Un test per misurare gli effetti di etanolo sulla velocità di Locomotion<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Riepilogo

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Abstract

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C. elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C. elegans.

Introduzione

Alcohol use disorders (AUD) are widespread and produce serious health, social, and economic problems. In humans, the susceptibility to developing an AUD is heavily influenced by both genetics and the environment^1,2. A strong physiological predictor of abuse liability is the initial level of response (LR) to alcohol (ethanol) that is exhibited by naïve drinkers^3-5. This LR phenotype is influenced by genetics and non-genetic components⁶. Determining the molecular mechanisms that influence the LR to ethanol is an important goal of the study of ethanol response behaviors.

The nematode, Caenorhabditis elegans, has been increasingly used as a model for studying the effects of ethanol on behavior^7-9. There is strong molecular conservation in the machinery of nervous system function between worms and mammals, and several genes that have been shown to influence the LR to ethanol in worms have been shown to influence LR to ethanol in mammals^10-16, and have been implicated in abuse liability in humans^17-19.

Ethanol intoxicates worms, which is reflected in a decrease in their locomotion speed. Several different laboratories have developed behavioral assays that differ in several ways, for example, the locomotion behavior that they study (crawling versus swimming^{11,12,14,20,21}) or in the composition of the solutions in which the assays are performed (nematode growth medium versus Dent’s saline^20,22). Interestingly, these diverse assays have yielded somewhat different dose response profiles for the effects of ethanol. These results have pointed to important differences in the underlying behaviors of crawling and swimming^9,23, as well as a role for the environmental variable osmolarity in ethanol responses²⁰, and have highlighted the importance of describing experimental detail of the various assays.

An assay to measure the acute effects of ethanol on crawling behavior is presented here. This assay has been used extensively to study the genetic and environmental influences on the LR to ethanol^{8,10,20,24,25}. The mammalian LR phenotype is a composite of at least two components, initial sensitivity to ethanol and acute functional tolerance to ethanol^26,27. In worms, the LR phenotype has been shown to be separable into these two components through the use of this behavioral assay. The influences of genetic and environmental manipulations on both phenotypes can be examined using this single assay. Importantly, these two phenotypes are genetically separable.

Protocollo

1. procedura per eseguire il giorno prima del test

1. Scegli L4 vermi stadio a fresco mezzo di crescita nematode (NGM) piastre seminate con un prato di OP50 E. coli, e la cultura a 20 CO / N. Ogni condizione test richiede 10 vermi; scegliere un eccesso di vermi per consentire O / N perdita di vermi.
   1. Animali solo test che sono gli adulti del primo giorno; molti mutanti crescono a una velocità più lenta di tipo selvaggio. Regolare i tempi di raccolta per i ceppi che hanno ritardi di sviluppo in modo che tutti gli animali testati sono adulti primo giorno.

