec l'agar etpeut cicatriser la gélose, qui permet aux vers de creuser et interfère avec la visualisation des vers.
      3. Pour chaque plaque dosage préparer une plaque d'accompagnement "d'acclimatation", qui devrait être séché et non ensemencées et recevra pas d'éthanol. Placez quatre anneaux de cuivre sur ces plaques.
   4. Etiqueter le fond des assiettes à côté de l'anneau avec la souche du ver à être utilisé dans le ring, en prenant soin de ne pas écrire dans le champ de vision de l'anneau lui-même. Faites correspondre les étiquettes sur la plaque d'essai avec sa plaque d'acclimatation accompagnant.
   5. Calculer la quantité de 100% d'éthanol pour ajouter à chaque plaque de dosage de sorte que la concentration finale est de 0 mM ou 400 mM d'éthanol (poids par volume). Pour chaque expérience (n = 1), il y aura une 0 mM et une plaque 400 mM d'éthanol; plaques d'acclimatation ne reçoivent pas l'éthanol. Ajouter l'éthanol, le pipetage autour de la surface de la plaque. Utilisez le film de laboratoire pour sceller la plaque et laisser se stabiliser sur la paillasse pendant 2 heures.
   6. Lorsque 1,5 heure se est écoulée, commencer à l'étape d'acclimatation de l'essai, l'étape 2.2.
2. Effectuer test de locomotion: plaques d'essai
   1. Soigneusement transférer 10 vers de chaque groupe expérimental au centre d'un anneau de cuivre sur la plaque d'acclimatation. Enlevez tous les aliments qui est visible sur la gélose à ce point en grattant doucement avec le choix du ver. Variez l'ordre dans lequel les groupes expérimentaux sont mis sur les plaques à travers des essais expérimentaux de sorte que les mêmes souches ne sont pas mis sur les plaques dans le même ordre entre les essais.
      NOTE: L'objectif est de transférer les animaux à la plaque avec des quantités minimales de nourriture, parce que si la nourriture sur la plaque d'acclimatation est transférée à la plaque de dosage, les vers vont se agréger autour de la nourriture et de l'effet du médicament sur la locomotion sera obscurci.
   2. Veillez à ne pas briser la surface de la gélose à la reprise, car cela va permettre aux vers de creuser et de perturber le test. Incuber les vers à température ambiante pendant 30 min.
   3. Assurez-vous que il ya un intervalle approprié entre les initiations de chaque plaque. Un expérimentateur expérimenté peut déplacer 40 animaux, 10 / ring pour quatre anneaux dans <1,5 min, mais ne importe quel intervalle jusqu'à 2 min est acceptable. Le test standard a l'enregistrement de films à 10-12 min et 30-32 min d'exposition à la fois pour 0 mM et de l'éthanol 400 mM.
   4. Initier la plaque d'acclimatation pour l'exposition 0 mM et la plaque d'acclimatation pour l'exposition de 400 mm environ 2 min et 30 sec en dehors pour permettre économie du premier fichier de film avant le deuxième film doit commencer.
   5. Après la période d'acclimatation de 30 minutes, les transférer vers des plaques d'acclimatation aux plaques de dosage. Transférer les vers aux plaques d'essai (0 mm ou 400 mm) éthanol dans le même ordre qu'ils ont été ajoutés à la plaque d'acclimatation, garder la trace de la synchronisation entre les finitions de chaque plaque. Sceller la plaque avec un film de laboratoire pour minimiser la perte d'éthanol à la vaporisation.
   6. USE mouvement d'écopage avec un ver choix mince tranchant aplati pour recueillir vers le haut de la reprise aplatie. Effectuer le transfert de vers de la plaque d'acclimatation non ensemencée à la plaque de dosage, sans l'utilisation de bactéries, qui est couramment utilisé dans le transfert vers car il contribue à coller au ver de la reprise.
      NOTE: La vitesse à laquelle les animaux sont transférés à cette étape est très important parce que les premiers vers sur la plaque seront exposés à l'éthanol plus que les derniers vers ajoutés à la plaque, et des points de temps antérieurs peut montrer certains effets dépendant du temps. Ce est la principale raison pour faire tourner les souches sont placés sur une première plaque travers répétitions expérimentales.
3. Effectuer Locomotion Assay: Tournage
   1. Utiliser une combinaison microscope / de caméra qui permet de imagerie simultanée de tous les quatre anneaux dans le champ de vision (environ 42x42 mm ² carré), tel qu'un objectif de microscope 0,5x, 0,8x grossissement et une caméra avec un 2048x2048 7,481; m pixel CCD.
   2. Utilisez un éclairage uniforme à travers le champ de vision, ce qui facilite la reconnaissance d'objets à l'étape de seuil d'intensité (voir ci-dessous). A 3 "x3" rétro-éclairage fonctionne bien.
   3. Image les vers sur une plaque positionnée médias vers le haut (couvercle vers le bas), ce qui génère contraste qui est perdue lorsque le rétroéclairage par rapport au microscope traditionnelle transmise source de lumière.
   4. Préparer le logiciel d'analyse d'image pour capturer des films en accéléré des vers mobiles. Réglez le logiciel pour capturer des images 12 bits de gris toutes les 1 sec, comme un 2-min (120 images) film. Pour réduire la taille du fichier de sortie, tout en conservant une résolution d'image suffisante, utiliser un mode de regroupement de 2x2 pour capturer des images de 1024x1024 pixels.
   5. Enregistrer les films. Commencer l'enregistrement d'un film de 120 châssis de la première plaque (0 d'éthanol mM) 10 min après la dernière des vers ont été placés sur cette plaque. Enregistrez le fichier de film.
   6. Enregistrez la deuxième plaque (éthanol 400 mM). Répétez ce processus pourles deux plaques commençant 30 min après la dernière vers ont été placés sur la première plaque (0 mM d'éthanol) pour capturer les points de temps de 30 à 32 min pour chaque exposition.
