Un ensayo para medir los efectos del etanol sobre la velocidad de locomoción<em&gt; Caenorhabditis elegans</em

Resumen

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Resumen

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C. elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C. elegans.

Introducción

Alcohol use disorders (AUD) are widespread and produce serious health, social, and economic problems. In humans, the susceptibility to developing an AUD is heavily influenced by both genetics and the environment^1,2. A strong physiological predictor of abuse liability is the initial level of response (LR) to alcohol (ethanol) that is exhibited by naïve drinkers^3-5. This LR phenotype is influenced by genetics and non-genetic components⁶. Determining the molecular mechanisms that influence the LR to ethanol is an important goal of the study of ethanol response behaviors.

The nematode, Caenorhabditis elegans, has been increasingly used as a model for studying the effects of ethanol on behavior^7-9. There is strong molecular conservation in the machinery of nervous system function between worms and mammals, and several genes that have been shown to influence the LR to ethanol in worms have been shown to influence LR to ethanol in mammals^10-16, and have been implicated in abuse liability in humans^17-19.

Ethanol intoxicates worms, which is reflected in a decrease in their locomotion speed. Several different laboratories have developed behavioral assays that differ in several ways, for example, the locomotion behavior that they study (crawling versus swimming^{11,12,14,20,21}) or in the composition of the solutions in which the assays are performed (nematode growth medium versus Dent’s saline^20,22). Interestingly, these diverse assays have yielded somewhat different dose response profiles for the effects of ethanol. These results have pointed to important differences in the underlying behaviors of crawling and swimming^9,23, as well as a role for the environmental variable osmolarity in ethanol responses²⁰, and have highlighted the importance of describing experimental detail of the various assays.

An assay to measure the acute effects of ethanol on crawling behavior is presented here. This assay has been used extensively to study the genetic and environmental influences on the LR to ethanol^{8,10,20,24,25}. The mammalian LR phenotype is a composite of at least two components, initial sensitivity to ethanol and acute functional tolerance to ethanol^26,27. In worms, the LR phenotype has been shown to be separable into these two components through the use of this behavioral assay. The influences of genetic and environmental manipulations on both phenotypes can be examined using this single assay. Importantly, these two phenotypes are genetically separable.

Protocolo

1. Pasos para realizar en el día antes del ensayo

1. Recogida L4 etapa gusanos a medio de crecimiento fresco nematodo placas (NGM) sembradas con un césped de OP50 E. coli, y la cultura de ellos a 20 CO / N. Cada condición de ensayo requiere 10 gusanos; recoger un exceso de gusanos para permitir la O / N pérdida de gusanos.
   1. Sólo los animales de ensayo que son los adultos de primer día; muchos mutantes crecen a una velocidad más lenta que la de tipo salvaje. Ajuste el tiempo de la cosecha para las cepas que tienen retrasos en el desarrollo a fin de que todos los animales analizados adultos de primer día.