2. procedura per eseguire il Giorno del saggio

1. Preparazione per il saggio:
   1. Effettuare test su 60 x 15 millimetri piastre non teste di serie standard di NGM. Asciugare tutti piatti da utilizzare a 37 ° C per 2 ore, con coperchio off. Per ogni prova sperimentale, utilizzare quattro piastre NGM secchi; questi saranno gli 0 e 400 mm piastre test etanolo e i loro piatti di acclimatazione di accompagnamento.
      NOTE:L'uso di piastre NGM è importante; differenze nella composizione delle piastre, in particolare la loro osmolarità, possono influenzare fortemente la risposta dose di etanolo sul comportamento, ciò è dovuto, almeno in parte, ai cambiamenti nella quantità di etanolo accumulata dagli animali ^20. NGM agar è di 160 mOsm.
   2. Dopo l'essiccazione, pesano ciascuna delle piastre NGM non teste di serie da utilizzare nel dosaggio e nota il peso. Determinare il volume del supporto nelle piastre base al peso di un piatto vuoto. Per approssimare la conversione del peso del agar a volume, si supponga che il supporto pesa la stessa di un uguale volume di acqua.
      NOTA: I nostri risultati più consistenti sono stati trovati con i media NGM che ha disidratati sufficientemente che un volume originale 10 ml ha un volume di post-essiccazione tra 8,3-8,9 ml. Un'alternativa al tempo secco 2 hr è asciugare le piastre fino a raggiungere questa gamma volume per tenere conto delle differenze in incubatrici.
   3. Sciogliere 4 anelli di rame (diametro interno di 1.6 cm) nella superficie di ciascuna delle piastre di agire come recinti per i diversi genotipi o gruppi di trattamento di worms.Grasp ogni anello con una pinza, e calore in una fiamma (forte fiamma di un becco Bunsen funziona bene) per circa 3 sec. Porre immediatamente l'anello su un piatto, mentre ancora in mano l'anello con le pinze per evitare che 'saltare'.
      1. Assicurarsi che l'anello poggia piatta contro la superficie del agar premendo leggermente con la pinza in diversi punti sull'anello. Quando si posiziona l'anello, attenzione a lasciare spazio per altri tre anelli.
      2. Sciogliere i tre anelli di rame aggiuntivi nella superficie della piastra, avendo cura di posizionare il più vicino possibile tra loro in modo che tutti e quattro sarà nel campo visivo della telecamera.
         NOTA: Fare una buona tenuta con l'agar è essenziale per mantenere i vermi negli anelli durante il dosaggio. Anelli che saltano intorno sul piatto è improbabile che rendere la tenuta corretta con l'agar epuò cicatrice l'agar, che permette vermi scavano e interferisce con la visualizzazione dei vermi.
      3. Per ogni piatto saggio preparare un piatto di accompagnamento "acclimatazione", che dovrebbe essere essiccata e testa di serie e riceverà nessun etanolo. Mettere quattro anelli di rame su queste tavole.
   4. Etichettare il fondo delle piastre adiacenti anello con il ceppo vite senza fine per essere utilizzato nell'anello, avendo cura di non scrivere nel campo visivo dell'anello stesso. Far corrispondere le etichette sulla piastra test con la piastra di acclimatazione di accompagnamento.
   5. Calcolare la quantità di etanolo al 100% da aggiungere a ciascuna piastra di test in modo che la concentrazione finale è 0 mM o etanolo mM 400 (peso a volume). Per ogni esperimento (n = 1), ci sarà un 0 mM ed una piastra 400 mM etanolo; piastre acclimatazione non ricevono etanolo. Aggiungere l'etanolo, pipettando intorno alla superficie della piastra. Utilizzare pellicola di laboratorio per sigillare la piastra e lasciarlo equilibrare sul banco per 2 ore.
   6. Trascorso 1,5 ore, iniziare la fase di acclimatazione del dosaggio, passo 2.2.
2. Eseguire test locomozione: lastre Assay
   1. Trasferire accuratamente 10 vermi di ogni gruppo sperimentale al centro di un anello di rame sulla piastra acclimatazione. Rimuovere qualsiasi alimento che è visibile sull'agar a questo punto raschiando delicatamente con il pick verme. Variare l'ordine in cui i gruppi sperimentali sono messi sulle piastre attraverso prove sperimentali in modo che gli stessi ceppi non vengono messi sulle piastre nello stesso ordine in tutti gli studi.
      NOTA: L'obiettivo è quello di trasferire gli animali alla piastra con quantità minime di cibo, perché se cibo sul piatto acclimatazione viene trasferito alla piastra di dosaggio i vermi aggregare attorno al cibo e l'effetto del farmaco sulla locomozione sarà oscurata.
   2. Fare attenzione a non rompere la superficie del agar con il plettro, in quanto questo permetterà ai vermi di tana e interromperà il dosaggio. Incubare i vermi a temperatura ambiente per 30 min.
   3. Assicurarsi che vi sia un intervallo adeguato tra le iniziazioni di ogni piatto. Uno sperimentatore esperto può muovere 40 animali, 10 / anello per 4 anelli in <1,5 min, ma qualunque intervallo fino a 2 minuti è accettabile. Il test standard è la registrazione di filmati a 10-12 min e 30-32 minuti di esposizione sia per 0 mm e 400 mm di etanolo.
   4. Avviare la piastra acclimatazione per l'esposizione 0 mm e la piastra di acclimatazione per l'esposizione 400 mm circa 2 min e 30 sec a parte per consentire il risparmio del primo filmato prima del secondo filmato deve iniziare.
   5. Dopo il periodo di acclimatazione di 30 min, trasferire i vermi dalle piastre acclimatazione alle piastre di saggio. Trasferire i vermi alle piastre di saggio (0 mM o etanolo 400 mM) nello stesso ordine in cui sono stati aggiunti alla piastra acclimatazione, tenere traccia del tempo tra i completamenti di ogni piastra. Sigillare la piastra con la pellicola di laboratorio per minimizzare la perdita di etanolo per evaporazione.
   6. USE un movimento scavare con un pick verme sottile taglio appiattito per raccogliere i vermi in cima alla scelta appiattito. Eseguire il trasferimento di vermi dalla piastra acclimatazione unseeded alla piastra dosaggio senza l'uso di batteri, che è comunemente usato nel trasferimento vermi quanto contribuisce a incollare il verme al ritiro.
      NOTA: La velocità alla quale gli animali vengono trasferiti in questo passaggio è molto importante perché le prime vermi sulla piastra saranno esposti ad etanolo più lungo degli ultimi vermi aggiunti alla piastra, e precedenti punti di tempo può mostrare alcuni effetti dipendenti dal tempo. Questa è la ragione principale per la quale i ceppi rotazione sono posti su una piastra prima attraverso repliche sperimentali.
3. Eseguire Locomotion Assay: riprese
   1. Utilizzare una combinazione microscopio / macchina che permette l'imaging simultaneo di tutti i quattro anelli nel campo visivo (42x42 mm ² circa quadrata), ad esempio un obiettivo microscopio 0.5x, 0.8x ingrandimento e una fotocamera con 2048x2048 7.481; m CCD pixel.
   2. Utilizzare illuminazione uniforme in tutto il campo di vista, che aiuta a riconoscimento di oggetti nella fase soglia di intensità (vedi sotto). A 3 "x3" retroilluminazione funziona bene.