      NOTE: Prévoyez suffisamment de temps pour enregistrer les fichiers image après chaque session de capture avant de commencer l'enregistrement de la plaque suivante à analyser.
   7. Pour l'avenir épreuvage des films archivés et pour permettre à ces films d'être ouverts et analysés par d'autres logiciels d'imagerie open source dans le domaine public, tels que ImageJ ^28, convertir une copie de chaque film à 8 bits 256 fichiers TIFF d'échelle de gris.
      REMARQUE: Le logiciel d'analyse d'image décrit ici utilise un format de fichier propriétaire.
4. Analyse des films en utilisant le logiciel ImagePro.
   1. Une fois capturé, analyser les films en utilisant plus le logiciel Image-Pro ou son équivalent.
      REMARQUE: Une variété d'autres logiciels de suivi d'objet est disponible qui a été utilisé pour suivre avec succès multiples C. elegans à un moment ²⁹ et telslogiciel pourrait raisonnablement se substituer à celle décrite ici comme les étapes d'identification de l'objet sont fondées sur des principes similaires. La méthode décrite se rapporte aux versions Image-Pro Plus logiciels de 6,0 à 6,3 et 7,0, de nouvelles versions de Image-Pro Plus logiciels peut avoir des différences mineures.
   2. Analyser les films dans les segments 2 min (120 images). En premier lieu, appliquer un filtre aux images pour aplatir le fond et à améliorer le contraste des objets à vis sans fin. Sélectionnez le filtre comme suit: Menu> Processus> Filtres> Amélioration> Aplatir: Paramètres: background = dark; Feature Largeur = 20 Pix.
   3. Re-enregistrer les films après l'étape de filtrage mais toujours garder le film original dans sa forme non filtré.
      1. Analyser le locomotion des animaux dans chaque cycle séparément avec une zone circulaire d'intérêt (ROI) qui est placé et dimensionné pour recouvrir l'anneau de cuivre. Identifier et suivre les vers avec le menu> Mesure> suivre les objets ... commande; cela soulève Tracking Dfenêtre de la table de ata. Le bouton Options de suivi permet pistes spécifiques à exclure et de limiter les artefacts expérimentaux.
   4. Sous l'onglet Suivi automatique, utiliser les paramètres suivants: Paramètres Piste: limite de vitesse (recherche de rayon) = 400 um / cadre, Accélération limite = Auto, la longueur minimale d'une plage totale = 400 um, le type de mouvement prédominante = chaotique; Objets dans les paramètres de pistes: Permettre aux pistes partielles = yes, longueur min = 21 cadres, suivi profondeur de prédiction = 1 cadre.
   5. Pour lancer le processus de suivi, cliquez sur le Trouver toutes les pistes automatiquement touche fonction pour faire apparaître le / boîte de dialogue Options de taille de comte et la boîte de dialogue de suivi. Sélectionnez l'option Manuel pour la sélection de gamme d'intensité dans la boîte de dialogue comte / Taille, qui fournit l'étape de seuil importante qui utilise l'intensité d'échelle de gris, le ver pixels de mettre en évidence un objet de ver pour analyse et d'ignorer les légers fond pixels.
      1. Réglez le seuil d'intensité sliDER (une pour définir la limite supérieure, une pour définir la limite inférieure) pour créer une gamme inclusive qui met en évidence tous les objets sombres. Une gamme de 0-1,500 sur une échelle de 0-4,095 est un bon point de départ pour le réglage plus fin.
      2. Appliquer un filtre de taille pour exclure les objets qui sont plus grandes et plus petit qu'un objet ver unique, comme l'anneau de cuivre et tous les débris sur les plaques. Placer les deux paramètres de taille pour ce faire que couvrent tailles pour chaque ver dans une variété de postures avec la mesure> sélectionner les mesures élément de menu sur la boîte de dialogue des options comte / Taille. (Gamme Area: 28,000-120,000 um ² et la gamme Périmètre: 600-2,500 um).
      3. Si une souche mutante est nettement plus petit ou plus grand que les autres animaux sur la plaque pour être analysé, élargir la gamme des paramètres de filtre pour la reconnaissance d'objet pour accueillir les différentes tailles des souches avant de suivre les animaux afin que les paramètres ne ont pas besoin d'être changé mi-analyse.
   6. Achever le processus de suivi en cliquant sur Continuer dans la boîte de dialogue de suivi. Comparer visuellement les pistes de sortie avec les progrès de chaque ver dans le film afin de se assurer que chaque ver est représenté moins qu'il y ait une raison valable pour exclure sur la base des réglages automatiques de filtrage. Supprimez manuellement les pistes qui ont été produites par la présence d'objets non-ver confirmés qui répondaient aux critères de filtrage de taille.
   7. Utilisez le logiciel pour calculer la vitesse de chaque ver entre chaque cadre (distance parcourue pour le centre de gravité d'un objet par une sec entre les cadres) et afficher la vitesse moyenne pour chaque piste et la vitesse moyenne sur toutes les pistes pour la population de vers dans le anneau de cuivre. Considérez cette moyenne finale soit n = 1 en termes d'essais expérimentaux. Exporter les données vers un tableur pour les analyses statistiques et l'archivage des données.
   8. Une fois que les données ont été enregistrées pour le premier anneau sur la plaque, déplacer le ROI à l'anneau suivant etrépéter le processus de suivi, sans modifier les paramètres.
   9. Calculer la vitesse relative de la locomotion à travers:
   10. La vitesse relative (%) = traité (400 mM) de vitesse / non traitée (0 mm) Vitesse x 100.
       REMARQUE: les manipulations génétiques différentes modifient souvent le taux de la locomotion de base des animaux. Afin de déterminer l'effet de l'éthanol sur la vitesse de locomotion des animaux et d'être en mesure de comparer ces effets à travers différents génotypes ou conditions, calculer une vitesse relative.