2. Los pasos para realizar en el día del ensayo

1. Preparación para el ensayo:
   1. Realizar ensayos de 60 x 15 mm placas no cabezas de serie estándar NGM. Seque todas las planchas que se utilizarán a 37 ° C durante 2 horas, con tapas de descanso. Para cada ensayo experimental, utilizar cuatro NGM placas secas; Estos serán los 0 mM y mM placas de ensayo de etanol 400 y sus placas de aclimatación de acompañamiento.
      NOTA:El uso de placas de NGM es importante en este caso; las diferencias en la composición de las placas, en particular, su osmolaridad, pueden afectar fuertemente la respuesta a la dosis de etanol en el comportamiento, esto es debido, al menos en parte, a los cambios en la cantidad de etanol acumulado por los animales ^20. Agar NGM es de 160 mOsm.
   2. Después del secado, pesa cada una de las placas de NGM cabezas de serie para ser utilizado en el ensayo y anotar el peso. Determinar el volumen de los medios en las placas basadas en el peso de una placa de vacío. Para aproximar la conversión de peso del agar al volumen, se supone que los medios de comunicación pesa lo mismo que un volumen igual de agua.
      NOTA: Nuestros resultados más consistentes se han encontrado con los medios NGM que ha deshidratado suficientemente que un volumen original ml 10 tiene un volumen de post-secado entre 8.3 a 8.9 ml. Una alternativa para el tiempo de secado 2 hr es secar hasta que las placas llegan a este rango de volumen para tener en cuenta las diferencias en las incubadoras.
   3. Derrita 4 anillos de cobre (diámetro interior de 1.6 cm) en la superficie de cada una de las placas para actuar como corrales para los diferentes genotipos o grupos de tratamiento de worms.Grasp cada anillo con fórceps, y el calor en una llama (una fuerte llama de un mechero Bunsen funciona bien) durante aproximadamente 3 seg. Inmediatamente coloque el anillo en un plato, mientras que mantiene el anillo con las pinzas para evitar que se 'salta'.
      1. Asegúrese de que el anillo descansa plana contra la superficie del agar presionando hacia abajo suavemente con las pinzas en varios puntos en el anillo. Al colocar el anillo, tenga cuidado de dejar espacio para un período adicional de tres anillos.
      2. Fundir los tres anillos adicionales de cobre en la superficie de la placa, teniendo cuidado de colocarlos lo más cerca posible, de manera que los cuatro estarán en el campo de visión de la cámara.
         NOTA: Hacer un buen sello con el agar es esencial para mantener los gusanos en los anillos durante el ensayo. Los anillos que se saltan alrededor en la placa son poco probable que el sello correcto con el agar ypuede dejar cicatrices en el agar, que permite a los gusanos de madriguera e interfiere con la visualización de los gusanos.
      3. Para cada placa de ensayo preparar un plato de acompañamiento "aclimatación", que debe ser seca y no cabeza de serie y no recibirán etanol. Coloque cuatro anillos de cobre en estas placas.
   4. Etiquetar el fondo de las placas junto a cada anillo con la cepa de gusano para ser utilizado en el anillo, teniendo cuidado de no escribir en el campo de visión del propio anillo. Coinciden con las etiquetas de la placa de ensayo con su placa de aclimatación acompaña.
   5. Calcular la cantidad de etanol 100% a añadir a cada placa de ensayo de manera que la concentración final es de 0 mM o 400 mM de etanol (peso a volumen). Para cada experimento (n = 1), habrá un 0 mM y una placa de etanol 400 mM; placas de aclimatación no reciben etanol. Añadir el etanol, el pipeteado de que alrededor de la superficie de la placa. Utilice película de laboratorio para sellar la placa y deje que se equilibre en la mesa de laboratorio durante 2 horas.
   6. Cuando ha transcurrido 1,5 horas, comenzar la etapa de aclimatación de ensayo, paso 2.2.
2. Realizar el ensayo de locomoción: Las placas de ensayo
   1. Transferir cuidadosamente 10 gusanos de cada grupo experimental al centro de un anillo de cobre en la placa de aclimatación. Retire cualquier alimento que es visible en el agar en este punto, raspando suavemente con la selección gusano. Variar el orden en que los grupos experimentales se ponen en los platos entre los ensayos experimentales de modo que las mismas cepas no se ponen en los platos en el mismo orden entre los ensayos.
      NOTA: El objetivo es transferir los animales a la placa con cantidades mínimas de alimentos, porque si comida en el plato de aclimatación se transfiere a la placa de ensayo de los gusanos se agregarán alrededor de la comida y el efecto de la droga sobre la locomoción será oscurecido.
   2. Tenga cuidado de no romper la superficie del agar con la selección, ya que esto permitirá que los gusanos madriguera y interrumpirá el ensayo. Incubar los gusanos a ta durante 30 min.