   3. Immagine i vermi su una piastra di supporto posizionata rivolta verso l'alto (coperchio verso il basso), che genera contrasto che si perde quando si usa la retroilluminazione rispetto ad un microscopio tradizionale trasmessa sorgente luminosa.
   4. Preparare il software di analisi di immagine per catturare filmati time-lapse dei vermi in movimento. Impostare il software per catturare le immagini in scala di grigi a 12 bit ogni 1 sec, come 2-min (120 frame) del filmato. Per ridurre la dimensione del file di output, pur mantenendo la risoluzione dell'immagine sufficiente, utilizzare una modalità binning 2x2 per catturare immagini 1024x1024 pixel.
   5. Registrare i film. Iniziare la registrazione di un filmato 120-frame della prima piastra (0 etanolo mM) 10 min dopo gli ultimi vermi sono stati posti su quel piatto. Salvare il file del filmato.
   6. Registrare il secondo piatto (etanolo 400 mm). Ripetere questo processo perentrambi i piatti iniziano 30 minuti dopo le ultime vermi sono stati collocati sul primo piatto (0 etanolo mm) per catturare i 30-32 punti min di tempo per ogni esposizione.
      NOTA: Lasciare il tempo sufficiente per salvare i file di immagine dopo ogni sessione di acquisizione prima di iniziare la registrazione della targa accanto da analizzare.
   7. Per il futuro-proofing di film archiviati e permettere questi film di essere aperti e analizzati da altri programmi software di imaging open source di dominio pubblico, come ImageJ ^28, convertire una copia di ogni film a 8-bit 256 file TIFF in scala di grigi.
      NOTA: Il software di analisi delle immagini qui descritto utilizza un formato di file proprietario.
4. Analisi di filmati utilizzando software ImagePro.
   1. Una volta catturato, analizzare i filmati utilizzando Immagine-Pro Plus software o il suo equivalente.
      NOTA: Una varietà di altri software di monitoraggio oggetto è disponibile che è stato utilizzato per monitorare con successo molteplici C. elegans contemporaneamente ²⁹ e talesoftware potrebbe ragionevolmente sostituire quello descritto qui come le misure di identificazione degli oggetti si basano su principi simili. Il metodo descritto si riferisce alle versioni Immagine-Pro Plus software 6,0-6,3 e 7.0, le versioni più recenti di Immagine-Pro Plus software può avere piccole differenze.
   2. Analizzare i film in 2-min (120 frame) segmenti. Innanzitutto, applicare un filtro alle immagini per appiattire lo sfondo e migliorare il contrasto degli oggetti vermi. Selezionare il filtro come segue: Menu> Processo> Filtri> Miglioramento> appiattire: Parametri: background = scuro; Caratteristica Width = 20 Pix.
   3. Re-salvare i filmati dopo la fase di filtraggio, ma mantenere sempre il film originale nella sua forma non filtrato.
      1. Analizzare la locomozione di animali in ciascun anello separatamente con una regione circolare di interesse (ROI) che è posto e dimensionata per sovrapporsi con l'anello di rame. Identificare e seguire i vermi con il Menu> Misura> Traccia oggetti ... di comando; questo porta il monitoraggio Dfinestra Tabella ata. Il pulsante Opzioni di monitoraggio permette brani specifici da escludere e per limitare eventuali artefatti sperimentali.
   4. Nella scheda Auto Tracking, utilizzare i seguenti parametri: parametri di traccia: il limite di velocità (il raggio di ricerca) = 400 micron / telaio, limite di accelerazione = Auto, Lunghezza minima traccia totale = 400 micron, predominante tipo di movimento = caotico; Oggetti in parametri tracce: Lasciare tracce parziali = yes, lunghezza minima = 21 fotogrammi, Carrellata profondità previsione = 1 fotogramma.
   5. Per avviare il processo di monitoraggio, fare clic sul Trova tutte le canzoni automaticamente tasto di funzione per aprire la finestra di dialogo Count / opzioni di formato e la finestra di dialogo di monitoraggio. Selezionare l'opzione manuale per la Selezione campo di intensità nella finestra di dialogo Conte / dimensione, che fornisce l'importante passo soglia che utilizza l'intensità in scala di grigi del worm pixel per evidenziare un oggetto verme di analisi e di ignorare i precedenti più leggeri pixel.
      1. Regolare la sli soglia intensitàders (uno per impostare il limite superiore, uno per impostare il limite inferiore) per creare un intervallo compreso che mette in evidenza tutti gli oggetti scuri. Una gamma di 0-1,500 su una scala da 0-4,095 è un buon punto di partenza per la sintonizzazione fine.
      2. Applicare un filtro per escludere dimensioni oggetti che sono più grandi e più piccolo di un singolo oggetto senza fine, come l'anello di rame e detriti sulle piastre. Impostare due parametri di dimensione per fare questo che riguardano le dimensioni dei singoli vermi in una varietà di posizioni con la misura> Select Misure voce di menu nella finestra di dialogo Opzioni Count / Taglia. (Range Area: 28,000-120,000 micron ² e Fascia perimetrale: 600-2,500 micron).
      3. Se un ceppo mutante è significativamente più piccolo o più grande di altri animali sulla piastra da analizzare, ampliare la gamma delle impostazioni di filtro per il riconoscimento di oggetti per accogliere le diverse dimensioni dei ceppi prima di inseguimento animali così che le impostazioni non devono essere modificate mid-analisi.
   6. Completare il processo di monitoraggio facendo clic su Continua nella finestra di dialogo di monitoraggio. Confrontare visivamente le piste di uscita con il progresso di ogni verme nel film per assicurare che ogni worm è rappresentato meno che ci sia un motivo valido per escludere che in base alle impostazioni del filtro automatico. Eliminare manualmente brani che sono stati prodotti dalla presenza di oggetti confermati non vermi che hanno soddisfatto i criteri di filtro dimensioni.
   7. Utilizzare il software per calcolare la velocità di ogni verme tra ogni fotogramma (distanza percorsa per il baricentro di un oggetto per 1 sec tra i fotogrammi) e visualizza la velocità media per ogni traccia e la velocità media di tutte le tracce per la popolazione di vermi in anello di rame. Considerate questo media finale sia n = 1 in termini di prove sperimentali. Esportare i dati in un foglio di calcolo per analisi statistiche e l'archiviazione dei dati.
   8. Una volta che i dati sono stati registrati per il primo anello sulla piastra, spostare la ROI all'anello successivo eripetere il processo di monitoraggio, senza modificare alcun parametro.
   9. Calcola la velocità relativa di locomozione attraverso:
   10. Velocità relativa (%) = trattati (400 mm) Velocità / grezzo (0 mm) Velocità x 100.
       NOTA: diverse manipolazioni genetiche spesso alterano il tasso di locomozione basale di animali. Al fine di determinare l'effetto di etanolo sulla velocità locomozione degli animali e per poter confrontare questi effetti attraverso diversi genotipi o condizioni, calcolare una velocità relativa.