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Résultats

Les données représentatives (figure 1) de plusieurs génotypes différents et leurs contrôles appariés sont présentés ^8,24; données ont été spécifiquement choisis que les différences de mettre en évidence chez les animaux testés. Le degré d'effet à 10 min de l'exposition est considérée comme la sensibilité initiale d'une souche, qui est représentée sur les axes de gauche de la figure 1B-G. Les souches mutantes avec une vitesse relative plus gra...

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Discussion

La neurobiologie simple et des outils génétiques disponibles en C. elegans faire le ver un excellent modèle pour étudier les bases moléculaires des effets de l'éthanol sur le comportement. Ici, nous décrivons un test qui a été utilisé pour identifier plusieurs médiateurs moléculaires et environnementaux de la réponse comportementale aiguë en éthanol ^{8,10,20,24,25.} Cette méthode permet la différenciation et l'examen simultané des deux phénotypes de comportement de réponse d...

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matériels

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x 15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3 g/L), agar (17 g/L), peptone (2.5 g/L), 1 ml cholesterol (5 mg/ml in ethanol), 1 ml (1 M) MgSO4, 1 ml (1 M) CaCl2, 25 ml (1 M) KPO4, pH=6, 975 ml H2O
Forceps	Various		e.g., Fisher Scientific #10300
37 °C Incubator	Various		For drying agar
Digital balance	Various		For determining plate weights and agar volume
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.