   3. Asegúrese de que hay un intervalo adecuado entre las iniciaciones de cada placa. Un experimentador experimentado puede mover 40 animales, 10 / anillo de 4 anillos en <1,5 min, pero cualquier intervalo de hasta 2 minutos es aceptable. El ensayo estándar tiene la grabación de películas en 10-12 minutos y 30-32 minutos de exposición para ambos 0 mM y etanol 400 mM.
   4. Iniciar la placa de aclimatación para la exposición 0 mM y la placa de aclimatación para la exposición 400 mM aproximadamente 2 minutos y 30 segundos de separación para permitir el ahorro del primer archivo de la película antes de que debe comenzar la segunda película.
   5. Después de que el período de aclimatación de 30 min, la transferencia de los gusanos de las placas de aclimatación a las placas de ensayo. La transferencia de los gusanos a las placas de ensayo (0 mm o etanol 400 mM) en el mismo orden en que se añadieron a la placa de aclimatación, el seguimiento de la sincronización entre las terminaciones de cada placa. Sellar la placa con película de laboratorio para minimizar la pérdida de etanol a la vaporización.
   6. Use un movimiento de pala con un pico gusano delgado filo aplanado para recoger gusanos en la parte superior del pico aplanado. Realizar la transferencia de los gusanos de la placa de la aclimatación no cabeza de serie a la placa de ensayo y sin el uso de bacterias, que se utiliza comúnmente en la transferencia de los gusanos, ya que ayuda a pegar el gusano a la selección.
      NOTA: La velocidad a la que los animales se transfieren en este paso es muy importante porque los primeros gusanos en la placa estarán expuestos a etanol más largo que los últimos gusanos añadieron a la placa, y los puntos de tiempo anteriores puede mostrar algunos efectos dependientes del tiempo. Esta es la principal razón para hacer girar las cepas se colocan en un plato de primera a través de repeticiones experimentales.
3. Realizar Locomotion Ensayo: El rodaje
   1. Use una combinación microscopio / cámara que permite la formación de imágenes simultánea de los cuatro anillos en el campo de visión (42x42 cuadrados aproximadamente ² mm), tal como un objetivo de microscopio 0,5x, 0,8x de aumento y una cámara con un 7,4 2048x204881; m CCD pixel.
   2. Utilice iluminación uniforme en todo el campo de visión, que ayuda en el reconocimiento de objetos en la etapa umbral de intensidad (véase más adelante). Una luz de fondo 3 "x3" funciona bien.
   3. Imagen de los gusanos en una placa colocada de lado los medios de comunicación hacia arriba (de la tapa hacia abajo), lo que genera el contraste que se pierde cuando se utiliza la luz de fondo en comparación con un microscopio tradicional fuente de luz.
   4. Preparar el software de análisis de imagen para capturar películas a intervalos de los gusanos en movimiento. Configure el software para capturar imágenes de 12 bits en escala de grises cada 1 seg, como a 2 min (120 marco) película. Para reducir el tamaño del archivo de salida, mientras que todavía conserva suficiente resolución de la imagen, usar un modo de binning 2x2 para capturar imágenes 1024x1024 píxeles.
   5. Grabe las películas. Comienza la grabación de una película 120-marco de la primera placa (etanol 0 mM) 10 min después de los últimos gusanos se colocaron en ese plato. Guarde el archivo de película.
   6. Registre la segunda placa (etanol 400 mM). Repita este proceso paraambas placas comenzando 30 minutos después de los últimos gusanos fueron colocados en la primera placa (etanol 0 mM) para capturar los puntos de tiempo de 30-32 min para cada exposición.
      NOTA: Deje tiempo suficiente para guardar los archivos de imagen después de cada sesión de captura antes de iniciar la grabación de la próxima placa para ser analizados.
   7. Para prueba de futuro de las películas archivados y permitir que estas películas sean abiertos y analizados por otros programas de software de imágenes de código abierto de dominio público, como ImageJ ^28, convertir una copia de cada película a 8 bits 256 archivos TIFF de escala de grises.
      NOTA: El software de análisis de imágenes se describe aquí utiliza un formato de archivo propietario.
4. Análisis de películas usando software ImagePro.
   1. Una vez capturados, analizar las películas usando Plus software Image-Pro o su equivalente.
      NOTA: una variedad de otros software de seguimiento de objeto está disponible que ha sido utilizado con éxito para rastrear múltiples C. elegans de una sola vez ²⁹ y talessoftware razonablemente podría sustituir a la descrita aquí como los pasos de identificación de objetos se basan en principios similares. El método descrito se refiere a las versiones de Image-Pro Plus software 6,0-6,3 y 7.0, las versiones más recientes del software de Image-Pro Plus puede tener pequeñas diferencias.