Risultati

Dati rappresentativi (Figura 1) da diversi genotipi differenti ed i loro controlli appaiati vengono presentati ^8,24; i dati sono stati appositamente scelti che le differenze evidenziano negli animali testati. Il grado di effetto a 10 minuti di esposizione è considerata la sensibilità iniziale di un ceppo, che è visualizzata sullo assi sinistra in Figura 1B-G. Ceppi mutanti con una velocità relativa più grande del controllo a 10 min sono considerati resistenti (Fi...

Discussione

La semplice neurobiologia e strumenti genetici disponibili in C. elegans rendere il worm un ottimo modello in cui studiare le basi molecolari degli effetti di etanolo sul comportamento. Qui, descriviamo un metodo che è stato utilizzato per individuare alcuni mediatori molecolari ed ambientali della risposta comportamentale acuta etanolo ^{8,10,20,24,25.} Questo metodo consente la differenziazione e l'esame simultaneo di due diversi fenotipi comportamento di risposta etanolo, sensibilità iniziale e...

Materiali

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3g/L), agar (17g/L), peptone (2.5g/L), 1 mL cholesterol (5mg/mL in ethanol), 1 mL (1M) MgSO4, 1 mL (1M) CaCl2, 25 mL (1M) KPO4, pH=6, 975 mL H2O
Forceps	Various		e.g. Fisher Scientific #10300
37°C Incubator	Various		For drying agar
Digital balance	Various		For determining plate weights and agar volume
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.