   2. Analizar películas en segmentos de 2 min (120 marco). En primer lugar, aplicar un filtro a las imágenes para aplanar el fondo y mejorar el contraste de los objetos de gusano. Seleccione el filtro de la siguiente manera: Menú> Proceso> Filtros> Accesorio> Acoplar: Parámetros: Antecedentes = oscuro; Característica Ancho = 20 Pix.
   3. Vuelva a guardar las películas después de la etapa de filtración, pero siempre conservará la película original en su forma sin filtrar.
      1. Analizar la locomoción de los animales en cada anillo por separado con una región circular de interés (ROI) que se coloca y dimensiona para solaparse con el anillo de cobre. Identificar y seguir a los gusanos con el Menú> Medida> Pista Objetos ... comando; esto nos lleva a la Tracking Dventana Tabla ata. El botón Opciones de seguimiento permite pistas específicas que deben excluirse y limitar los artefactos experimentales.
   4. En la ficha de seguimiento automático, utilice los siguientes parámetros: Parámetros de pista: límite de velocidad (el radio de búsqueda) = 400 m / marco, límite de aceleración = Auto, longitud total de pistas mínima = 400 m, tipo de movimiento predominante = caótica; Los objetos en parámetros pistas: Permitir pistas parciales = yes, longitud Min = 21 marcos, Seguimiento profundidad predicción = 1 marco.
   5. Para iniciar el proceso de seguimiento, haga clic en el Buscar sus temas de forma automática botón de función para abrir el / cuadro de diálogo Opciones en medidas Conde y el cuadro de diálogo de seguimiento. Seleccione la opción Manual para la Selección de rango de intensidad en el cuadro de diálogo Contador / tamaño, que proporciona el paso del umbral importante que utiliza la intensidad en escala de grises de los píxeles de gusano para resaltar un objeto gusano para el análisis y hacer caso omiso de los antecedentes más claros píxeles.
      1. Ajuste el sli umbral de intensidadDers (uno para establecer el límite superior, uno para establecer el límite inferior) para crear un rango inclusivo que resalta todos los objetos oscuros. Una gama de 0-1,500 en una escala de 0-4,095 es un buen punto de partida para la sintonía fina.
      2. Aplicar un filtro de tamaño para excluir los objetos que son más grandes y más pequeño que un solo objeto gusano, tales como el anillo de cobre y cualquier residuo en los platos. Establecer dos parámetros de tamaño para hacer esto que cubren tamaños de gusanos individuales en una variedad de posturas con la Medida> Seleccionar Mediciones elemento de menú en el cuadro de diálogo Opciones Conde / Tamaño. (Rango de Área: 28,000-120,000 m ² y la gama Perímetro: 600-2,500 micras).
      3. Si una cepa mutante es significativamente más pequeño o más grande que otros animales en la placa a analizar, ampliar la gama de los valores de filtro para el reconocimiento de objetos para dar cabida a los diferentes tamaños de las cepas primero antes de seguimiento de los animales para que los ajustes no necesitan ser cambiados mediados de análisis.
   6. Completar el proceso de seguimiento, haga clic en Continuar en el cuadro de diálogo de seguimiento. Comparar visualmente las pistas de salida con el progreso de cada gusano en la película para asegurar que cada gusano se representa a menos que haya una razón válida para excluir que en base a la configuración de filtros automáticos. Elimine manualmente las pistas que fueron producidos por la presencia de objetos que no son gusanos confirmado que cumplían con los criterios de filtrado de tamaño.
   7. Utilice el software para calcular la velocidad de cada gusano entre cada fotograma (distancia recorrida por el centro de gravedad de un objeto por 1 seg entre bastidores) y mostrar la velocidad promedio para cada pista y la velocidad promedio en todas las pistas para la población de gusanos en el anillo de cobre. Considere este promedio final sea n = 1 en términos de ensayos experimentales. Exportar los datos a una hoja de cálculo para el análisis estadístico y el archivado de datos.
   8. Una vez que los datos han sido registrados en el primer anillo en la placa, mueva el retorno de la inversión para el siguiente anillo yrepita el proceso de seguimiento, sin cambiar ninguno de los parámetros.
   9. Calcular la velocidad relativa de la locomoción a través de:
   10. Velocidad relativa (%) = tratado (400 mM) Velocidad / no tratada (0 mm) Velocidad x 100.
       NOTA: Las diferentes manipulaciones genéticas menudo alteran la tasa de locomoción basal de los animales. Con el fin de determinar el efecto del etanol sobre la velocidad de locomoción de los animales y para poder comparar estos efectos a través de diferentes genotipos o condiciones, calcular una velocidad relativa.

Resultados

Los datos representativos (Figura 1) de varios genotipos diferentes y sus controles emparejados se presentan ^8,24; datos fueron escogidos específicamente que las diferencias de relieve en los animales ensayados. El grado de efecto en 10 minutos de exposición se considera la sensibilidad inicial de una cepa, que se muestra en los ejes izquierda en la figura 1B-G. Las cepas mutantes con una velocidad relativa más grande que el control en 10 min se considera que son resistent...

Discusión

La neurobiología simple y herramientas genéticas disponibles en C. elegans hacer el gusano un excelente modelo en el que el estudio de las bases moleculares de los efectos del etanol sobre el comportamiento. Aquí se describe un ensayo que se ha utilizado para identificar varios mediadores moleculares y ambientales de la respuesta de comportamiento aguda a etanol ^{8,10,20,24,25.} Este método permite la diferenciación y el examen simultáneo de dos fenotipos comportamiento de respuesta etanol difere...

Materiales

Name	Company	Catalog Number	Comments
C. elegans strains	Caenorhabditis Genetics Center
60 x15 mm Petri plates, triple vented	Greiner Bio-One	628161	Other plate brands will suffice.
NGM agar	Various		NaCl (3g/L), agar (17g/L), peptone (2.5g/L), 1 mL cholesterol (5mg/mL in ethanol), 1 mL (1M) MgSO4, 1 mL (1M) CaCl2, 25 mL (1M) KPO4, pH=6, 975 mL H2O
Forceps	Various		e.g. Fisher Scientific #10300
37°C Incubator	Various		For drying agar
Digital balance	Various		For determining plate weights and agar volume
Copper rings	Plumbmaster	STK#35583 (48 cap thread gasket)	1.6 cm inner diameter, 1.8 cm outer diameter copper rings
100% ethanol	Various
Parafilm M	Bemis	PM996
CCD camera	QImaging	RET-4000R-F-M-12	This camera has a large field of view.
Stereomicroscope with C-mount and 0.5X objective	Leica	MZ6	Discontinued model, M60 is current equivalent.
Light source	Schott	A08923	3”x3”  backlight for even illumination across the field of view
Imaging and tracking software	Media Cybernetics	ImagePro-Plus v6.0-6.3	Newer versions of the software have tracking functions.